Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

במאמר זה אנו מתארים מערך פינצטה מגנטית במהירות גבוהה המבצע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח בקצב מרבי של 1.2 קילוהרץ. אנו מציגים את היישום שלה על סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE כמערכות מודל, אבל זה יהיה ישים גם על מולקולות אחרות המעורבות באירועים מכנוביולוגיים.

Abstract

פינצטה מגנטית של מולקולה בודדת (MTs) שימשה ככלי רב עוצמה לחקירה מאולצת של ביומולקולות, כגון חומצות גרעין וחלבונים, ולכן הן צפויות להיות שימושיות בתחום המכנוביולוגיה. מכיוון שהשיטה מסתמכת בדרך כלל על מעקב מבוסס תמונה של חרוזים מגנטיים, המהירות המותרת בהקלטה וניתוח של תמונות, כמו גם התנודות התרמיות של החרוזים, הקשו זה מכבר על יישומה בצפייה בשינויים מבניים קטנים ומהירים במולקולות המטרה. מאמר זה מתאר שיטות מפורטות לבנייה ותפעול של מערך MT ברזולוציה גבוהה שיכול לפתור דינמיקה ננומטרית, אלפית שנייה של ביומולקולות והקומפלקסים שלהן. כדוגמאות ליישום, מודגמים ניסויים עם סיכות ראש של DNA וקומפלקסים של SNARE (מכונות איחוי ממברנה), תוך התמקדות באופן שבו ניתן לזהות את המצבים והמעברים הארעיים שלהם בנוכחות כוחות בקנה מידה פיקוניוטון. אנו מצפים כי MTs במהירות גבוהה ימשיכו לאפשר מדידות ננומכניות בדיוק גבוה על מולקולות החשות, מעבירות ומייצרות כוחות בתאים, ובכך יעמיקו את ההבנה שלנו ברמה המולקולרית של מכנוביולוגיה.

Introduction

תאים חשים באופן פעיל ומגיבים לגירויים מכניים. בעשותן כך, ביומולקולות רבות מציגות תכונות תלויות כוח המאפשרות שינויים מבניים דינמיים. דוגמאות מוערכות כוללות תעלות יונים רגישות למכנו ואלמנטים ציטו-שלדיים המספקים לתאים מידע מכני חשוב מסביבתם.

בנוסף, מולקולות בעלות אופי ייחודי של נשיאת כוח יכולות להיחשב גם רגישות למכנו במובן רחב יותר. לדוגמה, היווצרות מקומית והתכה של דופלקסים של חומצות גרעין, כמו גם מבנים מסדר גבוה יותר כגון G-quadruplexes, ממלאים תפקידים מכריעים בשכפול, שעתוק, רקומבינציה, ולאחרונה, עריכת גנום. יתר על כן, כמה חלבונים עצביים המעורבים בתקשורת סינפטית לבצע את תפקידיהם על ידי יצירת כוחות פיזיים העולים על רמות של אינטראקציות בין-מולקולריות טיפוסיות. לא משנה איזו דוגמה חוקרים, חקירת ננומכניקה של הביומולקולות המעורבות בדיוק מרחבי-זמני גבוה תוכיח את עצמה כשימושית ביותר בחשיפת מנגנונים מולקולריים של התהליכים המכנוביולוגיים הקשורים 1,2,3.

שיטות ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת שימשו ככלים רבי עוצמה לבחינת התכונות המכניות של ביומולקולות 2,4,5,6. הם יכולים לעקוב אחר שינויים מבניים בחומצות גרעין ובחלבונים במקביל להפעלת כוח, ובכך לבחון תכונות תלויות כוח. שני מערכים ידועים הם פינצטה אופטית ופינצטה מגנטית (MTs), המשתמשים בחרוזים בגודל מיקרון כדי לתפעל מולקולות 5,6,7,8. בפלטפורמות אלה, פוליסטירן (עבור פינצטה אופטית) או חרוזים מגנטיים (עבור MTs) קשורים למולקולות מטרה (למשל, חומצות גרעין וחלבונים) באמצעות "ידיות" מולקולריות, העשויות בדרך כלל מקטעים קצרים של DNA דו-גדילי (dsDNA). לאחר מכן החרוזים מועברים כדי להפעיל כוח ומצולמים כדי לעקוב אחר מיקומם המדווח על שינויים מבניים במולקולות המטרה. פינצטה אופטית ומגנטית ניתנות במידה רבה להחלפה ביישומים שלהן, אך קיימים הבדלים חשובים בגישותיהן לשליטה בכוח. פינצטה אופטית היא במהותה מכשירי מהדק מיקום הלוכדים חרוזים במקומם, שבגללם הכוח המופעל משתנה כאשר מבנה מטרה עובר שינויי צורה; הארכה מוגברת, כגון מפתיחה, משחררת את הקשירה ומפחיתה מתח, ולהיפך. למרות שניתן ליישם משוב אקטיבי כדי לשלוט בכוח בפינצטה אופטית, MTs לעומת זאת פועלים באופן טבעי כמכשיר מהדק כוח, תוך ניצול כוחות מגנטיים יציבים בשדה רחוק על ידי מגנטים קבועים, שיכולים לעמוד גם בהפרעות סביבתיות.

למרות ההיסטוריה הארוכה והעיצוב הפשוט שלהם, MTs פיגרו אחרי פינצטה אופטית ביישומים שלהם למדידות דיוק גבוה, בעיקר בגלל אתגרים טכניים במעקב חרוזים מהיר. לאחרונה, עם זאת, מספר קבוצות הובילו במשותף שיפור רב-גוני של חומרה ותוכנה עבור מכשירי MT 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . בעבודה זו, אנו מציגים דוגמה של מערך כזה הפועל במהירות של 1.2 קילוהרץ ומתארים כיצד להשתמש בו לביצוע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח. כמערכות מודל, אנו משתמשים בסיכות ראש של DNA ובקומפלקסים של SNARE עצבי ובוחנים את השינויים המבניים המהירים שלהם במשטר הפיקוניוטון. סיכות ראש DNA מציגות מעברים פשוטים של שני מצבים בטווח כוח מוגדר היטב20,21, ולכן משמשות כמודלים צעצוע כדי לאמת את הביצועים של מערך פינצטה. כאשר חלבוני SNARE מתאספים לקומפלקס רגיש לכוח המניע היתוך ממברנה22, הם נחקרו בהרחבה גם על ידי ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת 14,23,24,25. מוצגות גישות סטנדרטיות לניתוח נתונים וחילוץ מידע שימושי על תרמודינמיקה וקינטיקה. אנו מקווים שמאמר זה יוכל להקל על אימוץ MTs מדויקים במחקרים מכנוביולוגיים ולהניע את הקוראים לחקור את מערכות העניין הרגישות לכוח שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל החומרים והציוד המתוארים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים. תוכנת LabVIEW להפעלת הגדרת MT במהירות גבוהה המתוארת להלן, כמו גם סקריפטים של MATLAB לניתוח נתונים לדוגמה, מופקדים ב- GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) וזמינים לציבור.

1. בניית מנגנון

הערה: העיקרון הכללי של בניית MT במהירות גבוהה דומה למערכות MT סטנדרטיות קונבנציונליות, למעט השימוש במצלמת מוליכים למחצה (CMOS) משלימה במהירות גבוהה ומקור אור קוהרנטי בעוצמה גבוהה (איור 1). עיין במקורות אחרים לקבלת תיאורים נוספים של מכשירי MT סטנדרטיים 5,26,27.

  1. הגדר מיקרוסקופ הפוך על שולחן אופטי נגד רטט. התקן מצלמת CMOS במהירות גבוהה ותופס פריימים.
  2. בניית שלב תרגום למניפולציה של מגנטים בתלת מימד. הרכיבו שלב ליניארי ממונע (>20 מ"מ נסיעה) אנכית על גבי שלב XY ידני.
    הערה: התנועה האנכית שולטת בכוח, ואילו שלב XY מיועד ליישור ידני של מגנטים לציר האופטי לצורך הבנייה הראשונית של ההתקנה.
  3. התקן מנוע צעד סיבובי ומערכת חגורה וגלגלת למגנטים מסתובבים.
    הערה: החגורה משדרת את התנועה הסיבובית בין מוט המנוע לבין מגנטים הנמצאים במרחק של כמה סנטימטרים זה מזה. סיבוב המגנטים הוא פנימי למניפולציה התרגומית.
  4. הרכיבו את המגנטים. השתמשו במחזיק אקריליק (שהוזמן מחברה יצרנית; ראו איור משלים S1) שיכול לאחסן בחוזקה שני מגנטים זהים במקביל, עם רווח מוגדר היטב של 1 מ"מ בין המגנטים (איור 1B). כדי לנצל את הכוח המרבי שניתן להשיג עם זוג מגנטים נתון, התאימו את המיקום האנכי של שלב התרגום כך שהמשטח התחתון של המגנטים יתיישר עם מישור הדגימה כאשר הוא מועבר למיקום הנמוך ביותר.
    הערה: עיין ב- Lipfert et al. לקבלת מידע נוסף על עיצוב המחזיק ותצורה של מגנטים28. הגובה והכיוון של מגנטים נשלטים על ידי תוכנת LabVIEW בשילוב עם איסוף נתונים.
  5. צפייה בעדשה אובייקטיבית בהגדלה נמוכה, יישרו את המגנטים למרכז שדה הראייה. בדקו שסיבוב המגנטים אינו גורם לתזוזה גדולה של מרכז זוג המגנטים.
    הערה: אם נקודת האמצע בין המגנטים מסתובבת סביב ציר הסיבוב, סביר להניח שהמגנטים אינם ממורכזים בגלל מחזיק לא מושלם. רמה קטנה של חוסר התאמה ביחס לגודל הפער היא נסבלת, מכיוון שסיבוב המגנט נועד רק לבדיקת קשירה והפעלת מומנטים ביישומים ספציפיים.
  6. התקן דיודה סופרלומינסנטית (SLD) להארת חרוזים. מעבירים את הקרן דרך רווח של 1 מ"מ בין שני המגנטים. יש לוודא שהקרן מחוברת כראוי כדי להתאים לרווח והתאורה אינה מוצללת על ידי המגנטים.
  7. התקן סורק עדשות piezo על האף והרכיב עדשה אובייקטיבית 100x טבילת שמן (צמצם מספרי [NA]: 1.45) למעקב אחר חרוזים. כדי למנוע ממצאים פוטנציאליים במעקב אחר תוצאות, ודא שהתאורה נשמרת באופן אחיד בעת הזזת המגנטים. לבסוף, התאם את רמת האור לבהירות המרבית מבלי להרוות פיקסלים.
    הערה: להשוואה בין מקורות אור שונים למעקב מהיר אחר חרוזים, עיין ב- Dulin et al.29.

2. כיול הכוח המגנטי

  1. באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR; ראו טבלה 1), הכינו מקטעי dsDNA של 5kbp (באמצעות Primer B, Primer Z_5k ו-λ-DNA) המסומנים בביוטין בקצה אחד (לחיבור פני השטח) ואזיד בקצה השני (לחיבור חרוזים).
  2. לאחר סעיף 6, הכינו תא זרימה עם מולקולות 5 kbp.
  3. לאחר סעיף 7, זהה מבנה קשירת חרוזים טוב על ידי אימות ההרחבה והסיבוב שלו. בפרט, הקפד לבחור חרוז עם מסלול סיבוב מינימלי (כלומר, עם רדיוס <200 ננומטר) כדי למזער את היסט גובה החרוז עקב חיבור לא ממורכז30,31. לאחר זיהוי קשירה טובה, התחל לעקוב אחר חרוזים, תוך התייחסות לסעיף 9.
  4. אם ההתקנה חדשה, אפיין את הרעש והיציבות שלה למדידות אמינות ברזולוציה גבוהה. מקמו את המגנט ~3 מ"מ מפני השטח של תא הזרימה (כדי להחיל >10 pN ולדכא את התנועה הבראונית של חרוז), עקבו אחר מיקום z של החרוז ב-1.2 קילוהרץ, וחשבו את סטיית אלן (AD) מסדרת הזמן קואורדינטות z 32,33 (איור 2C). בדקו כי ערכי אלצהיימר של ננומטרים בודדים ניתנים להשגה במשטר המהירות הגבוהה (<0.1 שניות), וכי מעקב דיפרנציאלי (מיקום חרוז מגנטי ביחס לחרוז ייחוס) מפחית את האלצהיימר בטווח הזמן הארוך יותר.
    הערה: בדרך כלל אנו מקבלים AD של <3 ננומטר בקצב המרבי (רזולוציה של 1.2 קילו-הרץ או 0.83 אלפיות השנייה), וה-AD ממשיך לרדת לפחות עד 10 שניות, מה שמרמז על סחף מינימלי. אחרים דיווחו על ערכים דומים בהגדרות דומות 9,10,11,12,34.
  5. עם מגנטים במצב מנוחה (F ~ 0 pN), רשום את קואורדינטות x ו - y של החרוז הקשור ב- 1.2 קילוהרץ. רשום את המיקום לתקופה ארוכה מספיק (כלומר, ארוכה מספיק מזמן ההרפיה האופייני של תנודות35) כך שהתנועה הבראונית נדגמת מספיק.
    הערה: כאן, כיוון ה-x הוא לאורך כיוון השדה המגנטי, ואילו התנועה ב-y מייצגת את התנועה הרוחבית בניצב לשדה.
  6. קרבו את המגנטים לתא הזרימה וחזרו על מדידות מיקום החרוזים עד שהמגנטים נוגעים בעדינות בחלק העליון של תא הזרימה. נעו בצעדים גדולים (למשל, 1-2 מ"מ) כאשר המגנטים נמצאים במרחק של יותר מ-7 מ"מ ממישור הדגימה (מאחר שהכוח המופעל גדל לאט בשדה הרחוק של מגנטים), אך צמצמו את גודל הצעד בהדרגה (למשל, 0.1-0.5 מ"מ) ככל שהם מתקרבים יותר לכיול עדין יותר ברמות כוח גבוהות יותר (איור 2B).
  7. חשב את הכוח בכל מיקום מגנט, d, באמצעות אחת משתי השיטות החלופיות (סקריפט MATLAB "force calibration.m" הכולל את שתי השיטות מסופק; ראה קובץ משלים 1).
    1. מדדו את השונות של קואורדינטות Equation 1 y של החרוז (איור 2D) ואת מיקום Equation 2 z הממוצע של החרוז ביחס למיקום הנמוך ביותר (איור 2B, למטה). לאחר מכן, השתמש במשוואה (1)7,27,36 כדי להעריך את הכוח (עם רדיוס חרוז קבוע R = 1,400 ננומטר ואנרגיה תרמית k RT = 4.11 pN∙nm):
      Equation 3(1)
    2. לחלופין, חשב את הצפיפות הספקטרלית של הספק (PSD) של קואורדינטות y, Sy (איור 2E). קבע את הכוח המופעל F על ידי התאמת מודל לורנציאני כפול37 ל- Sy הנמדד באמצעות משוואה (2).
      Equation 4(2)
      כאן, , R הוא רדיוס חרוזים, γ yו- γφ הם מקדמי הגרר התרגומי והסיבובי, בהתאמה (מוערך ממשוואת סטוקס-איינשטיין), kRT היא האנרגיה התרמית, Equation 5f+ ו- f- הם שני תדרים אופייניים המתקבלים באמצעות משוואה (3).
      Equation 6 (3)
      הערה: מכיוון שסיומת הקשירה L היא פונקציה של כוח העוקבת אחר מודל השרשרת דמוית התולעת (WLC) המבוסס היטב, הביטויים לעיל משאירים את F כפרמטר המתאים היחיד (אנו מתקנים את R להיות 1,400 ננומטר לשם הפשטות מכיוון שהוא משותף לכל רמות הכוח והערך המדויק אינו משפיע על התוצאות במידה ניכרת). במידת הצורך, טשטוש תנועה והחלקה מרכישת תמונה מבוססת מצלמה חייבים להיחשב38,39, אך השפעה זו זניחה במדידות המהירות הגבוהה שלנו מעל 1 kHz עם קשירה של 5 kbp.
  8. חזור על שלבים 2.4-2.7 לקבלת כמה מבנים נוספים. בדקו שלושה עד חמישה חרוזים שונים כדי לחשב את השתנות הכוח בין החרוזים המגנטיים.
    הערה: יש לשקול שינוי כוח בין החרוזים המגנטיים הנמצאים בשימוש כדי לקבוע את המספר הנכון של מבנים לממוצע. שונות זו קטנה אך יכולה להוביל לטעות של יותר מ-1 pN בכוח הנמדד, אפילו עבור מוצרים מסחריים31. עבור רוב היישומים, שבהם הקביעה המוחלטת של הכוחות המעורבים אינה חיונית, ממוצע תוצאות הכיול של שלושה עד חמישה חרוזים הוא בדרך כלל מספיק. גישה חלופית להסביר שונות זו היא למדוד את הכוח עם קשירה בודדת בתחילת הניסוי, אשר יכול לקחת זמן. אפשרות נוספת היא להטמיע מבני סיכות ראש שנפתחים ברמות כוח ידועות בכל מבנה31.
  9. התווה את הכוח הנמדד כפונקציה של מרחק מגנט והתאים פונקציה מעריכית כפולה לנתונים (איור 2F) באמצעות משוואה (4).
    Equation 7(4)
    כאן, F0 (קו בסיס), A 1 ו- A 2 (אמפליטודות), ו- d 1 ו- d2 (קבועי דעיכה) הם פרמטרים מתאימים. ודא שערכי הכוח משתי השיטות, כמו גם ההתאמות המעריכיות הכפולות הנובעות מכך, מסכימים במידה רבה (איור 2F,G).
    הערה: כדי לוודא שכיול הכוח מתבצע כראוי, ודא את יחסי הכוח-הארכה של המבנים הנבדקים על-ידי התוויית ההרחבה לעומת הכוח הנמדד.
  10. כדי לתקן את היסט גובה החרוז z off כתוצאה מהטיה תלוית כוח של החרוזים המגנטיים30,31, הערך z off מההיסט הצידי x off, בהתחשב בגיאומטריה של קשירה לא ממורכזת עם רדיוס חרוז באמצעות משוואה (5), והחל את הערכים על ערכי ההרחבה הנמדדים. שלב זה מיושם בסקריפט MATLAB "force calibration.m" (שורות 252-254).
    Equation 8(5)
    הערה: אף על פי שתיקון זה מבצע שינויים קטנים בהרחבה, במיוחד עבור חרוזים עם רדיוס סיבוב קטן (<200 ננומטר), היסט זה משפיע לעתים קרובות באופן קריטי על התגובה האלסטית, כפי שניתן לראות בשינוי מאיור 2H לאיור 2I 30,31.
  11. בדוק את אורך ההתמדה Lp על-ידי התאמת מודל WLC ניתן להרחבה לנתונים באמצעות משוואה (6).
    Equation 9(6)
    כאן, L 0 הוא אורך קווי המתאר (1.7 מיקרומטר עבור 5 kbp) ו- K0 הוא המודולוס למתיחה אנתלפית.
    הערה: למרות ש-L p של dsDNA מקובל היטב להיות 40-50 ננומטר במאגר טיפוסי כגון מלח חוצץ פוספט (PBS), נוסחת WLC המיושמת על מולקולות קצרות (<5 kbp) מעריכה באופן שיטתי את L p כמו L0 פוחת31,40. הסיבה לכך היא שמודל WLC הקלאסי מניח פולימר שאורך השרשרת שלו ארוך מספיק מאורך ההתמדה שלו. כאן, קיבלנו Lp = 40 ± 3 ננומטר עבור מבנה 5 kbp (איור 2H), ותיקון ההרחבה הניב K0 הומוגני של 1,100 ± 200 pN (איור 2I). החלת מודל WLC סופי 31,40, כמו גם תיקון לאי-גאוסיות בהתפלגות הרחבה 41, תגדיל מעט את Lp.
  12. לאחר אימות כיול הכוח, החל את פרמטרי ההתאמה המתקבלים של המודל המעריכי הכפול על תוכנת LabVIEW שסופקה (קובץ משלים 2) והמתן עד שהתוכנה תחשב את הכוח הנוכחי בזמן אמת מקריאות מוטוריות (כלומר, מיקום מגנט). מכיוון שביטוי אנליטי עבור הפונקציה ההופכית d(F) אינו זמין, הכינו טבלת בדיקת מידע של d לעומת F בשלבים של 0.1 pN לפי הערכה מספרית של רמות כוח היעד d. אחסן טבלה זו גם בתוכנה כדי לפקד על בקרת הכוח.

3. סינתזה של סיכות שיער DNA

הערה: מבנים של סיכות ראש של דנ"א עבור ניסויי MT מוכנים על-ידי הגברה PCR של אזור של 510 bp ב-λ-DNA עם שני פריימרים מותאמים אישית, שאחד מהם מכיל מבנה סיכת ראש בקצה 5′ שלו (איור 3A). בדרך זו, מוטיב סיכת ראש ממוקם בקצה אחד של מוצר PCR.

  1. מכינים את הפריימרים.
    1. פריימר קדמי: פריימר B_hp שמסומן ב-5′-ביוטין לחיבור משטח זכוכית ונקשר ל-λ-DNA. פריימר זה מכיל מוטיב סיכת ראש עם גבעול 8 bp ולולאה 6 nt, 5′ לאזור קשירת λ.
    2. פריימר הפוך: פריימר Z_hp המסומן בתווית 5′-אזיד לחיבור חרוזים מגנטיים ונקשר ל-λ-DNA במרחק של 1 kbp מהפריימר הקדמי.
  2. הגדר והפעל את ה- PCR עם λ-DNA (תבנית), nTaq פולימראז ותנאי PCR סטנדרטיים (ראה טבלה 1). נקו את המוצר עם ערכת טיהור מסחרית.
  3. למדוד את ריכוז הדנ"א על ידי ספיגת UV ב 260 ננומטר (A260) ולבצע אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (2% ג'ל) (ראה טבלה 2) כדי לאמת את גודל המוצר. תפוקה אופיינית היא ~ 35 μL של ~ 600 ננומטר פתרון.

4. הכנת חלבוני SNARE

הערה: קומפלקסים עצביים של SNARE מורכבים על-ידי שילוב של שלושה חלבוני חולדה מטוהרים המבוטאים מ-E. coli: VAMP2/synaptobrevin-2, syntaxin-1A ו-SNAP-25 (איור 3B). כדי להקל על הרכבתם, תחביר ו-SNAP-25 מבוטאים יחד עם מקטע VAMP2 (חסר את אזור N-terminal; המכונה "ΔN-VAMP2") למבנה הנקרא "קומפלקס ΔN", ולאחר מכן מעורבבים עם VAMP2 באורך מלא לאחר חיבור DNA לטיפול ליצירת קומפלקסים מלאים.

  1. הכינו פלסמידים המכילים cDNA לביטוי חלבוני SNARE (רצפי DNA לכל הפלסמידים ניתנים בטבלת החומרים).
    1. הכינו VAMP2 6×His-tagged חסר את תחום הטרנסממברנה (2-97; L32C/I97C עבור קישורים דיסולפידים) משוכפל לתוך וקטור pET28a.
    2. הכינו תחביר-1A חסר את תחום Habc ואת תחום הטרנסממברנה (191-267, I202C/I266C החלפות לקישורים דיסולפידים) המשוכפלים יחד עם 6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49-96) לווקטור pETDuet-1.
    3. הכינו את האיזופורם b באורך מלא מסוג SNAP-25 (2-206, כל C עד A) המשוכפל לווקטור pET28a. זה ישמש להכנת מתחמי ΔN.
    4. הכינו את האיזופורם b באורך מלא SNAP-25 באורך מלא באורך ×6 (1-206, כל C עד A) המשוכפל לווקטור pET28a להוספה ישירה למאגר בדיקת MT כדי להרכיב מחדש את מתחמי SNARE לאחר הפתיחה.
  2. הכינו שתי שפופרות של תאי E. coli של רוזטה (DE3). המר קבוצה אחת עם פלסמידים VAMP2 (משלב 4.1.1), קבוצה אחת עם תחביר-1A/ΔN-VAMP2 ופלסמידים SNAP-25 לא מתויגים (משלבים 4.1.2 ו-4.1.3) לביטוי קומפלקס ΔN, והשנייה עם פלסמידים SNAP-25 המתויגים שלו (משלב 4.1.4).
  3. העבירו את התאים שעברו טרנספורמציה למרק לוריא-ברטאני (LB) עם אנטיביוטיקה מתאימה (כאן, קנמיצין וכלוראמפניקול עבור VAMP2 ו-His-tagged SNAP-25; קנמיצין, כלוראמפניקול ואמפיצילין עבור קומפלקס ΔN). מגדלים אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד (220 סל"ד) עד שהצפיפות האופטית (OD) של המרק מגיעה ל-0.7-0.9.
  4. הוסף 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) כדי לגרום ביטוי חלבון לדגור את התאים במשך 3-4 שעות ב 37 ° C באינקובטור רועד (220 סל"ד).
  5. גלולה למטה את התאים על ידי צנטריפוגה התרבית ב 4,500 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  6. הכינו מאגרים לטיהור חלבונים (ראו טבלה 2).
  7. יש להשהות כדורי תאים המבטאים SNARE ב-40 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח וליז את התאים על ידי סוניקציה על קרח (15% משרעת, 5 שניות דולקות ו-5 שניות, 30 דקות בסך הכל).
  8. צנטריפוגה את הליזט ב-15,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C כדי להסיר חומרים בלתי מסיסים.
  9. מעבירים את הסופרנאטנט דרך עמוד כבידה מלא ב-1 מ"ל של שרף ני-נת"ע. לשטוף את השרף עם לשטוף חיץ A, ולאחר מכן עם חיץ לשטוף B, ואת delute החלבונים עם 10 מ"ל של חיץ elution.
  10. הסר tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ו imidazole מן eluent באמצעות עמודת התפלה (בצע את הוראות היצרן). יש להצדיע לדגימה באמצעות PBS.
  11. רכז את החלבונים עם מסננים צנטריפוגליים (חיתוך של 10 kDa ) ל~ 70 מיקרומטר תוך שמירה על החלבונים ב- PBS (בדרך כלל מניב 2 מ"ל). מדוד את ריכוז החלבון על ידי ספיגה אולטרה סגולה (UV) ב 280 ננומטר (A280) או על ידי מבחן ברדפורד.
  12. הכינו אליציטוטים קטנים, הקפיאו במהירות הבזק בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
    הערה: קומפלקסים מלאים של SNARE יורכבו לאחר הצמדת קומפלקס ΔN על ידית DNA (ראה להלן).

5. חיבור של ידיות DNA

הערה: שתי ידיות dsDNA של 510 bp המכילות קבוצות אמין ראשוניות בקצה אחד מוכנות תחילה על ידי PCR, ולאחר מכן קבוצות האמין מומרות לקבוצות מלימיד באמצעות crosslinker דו-תפקודי, SM(PEG)2. שתי הידיות מקושרות באופן קוולנטי לקומפלקסים של SNARE באמצעות קבוצות הציסטאין שלהן לצורך צימוד ספציפי לאתר (איור 3B).

  1. הכינו פריימרים.
    1. הכינו פריימרים קדמיים: פריימר B (להגברת ידית B) המסומן 5′-ביוטין לחיבור משטח זכוכית ונקשר ל-λ-DNA; פריימר Z (להגברת ידית Z) המסומן 5′-אזיד לחיבור חרוזים מגנטיים ובעל רצף זהה לפריימר B.
    2. הכינו פריימר הפוך: פריימר N (משותף לידית B ולידית Z) המסומן בתווית 5′-אמין להצמדת חלבונים ונקשר ל-λ-DNA במרחק של 510 bp מהפריימר הקדמי.
  2. הגדר והפעל שתי קבוצות של תגובות PCR (18 צינורות של תגובת 200 μL לכל ידית) עם λ-DNA (תבנית), nTaq פולימראז ותנאי PCR סטנדרטיים (ראה טבלה 1). נקו את המוצר עם ערכת ניקוי PCR ועטפו כל ידית ב-45 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. השתמש בנפח מינימלי של מים כדי להשיג ריכוזים גבוהים של ידיות לתגובה יעילה בשלבים מאוחרים יותר.
  3. מדדו את ריכוז הדנ"א ב-A260. התפוקה האופיינית היא ~ 650 μL של ~ 2 מיקרומטר תמיסה עבור כל ידית. יש לשמור דגימות קטנות בנפרד לצורך אימות מאוחר יותר באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
  4. הגב כל ידית (1 מיקרומטר ב-PBS) עם 5 mm sm(peg)2. דוגרים בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין. לאחר שעה אחת, השתמש בערכת טיהור DNA כדי להסיר SM(PEG)2 שלא מגיב. הצביעו על כל ידית עם 250 μL של PBS כדי לקבל ~2 מיקרומטר תמיסות.
  5. ערבבו את התמיסות של קומפלקס ידית B ו-ΔN ביחס מולארי של 1:16 (למשל, 1 מיקרומטר ידית B ו-16 מיקרומטר ΔN קומפלקס) ב-PBS ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה. יש להפריד דגימה קטנה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
  6. הוסף תמיסה של VAMP2 בעודף טוחנת פי 2.5 מעל קומפלקס ΔN ששימש בשלב הקודם. דוגרים על התערובת עוד שעה בטמפרטורת החדר עם תסיסה. מתחמי SNARE מלאים מורכבים בשלב זה.
  7. הסר חלבונים חופשיים על ידי החלפת חיץ עם PBS טרי ומסנן צנטריפוגלי (חיתוך של 100 kDa ): צנטריפוגה ב 14,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, חזור על לפחות 6x, ולרוץ במשך 15 דקות עבור הסחרור האחרון. מדוד את הגידול ביחס A260/A280 כדי לפקח על הסרת חלבונים חופשיים. יש להפריד דגימה קטנה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
  8. הוסף את ידית Z לתמיסה בעודף טוחנת של פי 15 מעל ידית B. שמור על ריכוז ידית Z לפחות מעל 1 מיקרומטר כדי להקל על התגובה. לדגור על התערובת במשך הלילה ב 4 °C עם תסיסה.
  9. אמת את חומרי הביניים (ידית B והצמדות החלבונים שלה) ואת המוצר הסופי (קומפלקס SNARE עם שתי ידיות) באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (איור 3B, inset) (ראה טבלה 2).
    הערה: אם החלבונים מחוברים בהצלחה לידית ב', יזוהה שינוי תנועתי. בפרט, היווצרות קומפלקסים מלאים של SNARE על ידיות דנ"א יכולה להיות מאושרת על ידי עמידותם לנתרן דודציל סולפט (SDS), בניגוד לקומפלקסים של ΔN, שמפורקים ב-SDS ומשאירים רק תחביר קשור לדנ"א (השוו בין b ו-c באיור 3B).
  10. הכינו אליציטוטים קטנים, הקפיאו במהירות הבזק בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
    הערה: למרות שהפתרון הסופי מכיל ידיות לא מגיבות, רק המבנה הרצוי המסומן פעמיים עם ביוטין ואזיד ייבחר במהלך הרכבת הדגימה בתא זרימה.

6. ייצור תאי זרימה

הערה: תאי זרימה למדידות MT בנויים משני כיסויי זכוכית המחוברים זה לזה באמצעות סרט דו-צדדי (איור 3C). כיסוי אחד מצופה בתערובת של PEG ופוליאתילן גליקול ביוטינילציה (PEG) כדי למנוע קשירה לא ספציפית ולאפשר קשירה ספציפית של מולקולות מטרה באמצעות קישור ביוטין-נויטראבידין (איור 3D). לאחר מכן, התמיסות של חומרים עבור ניסויי MT מוחדרות ברצף לתוך תא זרימה באמצעות משאבת מזרק (איור 3C,D).

  1. הכינו שני כיסויי זכוכית, אחד כל אחד למשטח העליון (24 מ"מ × 50 מ"מ, עובי מס' 1.5) והתחתון (24 מ"מ × 60 מ"מ, עובי מס' 1.5). נקו את הכיסויים על ידי סוניקציה ב-1 M KOH למשך 30 דקות. לאחר הסוניקציה, שטפו את הכיסויים במים מזוקקים ושמרו במים עד לשלב הבא.
  2. PEGylate את תלוש הכריכה התחתונה בעקבות פרוטוקולים שפורסמו42,43. השתמש N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine עבור silanization ותערובת 1:100 (ww) של ביוטין-PEG-SVA ו- mPEG-SVA במאגר ביקרבונט 100 mM. שמרו את הכיסויים PEGylated יבשים בטמפרטורה של -20°C ואחסנו אותם למשך מספר שבועות.
  3. ביום הניסויים, הוציאו את כיסויי ה-PEGylated וייבשו אותם באקדח חנקן. בדקו ויזואלית אם יש לכלוך כדי לוודא שהם נקיים.
  4. כדי ליצור את תעלות הדגימה, הכינו רצועות ברוחב ~2 מ"מ של סרט דו-צדדי והניחו ארבע רצועות על משטח כיסוי תחתון (משטח PEGylated למעלה), במקביל ומופרדות זו מזו על ידי ~5 מ"מ (איור 3C).
    הערה: בדרך זו, ניתן ליצור שלושה ערוצי דגימה ברוחב 5 מ"מ בתא זרימה יחיד.
  5. הניחו את החלקת הכיסוי העליונה במרכז הכיסוי התחתון, והותירו ~ 5 מ"מ של מקום בקצוות הקצרים עבור פתחי ערוצים ושקעים. לחץ בעדינות על החלק האחורי של הכיסוי העליון עם פינצטה כדי לאטום היטב את התעלות.
  6. כדי ליצור מאגר כניסה, קצצו את הקצה של קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. חותכים ~ 10 מ"מ מהפתח הרחב יותר כדי לאפשר אחיזה ~ 200 μL של תמיסה. הכינו שלושה מהם לשלושת ערוצי הזרימה. כדי להגדיר את השקעים, הכינו שלוש מחטי מזרק שמתאימות לצינור עבור משאבת המזרק.
  7. באמצעות אפוקסי של 5 דקות, מדביקים את המאגרים ורכזות המחטים לתא הזרימה. ודאו שנוצר איטום מלא למניעת דליפה, ושהתעלות אינן חסומות בדבק עודף. תן לו להתייבש לפחות 30 דקות.

7. הרכבה של מבני קשירת חרוזים

הערה: התמיסות של חומרים לניסויי MT, כולל אלה של מבני קשירת חרוזים, מוחדרות ברצף לתאי זרימה באמצעות משאבת מזרק (איור 3C,D).

  1. הכינו חרוזים מגנטיים. קח 5 מ"ג של חרוזי אפוקסי M270 מתמיסת מלאי (~ 3.3 × 108 חרוזים ב 167.5 מיקרוליטר של דימתילפורממיד) והחלף את הממס בחיץ פוספט (ראה טבלה 2) על ידי הפרדה מגנטית של החרוזים.
  2. הכינו את החרוזים ב~1.1 × 109 חרוזים מ"ל−1 בחיץ פוספט עם 1 M אמוניום סולפט והגיבו אותם עם 2 mM dibenzocyclooctyne (DBCO)-NH2. דוגרים על התערובת במשך 3 שעות על מיקסר מסתובב בטמפרטורת החדר. לאחר התגובה, שטפו את החרוזים 3x עם חיץ פוספט טרי כדי להסיר מולקולות שלא הגיבו.
    הערה: ניתן לאחסן את החרוזים השטופים ללא סיבוב נוסף בטמפרטורה של 4°C למשך מספר שבועות לפני השימוש.
  3. חבר מחט ביציאת תעלת תא הזרימה למשאבת המזרק באמצעות צינורות פוליאתילן. אזנו את הערוצים עם PBS.
  4. הכניסו את הפתרונות הבאים ברצף לתעלה על ידי שאיבה עם המשאבה: נויטראבידין, מבני מטרה (סיכות ראש DNA או קומפלקסים SNARE עם ידיות DNA), חרוזי פוליסטירן ייחוס וחרוזים מגנטיים מצופים DBCO. לפני השימוש, מערבלים היטב את תמיסות החרוזים כדי לפזר אגרגטים פוטנציאליים של חרוזים.
  5. שטפו חרוזים לא קשורים תוך הפעלת 0.1 pN של כוח.
    הערה: הפעלת כוח קטן כלפי מעלה מקלה על הסרת חרוזים לא קשורים ומסייעת למנוע קרע של מבנים קשורים במיוחד של קשירת חרוזים.
  6. עבור ניסויים עם מתחמי SNARE, כלול 1.5 מיקרומטר SNAP-25 במאגר הסופי.
    הערה: מולקולות SNAP-25 החופשיות יכולות לקשור מחדש קומפלקסים של SNARE לאחר הפתיחה ולאפשר מדידות חוזרות ונשנות על קומפלקס יחיד.

8. זיהוי מבני מטרה

  1. על פני השטח של תעלת תאי זרימה, חפשו את החרוזים המגנטיים הקשורים על ידי מולקולות בודדות של מבנה המטרה. ודא שחרוז הפניה נמצא בקרבת מקום.
  2. סובבו חרוז מועמד ובדקו שהוא מסתובב בחופשיות. אם החרוז קשור במספר מולקולות, הוא מפגין תנועה מוגבלת.
  3. סובב את החרוז במשך כמה סיבובים שלמים וגלה את רדיוס הסיבוב (פונקציה זו מיושמת בתוכנה שסופקה). רצוי, לבחור חרוז עם רדיוס סיבוב קטן.
    הערה: רדיוס זה מציין עד כמה החרוז מנותק מציר הקשירה, אשר נקבע באופן אקראי במהלך מכלול קשירת החרוזים30,31. בכל הניסויים, מרכוז מינימלי של חרוז מקל על ממצאים רבים הקשורים ליחס ההארכה הגבוה של רדיוס החרוז לקשירה שבו אנו משתמשים.
  4. הגדל את הכוח מ- 0 ל- 5 pN כדי לזהות חרוזים קשורים יחידים טובים. חפש שינוי גדול בתבנית העקיפה של חרוז כתוצאה מתיחה של קשירה של 1 kbp (או שתי ידיות מקבילות של 510 bp). אם דפוס העקיפה אינו משתנה באופן משמעותי, הנמיכו את הכוח לאפס וסרקו חרוז מועמד אחר.
    הערה: ניתן להבחין בקלות בהרמת ~300 ננומטר של חרוז מהתמונות הגולמיות מבלי להתחיל את תהליך המעקב בפועל.

9. מעקב חרוזים למדידות הרחבה

הערה: מעקב אחר חרוזים מתבצע על ידי ניתוח תמונות חרוזים בזמן אמת בתוכנת LabVIEW המצורפת למאמר זה. שיטת המעקב וגרסאותיה שימשו ברוב מערכות MT הקונבנציונליות ומוסברות בספרות קודמת 2,5,7,26. על ידי מדידת מיקומו של חרוז מגנטי ביחס לחרוז ייחוס קבוע (כלומר, מעקב דיפרנציאלי), מדידות המיקום הופכות חסינות ביותר להפרעה חיצונית.

  1. לאחר איתור חרוז מגנטי תקין יחד עם חרוז ייחוס, לחצו על כפתור הכיול כדי להתחיל להתכונן למעקב אחר חרוזים.
  2. לחץ על החרוזים בתמונה כדי להגדיר את מיקומי החרוזים. לאחר מכן התמונות ייחתכו לאזורי עניין (ROIs) (לדוגמה, 150 x 150 פיקסלים עבור חרוז של 3 מיקרומטר) סביב החרוזים ולאחר מכן ינותחו עוד יותר כדי לחלץ את קואורדינטות החרוזים המדויקות.
  3. המתן להשלמת סיבוב המגנט. תהליך זה מתעד את קואורדינטות x ו- y של החרוז (על ידי חישוב מתאם צולב דו-ממדי44 או באמצעות סימטריה רדיאלית45 של תמונות החרוז, עם ביצועים דומים) תוך סיבוב המגנטים כדי לתעד את החיבור הלא ממורכז של החרוז31.
  4. למעקב בכיוון z, המתן עד שהתוכנה תיצור טבלת חיפוש של תמונות עקיפה של החרוזים במרחקים שונים ממישור המוקד. זה מתבצע על ידי דריכת עדשת האובייקט עם סורק piezo בצעדים שווים ורישום תמונות חרוזים ממוצעים תנודתיות בכל מיקום. לאחר מכן, קואורדינטות z של החרוזים בניסויים אמיתיים נקבעות על ידי השוואת תמונות החרוזים בזמן אמת לטבלת החיפוש עם אינטרפולציה7.
  5. בסיום יצירת טבלת בדיקת המידע, הפעל מעקב ומיקוד אוטומטי (לחץ על Track ? and AF? כפתורים) ולחץ על לרכוש כפתור כדי להתחיל להקליט מיקומי חרוזים.
    הערה: מיקוד אוטומטי הוא אופציונלי אך מומלץ לתקן את סטיית השלב ב - z במהלך הרכישה.

10. כפה תוכניות יישום

  1. ניסויי כבש כוח: כדי לאמת את יחסי הכוח-הארכה של המבנה, הפעילו כבש כוח למעלה ולמטה בקצב העמסה קבוע (± 1.0 pN s−1) (איור 4A). לדוגמה, החל שלושה סבבים של מחזור pN של 0-20-0 כדי לאמת את האורך הכולל של המבנה ואת עקומת הארכת הכוח של נקודות האחיזה.
  2. על ידי ציון פרמטרי הקשירה בתוכנה, שכבו עקומת הארכת כוח WLC על גבי הנתונים הנמדדים, וקבעו אם חרוז המטרה קשור על ידי מבנה דגימה אמיתי עם ידיות DNA מתאימות. השתמש באורך קווי המתאר הידוע (למשל, ~ 340 ננומטר עבור 1 kbp dsDNA) ובאורך התמדה WLC (30-45 ננומטר עבור dsDNA31 קצר) של המבנה כנקודת התחלה. החל את שיטת תיקון ההרחבה המתוארת בשלב 2.11 במידת הצורך.
  3. אם המבנה מאומת, בחן בפירוט את תגובת הארכת הכוח כדי לחפש הרחבה נוספת הנובעת ממולקולות המטרה - סיכות שיער או קומפלקסים של SNARE.
  4. ניסויי כוח קבוע: שנו בהדרגה את הכוח המופעל בצעדים בדידים כדי לבחון את רגישות הכוח של מולקולות המטרה (איור 4B).
    הערה: MTs מאפשרים ניסויים פשוטים ויעילים בכוח קבוע מכיוון שהכוח המופעל נשמר קבוע כאשר המגנטים מוחזקים במקום.
    1. עבור סיכות שיער DNA, יש להפעיל 4-8 pN של כוח עם צעדים של 0.2-0.5 pN, ולמדוד את מיקום החרוז עבור ~ 10 שניות בכל רמת כוח.
    2. עבור מתחמי SNARE, החל 14-16 pN של כוח עם צעדים 0.1-0.2 pN, ולמדוד את מיקום החרוז עבור ~ 10 s בכל רמת כוח.
  5. ניסויי קפיצת כוח: שימו לב לאירועי המעבר של מתחמי SNARE.
    הערה: ניסויים בקפיצת כוח, כמו ניסויים בכוח קבוע, כרוכים בשינויים ברמות הכוח. עם זאת, קפיצות כוח משתמשות בשינויים פתאומיים יותר בכוח המופעל, ומאפשרות ניטור של אירועים המופעלים על ידי כוח במולקולות הנחקרות, כגון קרע פתאומי של קומפלקסים חלבוניים. לדוגמה, מאחר שקומפלקסים של SNARE מפגינים היסטרזה מבנית במחזורכוח 23, זה אינפורמטיבי לבצע ניסויים בקפיצת כוח ולמדוד את ההשהיה למעבר (איור 4C).
    1. פתיחת רוכסן: קילוף מולקולת VAMP2 מקומפלקס SNARE טרינרי שלם, ומותיר קומפלקס בינארי של תחביר-1A ו-SNAP-25.
    2. רוכסן: רוכסן של מולקולת VAMP2 ללא רוכסן כדי ליצור קומפלקס SNARE שלם.
      1. מתגלגל: פירוק מלא של קומפלקס SNARE מלווה בדיסוציאציה מוחלטת של SNAP-25. רק מולקולות VAMP2 ותחביר נשארות במבנה לאחר ההתפתחות.
      2. קיפול מחדש: התחדשות של קומפלקס SNARE עם קשירה של מולקולת SNAP-25 חופשית מהחיץ.
  6. ב 2 pN, לגרום להרכבה של קומפלקס SNARE שלם על ידי המתנה (~ 30 שניות) עבור שיוך של מולקולת SNAP25 חופשית. ירידה פתאומית בהרחבה נצפתה עם היווצרות קומפלקס SNARE.
  7. כדי לצפות באירועי פתיחת רוכסן, המתן מספר שניות ב- 10-12 pN, ולאחר מכן עבור ל- 14-15 pN בפתאומיות עם מהירות המנוע המרבית האפשרית. בהתאם לכוח המטרה, קומפלקס SNARE יציג מעבר הפיך בין מתווכים לא מכווצים חלקית (כמו בניסויי כוח קבוע) או קפיצה ~25 ננומטר למצב גבוה יותר, ללא רוכסן לאחר זמן המתנה אקראי (או השהיה).
  8. כדי לצפות באירועי רוכסן, הנמיכו את הכוח ל 10-12 pN מיד לאחר פתיחת הרוכסן. שוב, קומפלקס SNARE מציג מעבר סטוכסטי למצב התחתון עם הרוכסן לאחר השהיה אקראית כלשהי. אם הפתיחה התרחשה לאחר פתיחת הרוכסן, המתחם לא יצליח לדחוס, מכיוון שמולקולת SNAP-25 תהיה חסרה.
  9. כדי לצפות באירועים מתפתחים, המתן פרק זמן ארוך יותר לאחר פתיחת הרוכסן נצפה כדי לזהות עלייה נוספת בהרחבה (~ 2 ננומטר).

11. ניתוח נתונים

הערה: סוגי הניתוח שניתן לבצע עם נתוני MT תלויים במערכת היעד. אולם ישנן גישות נפוצות לחילוץ מידע שימושי מהניסויים המתאימים המתוארים באיור 4. כל הניתוחים מבוצעים באמצעות MATLAB (R2021a) באמצעות הקודים המותאמים אישית שסופקו במאמר זה. קודים אלה יוצרים מגרשים באמצעות אותם נתונים המוצגים במאמר זה. שים לב שבעוד שנתונים גולמיים ממעקב של 100 הרץ נלקחו ישירות לניתוח, נתונים ממעקב של 1.2 קילוהרץ היו בדרך כלל מסוננים בחציון (עם חלון הזזה של חמש נקודות) לפני הניתוח כדי להפחית את הרעש (למעט ניתוח רעש).

  1. ניסויי כבש כוח: לנתח את יחסי הכוח-הארכה (למשל, גמישות של פולימרים) ולהעביר את הכוח כדי לחלץ מידע על תכונות ננומכניות.
  2. ניסויי כוח קבוע: לנתח אוכלוסיות מצב וזמן שהייה (או קצב מעבר) כפונקציה של כוח כדי לחלץ פרמטרים מבניים (למשל, אזורים המעורבים במעבר), תרמודינמיים (למשל, הפרשי אנרגיה חופשית) וקינטיים (למשל, מחסום אנרגיה) של השינויים הקונפורמטיביים.
  3. ניסויי קפיצת כוח: לנתח קינטיקה של קרע (למשל, אינטראקציות חלבון-חלבון וקישור קולטן-ליגנד) או את משך החיים של מתווכים חולפים (למשל, התפתחות של ביומולקולות) כדי לחלץ את היציבות של מולקולות המטרה ואת מצבן.
  4. כיישומים מייצגים, נתח את נתוני הדגימה עבור סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE:
    1. מעברים דו-מדינתיים של סיכת ראש של DNA: פתיחת כוח, מרחק פתיחה, תלות בכוח של הסטת אוכלוסייה, ומדידות הקצאה וקצב מעבר של מצב עם מודל מרקוב נסתר (HMM) (קודי MATLAB מסופקים).
    2. שינויים קונפורמטיביים של קומפלקסים SNARE: כוח רוכסן, תלות בכוח של מצבי ביניים וחביון פתיחת רוכסן, היסטרזיס ב rezipping, והתנהגות פתיחה/קיפול מחדש.
      הערה: מודלים של הארכת כוח עבור ידיות DNA, סיכות שיער של DNA וקונפורמציות מורכבות של SNARE ניתנים בהפניות קודמות14,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כיול כוח
התוצאות משתי שיטות מדידת הכוח (שונות התזוזה הצידית של חרוזים וניתוח ספקטרום הספקטרום) היו שונות ב-0-2 pN (איור 2G). לפי התוצאות באיור 2F, אנו יכולים להגיע באופן אמין עד 30 pN עם מגנטים רגילים של ניאודימיום.

מעברים דו-מדינתיים של סיכת ראש DNA של 8 bp
תחילה חקרנו את הננומכניקה של סיכת ראש קצרה של דנ"א (איור 5). סיכות ראש של DNA התאפיינו באופן נרחב בספקטרוסקופיית כוח קונבנציונלית של מולקולה אחת, ולכן קיים מקור עצום של הפניות להשוואה איתו. פתיחת רוכסן של סיכת ראש קצרה היא בדרך כלל הפיכה, כך שאירועי הרוכסן שלה נצפים גם הם באותו טווח כוחות שבו מתרחשת פתיחת הרוכסן (איור 5A). על-ידי הפעלת כבש כוח בין 0 pN ל-20 pN (איור 5B), ההארכה הנגרמת בכוח של מבנה סיכת השיער אומתה כעוקבת אחר מודל WLC, שניתן לייחס אך ורק לגמישות של ידיות דנ"א (איור 5C, "סגור"). בסביבות 6pN, המבנה הציג תנודות נוספות בהרחבה, הקשורות לפתיחה הפיכה של מבנה סיכת השיער (איור 5C, כניסה). לבסוף, ב~8 pN, המעבר נעלם בסופו של דבר וההרחבה התיישבה על המצב העליון שהורחב עוד יותר ב~7 ננומטר. כתוצאה מכך, פרופיל הארכת הכוח שנמדד מעל 8 pN נצמד לעקומת מודל חדשה (איור 5C, "פתוח") הכוללת את אורך האזור החד-גדילי של סיכת השיער הלא מרוכסנת.

לאחר מכן ביצענו ניסויים בכוח קבוע כדי לבחון את המעבר של סיכת השיער באופן שיטתי. מיקום החרוז נמדד בטווח הכוח של 4-8 pN עם צעדים של 0.5 pN עבור ~ 10 שניות בכל רמה; לאחר מכן, ערכי ההרחבה נאספו ונותחו כדי למדוד את התפלגות שיווי המשקל שלהם כפונקציה של כוח. התוצאות ממעקב של 100 הרץ הצביעו על מעבר הדרגתי למצב מורחב יותר במשטר הכוח הזה (איור 5D), אולם ההיסטוגרמות שהתקבלו של ההרחבה לא היו ברורות מספיק כדי לפתור אוכלוסיות נפרדות (איור 5E). בניגוד מוחלט, כאשר אותם ניסויים בוצעו במהירות של 1.2 קילוהרץ (איור 5F), המסלולים המהירים של שינויי ההרחבה לאחר סינון עדין (מסנן חציוני בעל חמש נקודות) חשפו שתי אוכלוסיות נפרדות שמתוארות היטב על-ידי תערובת של שתי התפלגות גאוס (איור 5G). ההפרדה בין שתי האוכלוסיות, המציינת את מרחק הפתיחה של סיכת השיער, נותרה ללא שינוי ברמה של ~7 ננומטר במשטר כוח פתיחת הרוכסן (איור 5H). הסטייה בגפיים (4 pN ו- 8 pN) נבעה מלוקליזציה לא מדויקת של מדינה אחת בגלל מחסורה.

הנתונים גילו שכוח האמצע לפתיחת רוכסן המעבר (הכוח שבו האוכלוסיות הסגורות והפתוחות הופכות שוות) F1/2 היה ~6 pN, והמצב העליון, הפתוח, הפך בהדרגה לדומיננטי ככל שהגדלנו את הכוח על פני 4-8 pN (איור 5I). כאשר הותאם יחס בולצמן עבור ההסתברות הפתוחה, התקבלו הערכים המדויקים של F 1/2 = 5.9 pN ו- Δz = 7.1 ננומטר, Equation 10בהתאם לתצפיות לעיל. יש לציין, עם זאת, כי כוח הפתיחה המתקבל ממבנה יחיד עשוי להיות לא מדויק בגלל השונות מחרוז לחרוז ביצירת כוח, שנמדדה כ~ 4% עבור חרוזי M270 מסחריים31. יתר על כן, מכיוון שאורך הגבעול (8 bp) קצר, כוח הפתיחה של הקרקע-אמת של סיכות שיער אחרות של 8 bp עם הרכב נוקלאוטידים שונה עשוי להשתנות הרבה20. לבסוף, יישמנו את ה-HMM על עקבות ההרחבה כדי למפות את מעבר המצב, וכך מדדנו את שיעורי המעבר (איור 5F, עקבות אדומות). גם קצב פתיחת הרוכסן וגם קצב הרוכסן מחדש השתנו באופן אקספוננציאלי עם הכוח המופעל (איור 5J), באופן כזה שהכוח מקדם פתיחת רוכסן ומעכב רוכסן. במידת הצורך, ניתן להמשיך ולהשתמש בביטוי בל הקלאסי כדי לחלץ את הפרמטרים של נוף האנרגיה (למשל, גובה המחסום ומרחקו)46.

אפיון תנודות תרמיות במדידות הרחבה
באמצעות מבנה סיכת הראש, תיארנו את הרעש תלוי הכוח במדידות הארכה. ראשית, התנודות התרמיות של חרוז קשור חושבו מתוך משוואות באמצעות הפרמטרים (למשל, רדיוס חרוז, אורך קשירה) המתאימים לניסויים אלה2,5 (איור 5K, עקומות מוצקות). שרטטנו גם את סטיית התקן של ההארכה Equation 11 שנמדדה ממעקב הזמן של מבנה סיכת ראש ברמות כוח ברורות. מכיוון שלמולקולה זו היה מוטיב של סיכת שיער, התגובה שלה תחת 4 pN (מצב סגור) שימשה למדידת רעש פנימי, בעוד שהדינמיקה של סיכת השיער זוהתה ~ 6 pN, כצפוי, ושימשה כבדיקה. דיכוי תלוי כוח של תנודות נצפה גם לאחר שסיכת הראש הפכה פתוחה ברובה (השוו 8 pN לעומת 4 pN). השוואה עם הגבול התרמי מצביעה על כך שיש מקום לשיפור, אך רעש זה שנותר קשור לעתים קרובות לתנודות סיבוביות של חרוז מגנטי30, שהוא אקראי ומאתגר לפתרון. לניתוח שיטתי יותר של הרעש הבראוני על פני זמן התצפית, חישוב סטיית אלן משמש לעתים קרובות32,33. חישבנו את השונות של אלן עבור נתוני סיכות השיער שהוצגו באיור 5F, בדומה למדידות של 5 kbp באיור 2C. התוצאות באיור 5L מראות שבתחום כוחות הביניים של 4-8 pN קיבלנו סטיית אלן של 2-3 ננומטר במהירות המרבית (1.2 קילוהרץ), וערך זה ירד אל מתחת ל-1 ננומטר עבור זמן התצפית (τ) הארוך מ-0.1 שניות. באופן מעניין, הדינמיקה של סיכות השיער הופיעה סביב 5-7 pN עבור ~ 0.01 שניות (איור 5L, כניסה), בהתאם לכוח המעבר ולקצבי המעבר שנמדדו באיור 5I,J.

שינויים קונפורמטיביים של מתחמי SNARE עצביים
לאחר מכן השתמשנו בקומפלקסים עצביים של SNARE כמודל חלבוני ובחנו את התכונות המכניות תלויות הכוח שלהם. שלא כמו מבנה סיכת השיער, קומפלקסים בודדים של SNARE הוחזקו בין שתי ידיות dsDNA של 510 bp (איור 6A). יש לציין כי הטרמיני של תחביר-1A ו-VAMP2, דיסטלי מהידיות, הוצלבו על ידי קשר דיסולפידי בין שאריות ציסטאין מלאכותיות כדי למנוע קרע ולאפשר סבבי פינצטה מרובים של מבנה נתון.

תחילה הפעלנו רמפת כוח, הן עם רמות כוח עולות והן יורדות (± 1 pN s−1) כדי למתוח ולהרפות את מבנה המטרה, בהתאמה. במשטר הכוח הנמוך עד הבינוני (0-10 pN), שתי הידיות התנהגו באופן עצמאי כפולימרים WLC, ובסך הכל עיצבו את עקומת הארכת הכוח שלא ניתן להבחין בינה לבין זו של 1 kbp dsDNA (איור 6B, שחור). עם זאת, כאשר הכוח הוגדל מעל 10 pN, ערכי ההרחבה סטו במידה ניכרת ממודל WLC, מה שמצביע על כך שקומפלקס SNARE המוטבע הציג עלייה נוספת בהרחבה. באופן ספציפי יותר, ניתן לסכם את העלייה בהארכה בשלושה שלבים נפרדים: (א) עלייה קלה והדרגתית ב-11-13 pN, (ב) תנודות מהירות וגדולות יותר (~10 ננומטר) ב-14-16 pN, ו-(ג) ביטול סופי ובלתי הפיך של כ~20 ננומטר. בנוסף, כאשר הכוח הונמך כדי להרפות את המבנה, השלוחה חזרה לעקומת הארכת הכוח המקורית בכוח נמוך יותר (<15 pN) או עקבה אחר עקומת מודל חדשה עם הרחבה גדולה יותר (איור 6B, כחול). ההרחבה הכוללת שוחזרה בסופו של דבר לערכים הנמוכים יותר (מכחול לשחור באיור 6B) מתחת ל-5 pN, וניתן היה ליישם את אותם מחזורי כבש כוח, שהראו מגמה דומה.

מהמודל המולקולרי של קונפורמציה מורכבת SNARE אנו יכולים לחשב במדויק את ערכי ההרחבה האפשריים של מתווכים פוטנציאליים (איור 6C). יתר על כן, בהנחה של התנהגות WLC עבור הפוליפפטידים הלא מקולקלים, ניתן להעריך את ההרחבות כפונקציה של כוח, ובכך ליצור את המודלים של הארכת הכוח המלאה עבור הקונפורמציות השונות (איור 6B, קווים מקווקוים). אם ניקח ערכים אלה כהפניה, פירשנו את המעברים לעיל כדלקמן 14,23: (א) מעבר הדרגתי ממצב רוכסן מלא (FZ) למצב מקשר-פתוח (LO) ב- 11-13 pN, המרמז על פתיחת אזורי המקשר של תחביר-1A ו- VAMP2; (ב) מעבר מהיר בין LO למצב חצי רוכסן (HZ), המרמז על פתיחת קומפלקס SNARE עד לשכבה היונית האפסית; ו-(ג) המעבר הסופי למצב unzipped (UZ) או למצב unfolded (UF), המרמז על פירוק מוחלט של VAMP2 משאר המתחם. מצב UZ שונה מ-UF בכך שהמולקולה המשויכת של SNAP-25 עדיין קשורה לתחביר-1A, תוך שמירה על קומפלקס בינארי. במקרה של UF (ללא SNAP-25), קומפלקס SNARE המלא יכול להתחדש רק לאחר שמולקולת SNAP-25 חופשית מהתמיסה משתלבת מחדש, כאשר הורדת הכוח המופעל כדי לאפשר קשירה מחדש כזו היא קריטית.

כדי לאמת את השינויים הקונפורמטיביים של קומפלקסי SNARE באופן שיטתי יותר, לאחר מכן ביצענו ניסויי קפיצת כוח במשטר הכוח, שם נצפו לעתים קרובות תנודות קונפורמציה ב-14-15 pN (איור 6D). בדרך כלל, התחלנו תחילה במדידת מיקום החרוז ב- 10 pN ובדקנו את ההרחבה היציבה, מה שמצביע על היעדר שינויים הקשורים ל- SNARE. לאחר מכן, רמת הכוח הועלתה בפתאומיות ל 14-15 pN, שבו השלוחה נוטרה עד שהתרחשה פתיחת הרוכסן, אם בכלל. לבסוף, הכוח הופחת בחזרה ל -10 pN כדי לבדוק אם יש עלייה מתמשכת בהרחבה הקשורה להתפתחות. ב 14 pN, עקבות ההרחבה נשארו בעיקר במצב LO, עם קפיצות מדי פעם למצב HZ. יש לציין כי טיולים קצרים אלה למצב HZ צפויים להחמיץ במעקב 100 הרץ, אשר ממוצע ודגימה למטה תמונות חרוזים על ידי פקטור של 12. למרות הביקורים הברורים והתכופים במצב HZ, המתחם לא הצליח לבצע מעבר מלא למצב UZ (איור 6E), מה שמרמז על כך שהכוח החיצוני לא היה חזק מספיק כדי להתגבר על מחסום האנרגיה לפתיחת הרוכסן. לעומת זאת, אפילו עלייה קטנה בכוח (ל-14.3pN) הפכה את המעבר ליעיל מאוד, כך שמצב ה-UZ הושג ברובו תוך שניות ספורות (איור 6F). באופן עקבי, פתיחת הרוכסן הסתיימה בעיקר תוך שנייה אחת כאשר יישמנו 14.5 pN על הקומפלקס (איור 6G,H). יש לציין כי פתיחת הרוכסן בכוחות גבוהים יותר הובילה לעתים קרובות להתפתחות מלאה של המכלול כולו (מלווה בהסרת SNAP-25), כפי שמעידה העלייה הקטנה הנוספת בהרחבה מעל UZ (איור 6H) וחתימת הקיפול מחדש שנצפתה ב-2 pN (איור 6I). בסך הכל, נתונים אלה מראים את התנהגות הקשר הקלאסי47 עבור התגלגלות של מתחמי SNARE, עקבי עם דוחות קודמים 14,23,48.

Figure 1
איור 1: הגדרת המכשיר. סכמה (A) ותצלום (B) של הגדרת MT במהירות גבוהה. מגנטים הנשלטים על ידי מנוע ליניארי ומנוע סיבוב ממוקמים מעל שלב הדגימה של מיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשת טבילת שמן 100x ומצלמת CMOS במהירות גבוהה. קרן האור מדיודה סופר-זוהרת עוברת דרך המגנטים ומאירה את השדה. כניסה: תמונות עקיפה מייצגות של חרוזים הממוקמים במרחקים שונים ממישור המוקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כיול כוח. (A) סכמטי של מדגם כיול כוח. עוצמת הכוח המופעל על ידי זוג מגנטים אנטי-מקבילים בעלי הפרדה של 1 מ"מ נמדדת כפונקציה של מרחק מגנט d מתזוזות של חרוז מגנטי (M270) הקשור על ידי מקטע dsDNA של 5 kbp. (ב) נתונים מייצגים מנוהל כיול הכוח. חצים צבעוניים מציינים אזורים המורחבים ב- (D) (צבעים תואמים). (C) סטיית אלן למיקום z של חרוז קשור 5 kbp שנמדדה עם 15-20 pN. עקומות עבור קואורדינטות z של החרוז המגנטי לפני (כחול) ואחרי (אדום) המחסירות את מיקום חרוז הייחוס מוצגות. (D) סדרת זמן מייצגת של מיקום y שנמדד במרחק המגנט המצוין d. ההיסטוגרמה המתאימה של התפלגות קואורדינטות y מוצגת מימין עם התאמה גאוסיאנית (אדום). (E) PSD מייצג מהנתונים המוצגים ב-(D). ערכי הכוח המתקבלים על ידי התאמת מודל (אדום) ל- PSD המתאימים ניתנים למעלה. (F) כיול הכוח המגנטי כפונקציה של מרחק מגנט. הכוחות נמדדו מהשונות (משמאל) או משיטת PSD (מימין). ההתאמה (אדום) מציינת מודל מעריכי כפול עם המשוואה המבוארת. (G) הפרש בכוח הנמדד המתקבל משונות ו-PSD. עקומה אדומה מחושבת עבור ההתאמות המוצגות ב- (F). (ח,ט) אימות הקשר בין כוח להרחבה של מבנה הכיול של 5 kbp. ערכי ההרחבה הממוצעים ברמות כוח שונות (שנמדדו מהשונות) שימשו ישירות (H) או לאחר תיקון עבור היסט גובה החרוז (I) עקב הטיה של חרוז לא ממורכז31. נתוני הארכת הכוח עבור n = 5 מולקולות הותאמו על ידי מודל WLC ניתן להרחבה, והפרמטרים שהותאמו (אורך התמדה, L, p ומודולוס מתיחה Ko) מבוארים למעלה (ממוצע ± s.d). קיצור: PSD = צפיפות ספקטרלית של הספק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הכנת דגימה . (A) הכנת מבנים של סיכות ראש DNA של 8 bp על-ידי הגברה PCR של אזור λ-DNA של 1 kbp. (B) הכנת מבנים מורכבים SNARE עם שתי ידיות DNA של 510 bp. כניסה: אימות ידיות DNA והצמדתן לחלבונים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (2% ג'ל). חצים מציינים את שינוי הניידות (מקודד בצבע) של מיני מוצרים: ידיות חופשיות של 510 bp (מגנטה); ידית B מחוברת לתחביר (אדום), לקומפלקס ΔN (ירוק) ולקומפלקס SNARE (כחול); ומתחם SNARE הסופי בעל שתי ידיות (ירוק). התוספת של SDS משבשת את קומפלקסי ΔN (נוכחים ב-b) אך לא את קומפלקסי SNARE המלאים שנוצרו על ידי VAMP2 באורך מלא (נוכח ב-c). (C) תכנון וצילום של תא זרימה לניסויי MT. (D) סכמטי של החדרה רציפה של תמיסות דגימה לערוץ תאי זרימה. קיצור: MT = טוויטר מגנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: סוגי ניסויים מייצגים. (A-C) סכמות של ניסויי כבש כוח, מהדק כוח וקפיצת כוח (למעלה) עם עקבות זמן מייצגים של הארכה מהמדידות המתאימות (באמצע). סוגי הניתוח שניתן לבצע מוצגים בתחתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מעבר דו-מצבי של סיכת ראש של 8 bp DNA. (A) סכמטיות של ניסויי MT על סיכת ראש של DNA עם המעבר הצפוי לפתיחת רוכסן ורוכסן. (B) עקבות מייצגים של הארכת מבנה מניסויי כבש כוח עם רמות כוח מוגברות (~0.25 pN s−1). (C) עקומת הארכת כוח מייצגת המשוחזרת מהנתונים ב-(B). עקומות צהובות מציינות דגמי WLC עבור מבנה סיכת השיער עם סיכת הראש בקונפורמציה סגורה (מוצקה) ופתוחה (מקווקוות). (D) עקבות הרחבה מייצגות מניסויי כוח קבוע עם רמות כוח עולות, שנמדדו ב-100 הרץ. (E) היסטוגרמות של נתוני הרחבה ב-(D). (ו,ז) תוצאות עבור אותם ניסויים ב-(D) ו-(E) אך עם מעקב של 1.2 קילוהרץ. סדרת הזמן הגולמית של 1.2 קילוהרץ הוחלקה על ידי החלת מסנן חציוני בן חמש נקודות. עקבות אדומות בתצוגה המורחבת של (F) התקבלו מ-HMM. קווים אדומים ב-(G) מציינים את מיקומן של אוכלוסיות גאוס. (H) המרחק בין שתי האוכלוסיות ב-(G). (I) הסתברות במצב הפתוח כפונקציה של הכוח המופעל. העקומה האדומה היא מודל בולצמן מותאם (Equation 10 ) עם הכוח האמצעי F1/2 = 5.9 pN. (J) קצבי מעבר של רוכסן ודחיסה שנמדדו מתוצאות ה-HMM. קווים מוצקים מצביעים על תלות אקספוננציאלית בכוח. (K) תנודות תרמיות במדידות הרחבה. סטיות תקן של נתוני הארכת סיכת שיער (ללא סינון) מוצגות כפונקציה של כוח. גבול הרזולוציה התרמית המייצג את הגודל התיאורטי של תנודות תרמיות הוערך מ- Eq. 9 בעבודה של Choi et al.2 עבור חרוז 2.8 מיקרומטר עם קשירה של 1 kbp. (L) סטיות Allan חושבו מנתוני סיכת השיער של 1.2 kHz ב- (F) (ללא סינון). הכניסה מראה את סטיית אלן ב 0.01 שניות כפונקציה של כוח, אשר מדגים עלייה הדרגתית וירידה של תנודות עקב דינמיקה של סיכת שיער. קיצור: MT = טוויטר מגנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: שינויים קונפורמטיביים של קומפלקסים עצביים של SNARE. (A) סכמטי של ניסויי MT על קומפלקסים של SNARE. (B) עקומות הארכת כוח מייצגות עבור מבנה SNARE. עקבות שחורות וכחולות (100 הרץ) התקבלו מתקופות מתיחה והרפיה בניסויי כבש כוח, בהתאמה. קווים מקווקווים מציינים מודלים של הרחבה, תוך התחשבות בקונפורמציות השונות של מתחמי SNARE המוצגים ב- (C). (C) מודלים מולקולריים של קונפורמציות מורכבות SNARE עם ההרחבות המחושבות המתאימות. הערכים הוערכו על פי הפרמטרים הגיאומטריים של צרורות סליליים ומודל WLC לאזור הפוליפפטיד14. (D) סכמה של ניסויי קפיצת כוח לחקר קונפורמציות מורכבות של SNARE. (ה-ה) עקבות הרחבה מייצגים מניסויי קפיצת כוח שבוצעו ברמות הכוח שצוינו. ב-(ה) לא נצפתה פתיחת רוכסן. ב-(F) וב-(G) נצפתה פתיחת רוכסן ואחריה רוכסן ב-10pN. ב-(H), פתיחת הרוכסן לוותה באירוע נוסף שהתרחש. (I) קיפול מחדש של קומפלקס SNARE ב-2 pN. ירידה ברורה בהארכה ממצב UF למצב FZ נצפתה ב -5 pN. קיצור: MT = טוויטר מגנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגדרת PCR תנאי
חומרים 1.25 מיקרוגרם/מ"ל λ-DNA (תבנית), פריימרים 1 מיקרומטר קדימה ואחורה, 0.2 mM dNTP, 0.05 U/μL nTaq, מאגר nTaq אחד
דנטורציה 95°C למשך 30 שניות
חישול מבנה כיול: 55°C למשך 30 שניות
סיכת ראש DNA: 57°C למשך 30 שניות
ידיות DNA: 50°C למשך 30 שניות
סיומת סיכת ראש וידיות DNA: 72°C למשך דקה אחת
מבנה כיול: 72°C למשך 5 דקות
מחזור 30–34
אלקטרופורזה ג'ל אגרוז
ג'ל 2% אגרוז ב-0.5x tris-borate-EDTA (TBE, pH 8.3) המכיל 1x SYBR Safe
פועל עוצמה מלאה (108 V ממוצע) על Mupid-2plus (מתקדם), 40-50 דקות

טבלה 1: תנאים לתגובות PCR ואלקטרופורזה בג'ל אגרוז. פרמטרי תגובה עבור PCR של מבני DNA, כולל dsDNA של 5 kbp לכיול כוח, מבנה סיכות שיער של DNA וידיות DNA לחיבור SNAREs. רצפי פריימר ניתנים בטבלת החומרים.

מאגר טיהור חלבונים הרכב
חיץ כביסה A 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 7 mM β-מרקפטואתנול (BME), 10% גליצרול ו-20 mM imidazole
חיץ כביסה B 50 mM HEPES (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% גליצרול ו-20 mM imidazole
חיץ ליזיס Wash Buffer A בתוספת 1% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), וקוקטייל מעכב פרוטאז 1x
חיץ אלוציה Wash Buffer B בתוספת 400 mM imidazole
מלח חוצץ פוספט (PBS) 81 mM נתרן פוספט dibasic (Na 2 HPO 4), 19 mM נתרן פוספט monobasic (NaH 2 PO4) (pH7.2), 150 mM NaCl
חיץ פוספט 81 mM Na 2HPO 4, 19 mM NaH2PO 4, pH7.4

טבלה 2: חוצצים והרכבם. הרכב מאגרים המשמשים לטיהור חלבונים.

איור משלים S1: ציור של מחזיק מגנט. מוצגים מידות של מחזיק אקריליק לשני מגנטים בגודל 10 מ"מ x 10 מ"מ x 12 מ"מ עם רווח של 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: קובץ מכווץ המכיל קודי MATLAB. סקריפטים של MATLAB לניתוח נתונים שהופקו על ידי ניסויי פינצטה מגנטית במהירות גבוהה, כולל כיול כוח, סיכת ראש וניתוח מורכב של SNARE. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: קובץ מכווץ של חבילת התוכנה LabVIEW. חבילה מלאה של קודי LabVIEW להפעלת מערך פינצטה מגנטית במהירות גבוהה והשגת נתונים באמצעותה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו הצגנו מערך ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת שיכול לצפות בשינויים מבניים של ביומולקולות בדיוק מרחבי-זמני גבוה. מצלמת ה-CMOS המהירה שבה נעשה שימוש מקבלת 1,200 פריימים s−1 ברזולוציה של 1,280 x 1,024, ומאפשרת מעקב חרוזים של 1.2 קילוהרץ. עם זאת, מהירות המדידות מוגבלת כיום על ידי תוכנת מעקב החרוזים, ולכן החזר ההשקעה מצטמצם בדרך כלל לאזורים קטנים יותר במדידות במהירות גבוהה. העוצמה הגבוהה של SLD מספקת תאורה בהירה שהיא קריטית להדמיית חרוזים מהירה של עד רוחב פס של כמה קילוהרץ. יתר על כן, הקוהרנטיות המרחבית של הקרן יוצרת טבעות עקיפה קונצנטריות בעלות ניגודיות גבוהה סביב החרוזים (איור 1A, כניסה), המאפשרות קביעה מדויקת של מיקום החרוז בהתבסס על סימטריה.

ניתן לקבוע את הכוח המגנטי המופעל על מבנה קשירת חרוזים על ידי מדידת התנודות הבראוניות של החרוז הקשור35,37,38. מכיוון שניתוח כוח בזמן אמת הוא כבד מבחינה חישובית, הכוח המופעל נמדד בדרך כלל מראש באמצעות מבנה ייחוס. לדוגמה, החרוזים המגנטיים שבהם נעשה שימוש קשורים על-ידי מקטעי dsDNA ארוכים (>5kbp), והתנודות התרמיות המתאימות במיקום החרוזים נמדדות כפונקציה של מרחק מגנט (איור 2A). כיול הכוח מתבצע בדרך כלל פעם אחת לאחר בניית ההתקנה, אך אין צורך לחזור עליו באופן קבוע אלא אם כן ההתקנה משתנה, למשל, על ידי החלפת המגנטים. מכיוון שהתדירות האופיינית של תנודות החרוזים עולה עם הפעלת הכוח2, מערך במהירות גבוהה שימושי במיוחד כדי ללכוד את הדינמיקה המהירה במשטר כוח גבוה ולמדוד את הכוח במדויק. אומדן כוח משונות הוא הרבה יותר פשוט ביישומו מאשר הניתוח הספקטרלי בתחום התדרים, אך הוא רגיש לממצאים מסחיפה, רכישה מבוססת מצלמה, ושינויי ההרחבה עקב חיבור חרוזים לא ממורכז31,37,38. עם זאת, התוצאות משתי השיטות שונות רק ב-0-2 pN אם הן מתקבלות כראוי (איור 2G); לכן, שיטת השונות אמינה מספיק כאשר הקביעה המוחלטת של הכוח אינה קריטית.

עבור כוחות גבוהים יותר מעל 30 pN ובסביבות 65 pN (שבו מתיחת יתר של dsDNA משמשת כאמת מידה), יש להתקין מגנטים ברמה גבוהה (N50-N52) הזמינים מסחרית, להקטין את המרווח בין המגנטים, או להנדס עוד יותר את השדה המגנטי28,49. במערך זה, המהירות המהירה ביותר של המנוע האנכי היא 30 מ"מ לשנייה, המאפשרת קפיצת כוח מ- 0 pN ל- 20 pN ב~0.6 שניות. ניתן להחמיץ כמה שינויים מבניים מהירים תלויי כוח אם תנועת המנוע מגבילה את קצב העמסת הכוח. בהתאם ליישום, ייתכן שיהיה צורך בשינויים ואופטימיזציה נוספת של אופן העברת המגנטים. דוגמה אחת היא השימוש היצירתי בראש סרט מגנטי15.

עבור מדידות ברזולוציה גבוהה עם MTs, חשוב להעריך את רמת הרעש ממקורות שונים. ברגע שהרכיבים האופטיים (מיקרוסקופ עם עדשה בהגדלה גבוהה, מקור אור בהיר ומצלמה מהירה) מוגדרים כראוי, ניתן להשיג דיוק תת-ננומטרי במעקב אחר חרוזים. לאחר מכן, מקור הרעש העיקרי הופך לתנועה בראונית של חרוז, המשמשת למדידת הכוח המופעל. התנודה התרמית של חרוז קשור תלויה ברדיוס שלו, באורך הקשירה ובכוח המופעל. למרות שהתנודות המהותיות בכיוון z (כלומר, שינויי הארכה) תלויות אך ורק באנרגיה תרמית ובנוקשות הקשירה, דינמיקת קשירת החרוזים וקצב הרכישה מבוסס המצלמה מסננים את תנועת החרוז ובכך את הניטור של ביומולקולות המטרה בתורו. לכן, יש לבחור את גודל החרוז ואת קצב הדגימה באופן אסטרטגי כדי להשיג רזולוציה מרחבית-זמנית טובה. כחלופה לחרוז 2.8 מיקרומטר בו השתמשנו, חרוזים קטנים יותר של 1 מיקרומטר פופולריים גם הם ויכולים להיות יתרון למדידות מהירות בגלל התגובה המהירה שלהם. עם זאת, חולשה קריטית היא התוכן המגנטי הקטן, המגביל את הכוח המרבי שניתן ליצור (Equation 12 ). מאחר שחרוזים קטנים יותר עדיין יכולים להפעיל כוח של עד 10 pN לפחות, הם עשויים להתאים לחקר תופעות של כוח חלש, כמו למשל בסלילי על של דנ"א. לעומת זאת, חקירות של מנועים מולקולריים, קיפול חלבונים (למשל, SNAREs, המוצג כאן), או מכניקת התא50 מחייבות הפעלת כוחות גבוהים יותר, ובמקרה כזה ניתן לשקול לשנות את תצורת המגנט (למשל, להקטין את הפער או המרחק) כדי להרחיב את טווח הכוח המופעל28,51.

מכיוון שהטכניקה חוקרת את התגובות הננו-מכניות של מולקולות מטרה תוך הפעלת כוח בקנה מידה רלוונטי מבחינה ביופיזיקלית, היא מתאימה באופן אידיאלי לחקר יסודות רגישים לכוח הממלאים תפקידים מרכזיים בתהליכים מכנוביולוגיים. כדי להמחיש את הישימות הרחבה של בדיקת MT ברמת דיוק גבוהה, השתמשנו הן בחומצת גרעין והן במודל חלבוני המציגים שינויים קונפורמטיביים דינמיים ומהירים עם הפעלת כוח בקנה מידה פיקוניוטון. מגבלה אחת של הטכניקה היא הדרישה לחומצות גרעין וחלבונים מטוהרים, מה שהרתיע במיוחד את הרחבתה הרחבה למגוון רחב של חלבונים. ההתקדמות של טכנולוגיות ביטוי והצמידות של חלבונים במבחנה תמשיך לספק גישה לחלבונים פחות נחקרים. בעיה קשורה היא שידע א-פריורי על מבנה המטרה הוא לעתים קרובות קריטי לניסויי תכנון (למשל, חיבור ידיות). אנו מצפים כי הופעתם של cryo-EM 52 ו-AlphaFold2 53 של חלקיק יחיד תתמוך מאוד בתכנון וניתוח של מדידות מכניות על מולקולות חלבון בודדות ותשחרר יישומים חזקים יותר של MT ברזולוציה גבוהה.

כוח פתיחת הרוכסן של סיכות השיער של הדנ"א תלוי בגורמים רבים, כולל רצף, מבנה והרכב חיץ, אך באופן הקריטי ביותר באורך הגבעול ובתכולת הגואנין-ציטוזין (GC)20. כדי להדגים את העוצמה של מעקב במהירות גבוהה, תכננו בכוונה גזע של 8 bp (עם שלושה זוגות בסיס GC) שהיה צפוי להיפתח בכוח נמוך עם דינמיקה מהירה. ואכן, התוצאות באיור 5 מראות שהיה קשה לפתור דינמיקה מהירה כזו עם טכניקות סטנדרטיות ברזולוציה של 10 אלפיות השנייה ומטה. היבט זה מאושר עוד יותר על ידי שיעורי המעבר שנמדדו מניתוח HMM, שהשיעורים הגבוהים שלהם נעו בין 100 ל -200 s−1 (איור 5J).

SNAREs עצביים נחשבים כמניעים אקסוציטוזה של שלפוחית סינפטית. בפרט, חלבוני SNARE מזרזים את איחוי הממברנה על ידי הורדת מחסום האנרגיה הקשורים, כגון דחייה אלקטרוסטטית בין השלפוחית לקרומי הפלזמה. לפיכך, תנודות קונפורמציה של מתחמי SNARE נמצאים להתרחש בטווח כוח צר של 12-15 pN, המתאים לרמה הצפויה של כוחות דוחים14,23. באמצעות MTs במהירות גבוהה המתוארים כאן, שחזרנו את הממצאים העיקריים על התנהגות תלוית כוח של קומפלקסים SNARE עצביים. היסטרזיס הכוח בפתיחת רוכסן ורוכסן מחדש (איור 6B) מצביע על כך שרוכסן מחדש מתרחש בכוח נמוך יותר מאשר פתיחת רוכסן, ולכן העבודה נעשית במהלך מחזור זה. מעברים לא-שיווי משקל כאלה ניגשים טוב יותר באמצעות ניסויי קפיצת כוח, שבהם ניתן למדוד את זמן ההשהיה למעבר תחת עומס (בדומה לאירוע קרע קשר) או תנודות קונפורמטיביות לפני פתיחת הרוכסן. שני המקרים נהנים מהגדרות במהירות גבוהה, כפי שהודגם על ידי מחקרים אחרונים על מצבים חולפים של ביומולקולות והקומפלקסים שלהם 15,17,54,55,56.

באופן קולקטיבי, תוצאות אלה תואמות את השינויים תלויי הכוח האופייניים של סיכות שיער DNA וקומפלקסים SNARE עצביים שדווחו עם ספקטרוסקופיית כוח קונבנציונלית של מולקולה אחת. במקביל, הם מדגישים את התועלת של מדידות מכניות בדיוק גבוה כדי לחשוף את רגישות הכוח של ביומולקולות ומכלוליהן. אנו מקווים שמאמר זה יוכל למשוך יותר אנשים מתחום המכנוביולוגיה, ויניע חוקרים להשתמש ב- MTs במהירות גבוהה בחקירת מערכות העניין הייחודיות שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 ו-NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. נתמך על ידי מענק NRF (2021R1C1C2009717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCACA
GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC
GGCAGCCATACTAGCGGAGAT
ATCGCCGAGGACGCAGACAT
GCGCAATGAGCTGGAGGAGA
TGCAGAGGAGGGCTGACCAG
CTGGCTGATGAGTCCCTGGA
AAGCACCCGTCGCATGCTGC
AGCTGGTTGAAGAGAGTAAA
GATGCTGGCATCAGGACTTT
GGTTATGTTGGATGAGCAAG
GCGAACAACTGGAACGCATT
GAGGAAGGGATGGACCAAAT
CAATAAGGACATGAAAGAAG
CAGAAAAGAATTTGACGGAC
CTAGGAAAATTCGCCGGCCT
TGCCGTGGCCCCCGCCAAC
AAGCTTAAATCCAGTGATGC
TTACAAAAAAGCCTGGGGC
AATAATCAGGATGGAGTAGT
GGCCAGCCAGCCTGCCCG
TGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTG
GCTTCATCCGCAGGGTAAC
AAATGATGCCCGGGAAAAT
GAGATGGATGAGAACCTG
GAGCAGGTGAGCGGCATC
ATCGGAAACCTCCGCCAC
ATGGCTCTAGACATGGGCA
ATGAGATTGACACCCAGA
ATCGCCAGATCGACAGGA
TCATGGAGAAGGCTGATT
CCAACAAAACCAGAATTG
ATGAAGCCAACCAACGTG
CAACAAAGATGCTGGGAA
GTGGTTAAggatccgaattcgag
ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc
gagcaccaccaccaccaccactgagat
ccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgag
caataactagcataaccccttggggcct
ctaaacgggtcttgaggggttttttgctga
aaggaggaactatatccggat
6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCAC
AGCAGCGGCCTGGTGCCGC
GCGGCAGCCATATGGCAGAT
CTCTCGGCTACCGCTGCCAC
CGTCCCGCCTGCCGCCCCG
GCCGGCGAGGGTGGCCCCC
CTGCACCTCCTCCAAATCTTA
CCAGTAACAGGAGATGCCAG
CAGACCCAGGCCCAGGTGG
ATGAGGTGGTGGACATCATG
AGGGTGAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAG
CTATCGGAACTGGATGATCG
CGCAGATGCCCTCCAGGCA
GGGGCCTCCCAGTTTGAAA
CAAGTGCAGCCAAGCTCAA
GCGCAAATACTGGTGGAAA
AACCTCAAGATGATGTGCTA
Aggatccgaattcgagctccgtcg
acaagcttgcggccgcactcgagcaccacca
ccaccaccactgagatccggctgctaacaaa
gcccgaaaggaagctgagttggctgctgcca
ccgctgagcaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
ctgaaaggaggaactatatccggat
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 homemade ggggaattgtgagcggataacaattcccctc
tagaaataattttgtttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGTAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactcactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaaggagatatacat
ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATGATT
GACAGGATCGAGTACAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa
cgccagcacatggactcgtctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccccttggggcctct
aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag
gaggaactatatccggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgg
gtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc
gctttcttcccttcctttctcgccacgttcg
ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggg
gctccctttagggttccgatttagtgcttta
cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttttcgccctttgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttgttcc
aaactggaacaacactcaaccctatctcggt
ctattcttttgatttataagggattttgccg
atttcggcctattggttaaaaaatgagctga
tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaa
aatattaacgtttacaatttctggcggcacg
atggcatgagattatcaaaaaggatcttcac
ctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt
tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt
agataactacgatacgggagggcttaccatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa
taaaccagccagccggaagggccgagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc
cagtctattaattgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa
cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa
gtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtaagatgcttttctgtgactg
gtgagtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa
aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
catactcttcctttttcaatcatgattgaag
catttatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgtatttagaaaaataaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa
caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga
taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccacttcaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
taccagtggctgctgccagtggcgataagtc
gtgtcttaccgggttggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggttcgtgcacacagcccagcttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaaggcggacaggtatccggta
agcggcagggtcggaacaggagagcgcac
gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc
tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca
ggggggcggagcctatggaaaaacgccagc
aacgcggcctttttacggttcctggccttttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccgtatta
ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagta
tacactccgctatcgctacgtgactgggtca
tggctgcgccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctgtgaccgtct
ccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc
gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg
taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc
tggcttctgataaagcgggccatgttaaggg
cggttttttcctgtttggtcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttctgttcatgggggta
atgataccgatgaaacgagagaggatgctca
cgatacgggttactgatgatgaacatgcccg
gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg
gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaa
tcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaa
tacagatgtaggtgttccacagggtagccag
cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa
tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag
actttacgaaacacggaaaccgaagaccatt
catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc
ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct
ctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgg
gcgccagggtggtttttcttttcaccagtga
gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctg
tttgatggtggttaacggcgggatataacat
gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga
ctcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgcc
atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat
tgcgagtgagatatttatgccagccagccag
acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg
cccgctaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaataatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagcttccac
agcaatggcatcctggtcatccagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga
gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagttgatcggcgcgagatt
taatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtg
cagggccagactggaggtggcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc
catcgccgcttccactttttcccgcgttttc
gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc
gggaaacggtctgataagagacaccggcata
ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc
acattcaccaccctgaattgactctcttccg
ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttt
gcgccattcgatggtgtccgggatctcgacg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggccgttgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacagtcccccggccacgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc
cccatcggtgatgtcggcgatataggcgcca
gcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg
ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat
cgatctcgatcccgcgaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcc
agggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGCCGA
GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25 (2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301 (2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712 (2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885 (2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639 (2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083 (2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348 (2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335 (2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302 (2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697 (2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115 (2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397 (2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114 (2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920 (2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271 (2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152 (2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028 (2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7 (2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206 (2021).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 195 פינצטה מגנטית במהירות גבוהה ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה אחת סיכת ראש DNA קומפלקס SNARE
פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, … More

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, H. G., Yoon, T. Y., Shon, M. J. High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements. J. Vis. Exp. (195), e65137, doi:10.3791/65137 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter