Summary
نحن نقدم نظرة عامة شاملة وصقل البروتوكولات الحالية لتشكيل سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، والتي تشمل جميع مراحل زراعة الأعضاء العضوية. ويعمل هذا النظام كنموذج قيم لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة وتقييم فعالية الأدوية المرشحة.
Abstract
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو ورم منتشر ومميت للغاية في جميع أنحاء العالم ، واكتشافه المتأخر وعدم وجود عوامل علاجية محددة فعالة يستلزم مزيدا من البحث في التسبب في المرض والعلاج. حظيت الكائنات العضوية ، وهي نموذج جديد يشبه إلى حد كبير أنسجة الورم الأصلية ويمكن زراعتها في المختبر ، باهتمام كبير في السنوات الأخيرة ، مع العديد من التقارير حول تطوير نماذج عضوية لسرطان الكبد. في هذه الدراسة ، نجحنا في تحسين الإجراء وإنشاء بروتوكول استزراع يتيح تكوين عضويات HCC أكبر حجما مع ظروف مرور وثقافة مستقرة. لقد حددنا بشكل شامل كل خطوة من خطوات الإجراء ، والتي تغطي العملية الكاملة لتفكك أنسجة سرطان الكبد ، والطلاء العضوي ، والثقافة ، والمرور ، والحفظ بالتبريد ، والإنعاش ، وقدمنا احتياطات مفصلة في هذه الورقة. تظهر هذه الكائنات العضوية تشابها وراثيا مع أنسجة سرطان الكبد الأصلية ويمكن استخدامها في تطبيقات متنوعة ، بما في ذلك تحديد الأهداف العلاجية المحتملة للأورام وتطوير الأدوية اللاحقة.
Introduction
حظي سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، وهو ورم منتشر ومتنوع على نطاق واسع1 ، باهتمام كبير داخل المجتمع الطبي. يشير وجود لدونة النسب وعدم التجانس الكبير في سرطان الكبد إلى أن الخلايا السرطانية التي تنشأ من مرضى مختلفين وحتى آفات مميزة داخل نفس المريض قد تظهر سمات جزيئية ومظهرية مختلفة ، مما يمثل عقبات هائلة في تقدم الأساليب العلاجية المبتكرة2،3،4،5. وبالتالي، هناك حاجة ملحة إلى تعزيز فهم الخصائص والآليات البيولوجية لمقاومة الأدوية في سرطان الكبد للاسترشاد بها في صياغة استراتيجيات علاجية أكثر فعالية.
في العقود الأخيرة ، كرس الباحثون جهودهم لتطوير نماذج في المختبر لغرض دراسة HCC 3,4. على الرغم من بعض التطورات ، لا تزال القيود قائمة. تشمل هذه النماذج مجموعة من التقنيات ، مثل استخدام خطوط الخلايا والخلايا الأولية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX). تعمل خطوط الخلايا كنماذج في المختبر لثقافة طويلة الأجل للخلايا السرطانية التي تم الحصول عليها من مرضى سرطان الكبد ، مما يوفر فوائد الراحة والتوسع السهل. تتضمن نماذج الخلايا الأولية العزلة المباشرة وزراعة الخلايا السرطانية الأولية من أنسجة ورم المريض ، مما يوفر تمثيلا للخصائص البيولوجية التي تشبه إلى حد كبير خصائص المرضى أنفسهم. تستلزم نماذج PDX زرع أنسجة ورم المريض في الفئران ، بهدف محاكاة نمو الورم والاستجابة له بأمانة أكبر. كانت هذه النماذج مفيدة في أبحاث سرطان الكبد ، ومع ذلك فهي تمتلك بعض القيود ، بما في ذلك عدم تجانس خطوط الخلايا وعدم القدرة على التكاثر الكامل في ظروف الجسم الحي. علاوة على ذلك ، قد تؤدي الزراعة المطولة في المختبر إلى تدهور الخصائص والوظائف الأصلية للخلايا ، مما يشكل تحديات في تمثيل الخصائص البيولوجية لسرطان الكبد بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام نماذج PDX يستغرق وقتا طويلا ومكلفا3.
لمعالجة هذه القيود وتكرار السمات الفسيولوجية لسرطان الكبد بشكل أكثر دقة ، تم تقديم استخدام التكنولوجيا العضوية كمنصة بحثية واعدة قادرة على تجاوز القيود السابقة. تتمتع الكائنات العضوية ، وهي نماذج خلايا ثلاثية الأبعاد مستزرعة في المختبر ، بالقدرة على تكرار بنية ووظائف الأعضاء الفعلية. ومع ذلك ، في سياق HCC ، توجد بعض التحديات في إنشاء نماذج عضوية. تشمل هذه التحديات أوصافا مفصلة بشكل غير كاف لإجراءات بناء HCC العضوي ، وعدم وجود بروتوكولات شاملة للعملية الكاملة لبناء الأعضاء HCC ، والحجم الصغير عادة للعضويات المستزرعة6،7،8. في ضوء الأبعاد المحدودة عادة للعضويات المستزرعة ، سعينا لمواجهة هذه التحديات من خلال تطوير بروتوكول شامل يشمل كامل بناء عضوي HCC6. يشمل هذا البروتوكول تفكك الأنسجة ، والطلاء العضوي ، والثقافة ، والمرور ، والحفظ بالتبريد ، والإنعاش. من خلال تحسين الخطوات الإجرائية وتحسين تكوين وسط الاستزراع ، نجحنا في إنشاء نماذج عضوية HCC قادرة على النمو المستدام وتمرير 6,8 على المدى الطويل. في الأقسام اللاحقة ، سيتم تقديم سرد شامل للتعقيدات التشغيلية والعوامل ذات الصلة التي ينطوي عليها بناء عضويات HCC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على أنسجة خزعة بشرية من المريض المعني في مستشفى السرطان التابع ومعهد جامعة قوانغتشو الطبية ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إنشاء عضويات سرطان الكبد المشتقة من المريض من العينات الجراحية
ملاحظة: يشمل إنشاء عضويات سرطان الكبد مراحل مختلفة ، وهي تفكك الأنسجة ، والطلاء العضوي ، والثقافة ، والمرور ، والحفظ بالتبريد ، والإنعاش. تتطلب عملية تفكك الأنسجة مدة 2 ساعة ، بينما يستغرق بذر المواد العضوية على طبق حوالي 40 دقيقة. بعد ذلك ، يخضع الجيل الأولي من عضويات سرطان الكبد لفترة استزراع من 10-14 يوما باستخدام وسط عزل سرطان الكبد. بمجرد تحقيق كثافة مرضية ، يتم إجراء الممرات العضوية ، الأمر الذي يتطلب 1 ساعة. ثم يتم الحفاظ على الثقافات اللاحقة للعضويات باستخدام وسط تمدد HCC لمدة 7-10 أيام ، والتي قد تختلف اعتمادا على معدل نمو وحالة المواد العضوية.
- تفكك الأنسجة
- إعداد المستلزمات والمواد
- جمع 1-2 سم3 من أنسجة سرطان الكبد من المرضى الذين لم يتلقوا أي علاج موضعي أو جهازي سابق قبل العملية. بعد الاستئصال الجراحي ، احتفظ بالأنسجة عند 4 درجات مئوية في محلول حفظ الأنسجة (الجدول 1) حتى المعالجة.
ملاحظة: عينات الأنسجة الطازجة عالية الجودة ضرورية لنجاح إنشاء المواد العضوية. من المهم معالجة العينات على الفور ، من الناحية المثالية في غضون 1-4 ساعات بعد الاستئصال الجراحي للحفاظ على صلاحية الأنسجة. تنفيذ جميع الإجراءات اللاحقة في بيئة معقمة باستخدام المواد والكواشف المعقمة. - سخن ألواح زراعة الخلايا السطحية منخفضة للغاية (24 بئرا) لمدة 1 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. قم بإذابة مستخلص الغشاء القاعدي المجمد (BME) طوال الليل عند 4 درجات مئوية حتى قبل الاستخدام مباشرة.
ملاحظة: لضمان الذوبان الكامل ل BME ، يجب وضعه على الجليد لمدة 3 ساعات على الأقل. يعد الذوبان الكامل ل BME أمرا ضروريا لنجاح الثقافة العضوية في الخطوات اللاحقة. - قبل الاستخدام ، تأكد من تسخين محلول الهضم (الجدول 1) إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تحضير محلول الهضم طازجا في بيئة معقمة واستخدامه على الفور.
- جمع 1-2 سم3 من أنسجة سرطان الكبد من المرضى الذين لم يتلقوا أي علاج موضعي أو جهازي سابق قبل العملية. بعد الاستئصال الجراحي ، احتفظ بالأنسجة عند 4 درجات مئوية في محلول حفظ الأنسجة (الجدول 1) حتى المعالجة.
- تدفق المعالجة التنظيمية
- في خزانة التدفق الصفحي ، قم بقطع أنسجة الورم إلى قطع صغيرة (0.5-1 مم3) باستخدام مقص جراحي على طبق بتري. انقل الأنسجة المقطوعة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف 5-10 مل من الوسط القاعدي (الجدول 1).
ملاحظة: يمكن تخزين الوسط القاعدي (الجدول 1) عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. - استخدم ماصة باروتروبيك لغسل أكبر قدر ممكن من الدم واتركها لمدة 1-2 دقيقة لإزالة بعض المواد الطافية ، بما في ذلك أي خلايا دم وجلطات دهنية عائمة. كرر هذا الإجراء مرتين.
- أجهزة الطرد المركزي الخليط في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإزالة بعناية طف. أضف 5 مل من محلول الهضم المسخن مسبقا (الجدول 1) إلى الأنسجة المشذبة.
- قم بتدوير الأنبوب عند 37 درجة مئوية للهضم.
- بعد 30 دقيقة من الهضم الأولي ، ابحث عن مجموعات صغيرة من الخلايا تحت المجهر. تحقق كل 5-10 دقائق لتجنب فرط الهضم.
ملاحظة: يعتمد الوقت اللازم لهضم الأنسجة على حجم ونوع الأنسجة. يجب ألا يتجاوز هضم الأنسجة 90 دقيقة. سوف تظهر الأنسجة المهضومة تحت المجهر كورقة كبيرة من الخلايا الفردية. يشار إلى المستوى المناسب من الهضم من خلال حقيقة أن معظم هذه هي مجموعات الخلايا ولها مظهر يشبه العنب. - توقف عن الهضم عن طريق إضافة وسط قاعدي بارد (الجدول 1) وقم بالتصفية في أنبوب جديد سعة 50 مل مع مرشح خلية 100 ميكرومتر. أضف الوسط القاعدي البارد إلى حجم 50 مل.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 2 × غرام لمدة 10 دقائق عند 8 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات بإضافة 50 مل أخرى من الوسط القاعدي البارد (الجدول 1). كرر هذه الخطوة مرتين.
ملاحظة: يستخدم الطرد المركزي منخفض السرعة للسماح لمجموعات الخلايا الصغيرة بالاستقرار ، بينما لا تزال خلايا الدم وحطام الخلايا معلقة في المادة الطافية ؛ تتكرر العملية عدة مرات للحصول على كتلة خلايا الأنسجة النقية نسبيا.
- في خزانة التدفق الصفحي ، قم بقطع أنسجة الورم إلى قطع صغيرة (0.5-1 مم3) باستخدام مقص جراحي على طبق بتري. انقل الأنسجة المقطوعة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف 5-10 مل من الوسط القاعدي (الجدول 1).
- إعداد المستلزمات والمواد
- الطلاء العضوي
- بعد الغسيل الثاني ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية وأعد تعليق العدد المطلوب من الخلايا (1000-5000 خلية لكل بئر من صفيحة 24 بئرا) في BME المناسب للطلاء.
ملاحظة: احتفظ دائما ب BME عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. - أضف BME وقم بتعليق مجموعات الخلايا الصغيرة في Advanced DMEM / F-12 عن طريق إضافة BME وسحب السحب برفق لأعلى ولأسفل حتى يتم تعليق تجميعات الخلايا تماما. السيطرة على تركيز BME بين 30 ٪ و 50 ٪.
- بذور 50 ميكرولتر قطرات BME مختلطة مع مجموعات الخلايا في وسط لوحات استزراع 24 بئرا.
ملاحظة: قدر الإمكان ، لا تدع القطرات تنتشر على الجدار الجانبي للوحة البئر. الجدار الجانبي للوحة منخفضة الامتزاز ليس في حالة امتصاص منخفض ، وسيؤدي التلامس بين القطرات والجدار الجانبي إلى الالتصاق ، وهو ما لا يفضي إلى الحضانة اللاحقة. - اترك الألواح التي تحتوي على القطرات المضافة لتتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. في نهاية الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا (الجدول 1) إلى كل بئر واحتضانها في حاضنة الخلايا عند 37 درجة مئوية.
- بعد الغسيل الثاني ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية وأعد تعليق العدد المطلوب من الخلايا (1000-5000 خلية لكل بئر من صفيحة 24 بئرا) في BME المناسب للطلاء.
- ثقافة العضوية
- قم بتحديث وسيط الثقافة (الجدول 1) مرة كل 2-3 أيام. في بداية الاستزراع ، استزراع عضويات سرطان الكبد في وسط عزل سرطان الكبد (الجدول 1) لمدة أسبوعين.
- بعد أسبوعين من الحضانة بوسط عزل سرطان الكبد، استبدل الوسط بوسط تمدد عضوي لسرطان الكبد (الجدول 1) (يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين).
- قم بتحديث وسيط الثقافة مرة كل 3 أيام.
- بعد 7-10 أيام من الزراعة باستخدام وسط تمدد HCC عندما يصل العضو العضوي إلى الكثافة أو الحجم المناسب ، ابدأ التدخلات التجريبية أو المرور أو تجفيف المواد العضوية حسب الحاجة.
- المرور العضوي
- إعداد المستلزمات والمواد
- سخن ألواح زراعة الخلايا السطحية منخفضة للغاية (24 بئرا) لمدة 1 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. قم بإذابة BME المجمد طوال الليل عند 4 درجات مئوية حتى قبل الاستخدام مباشرة.
- يسخن محلول الحصاد العضوي وبديل التربسين على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- عملية المرور
- بعد إزالة وسط الاستزراع من لوحة البئر ، انقل التعليق العضوي إلى أنبوب سعة 15 مل.
- أضف محلول حصاد عضوي وفقا لكمية BME (500 ميكرولتر من محلول الحصاد العضوي لكل 50 ميكرولتر من BME) عن طريق الكشط والسحب لأعلى ولأسفل باستخدام مسدس ماصة 1000 ميكرولتر.
ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء طوال العملية لمنع فقدان المواد العضوية لأن وجود فقاعات الهواء يشير إلى ارتفاع ضغط الماصة. - احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بشفط BME برفق باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ولاحظ أن BME قد ذاب تماما. راقب كل 10 دقائق حتى يتم ملاحظة مجموعة خلايا عضوية واضحة ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تجميد العضو العضوي والحفاظ عليه. - للهضم الأنزيمي للعضويات ، أضف 1-5 مل من بديل التربسين (وفقا لعدد الكائنات العضوية) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. لاحظ تحت المجهر درجة الهضم الأنزيمي لتحديد ما إذا كانت الكائنات العضوية تنفصل إلى مجموعات صغيرة من 2-10 خلايا ؛ إذا لم يكن كذلك ، استمر في الهضم الأنزيمي.
ملاحظة: سيؤدي الإفراط في الهضم إلى تحلل مجموعات الخلايا العضوية إلى خلايا مفردة ، مما يقلل من صلاحيتها ويطيل وقت المزرعة اللاحق. - أضف الحجم المناسب من الوسط القاعدي البارد (الجدول 1) لوقف عملية الهضم.
- أجهزة الطرد المركزي المواد العضوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 8 درجات مئوية ؛ إزالة طاف قدر الإمكان.
- أعد تعليق العدد المطلوب من المواد العضوية (1000-5000 عضوي لكل بئر من لوحة 24 بئرا) في المصفوفة المناسبة للطلاء. اتبع نفس الخطوات كما في القسم 1.2.
ملاحظة: يجب تحسين كثافة الطلاء وفقا لمعدل نمو وحجم المواد العضوية. - مرور المواد العضوية كل 10 أيام بنسبة 1: 3 أو 1: 4 اعتمادا على كثافة نمو المواد العضوية.
- إعداد المستلزمات والمواد
- الحفظ بالتبريد العضوي والإنعاش
- الحفظ بالتبريد للمواد العضوية
- تحضير أنابيب التجفيد ، كل أنبوب يتلاقى مع بئرين من لوحة 24 بئر تحتوي على عضويات.
- اتبع الخطوات من 1.4.2.1 إلى 1.4.2.4 لتمرير المواد العضوية للحصول على المواد العضوية بدون BME ، وأعد تعليق المواد العضوية برفق عن طريق إضافة 500 ميكرولتر / بئر من محلول التجفيد العضوي إلى لوحة 24 بئرا.
ملاحظة: اعتمادا على حالة نمو وحجم المواد العضوية ، يوصى بحفظ المواد العضوية بالتبريد في الثقافة حتى الجيل الثالث. - انقل التعليق إلى أنابيب التجفيد وضعه في صندوق مبرد بالتدرج عند -80 درجة مئوية. بعد التبريد المتدرج عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل ، انقل الأنابيب إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.
- إنعاش المواد العضوية
- احتضان الأنابيب المجففة بالتجميد في حمام مائي 37 درجة مئوية وتوقف عن الحضانة عندما تبقى كتلة صغيرة فقط من الجليد.
- جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 8 درجات مئوية لإزالة المادة الطافية تماما.
- اتبع القسمين 1.2 و 1.3 للعمليات اللاحقة.
- الحفظ بالتبريد للمواد العضوية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند تنفيذ الإجراء المذكور أعلاه ، يمكن ملاحظة ظهور كرويات عضوية HCC عادة في غضون 3 أيام (الشكل 1). يوضح الشكل 1 أ ، ب عضوي HCC الثابت ، والذي يطور على الفور كرويات مدمجة تتميز بحواف مستديرة وسيتوسول نافذ في اليوم الأول من التأسيس. أثناء نمو عضويات سرطان الكبد ، كان لاستخدام تركيزات مختلفة من BME تأثيرات مختلفة على معدل نمو المواد العضوية. قمنا بزراعة اثنين من عضويات سرطان الكبد المشتقة من المريض في 10٪ و 30٪ و 50٪ و 100٪ من BME لمدة 12 يوما في وسط تمدد HCC (الجدول 1) ووجدنا أن BME كان سليما عند 30٪ و 50٪ وكانت الكائنات العضوية قريبة الحجم وكان لها أكبر قطر عند تركيزات BME هذه. عند 10٪ BME ، كان BME هو الأكثر تجزؤا ، مع مساحة ضيقة لنمو المواد العضوية وأصغر قطر. عند 100٪ BME ، كان BME هو الأكثر سلامة ، لكن قطر المواد العضوية كان في المنتصف. لذلك ، يوصى بالتحكم في تركيز BME عند 30-50٪ في ثقافة HCC العضوية (الشكل 2). يمكن نشر العضو العضوي المتكاثر لسرطان الكبد بشكل فعال وفقا للبروتوكول المحدد ، حيث يصل حجمه إلى 500 ميكرومتر في كل ثقافة بعد ثلاثة أجيال من الثقافة (الشكل 3). يمكن إجراء التجارب اللاحقة ، بما في ذلك التدخل الدوائي والتلوين الكيميائي المناعي ، عند تحقيق هذا الحجم. باستخدام استراتيجية الاستزراع هذه ، حققنا نموا كبيرا في عضويات سرطان الكبد ، حيث وصلت إلى أحجام تتجاوز 1000 ميكرومتر خلال فترة استزراع مدتها 20 يوما (الشكل 4). كشف التلوين المناعي الكيميائي لكل من عضويات سرطان الكبد وأنسجة الورم المقترنة عن أوجه تشابه في التعبير عن جينات العلامة (الشكل 5).
الشكل 1: عضويات سرطان الكبد المشتقة من الأنسجة الجراحية للمرضى. (أ ، ب) صور تمثيلية لثقافات عضوية قوية من سرطان الكبد في اليوم الأول من الطلاء. (ج، د) الثقافات العضوية HCC بعد 5 أيام من الزراعة. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر (أ ، ج) ، 250 ميكرومتر (ب ، د). اختصار: HCC = سرطان الخلايا الكبدية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: للتحقيق في نمو نماذج عضوي HCC بتركيزات مختلفة من BME. تم استزراع عضويات HCC A و B بنفس كثافة الزراعة لمدة 12 يوما في 10٪ و 30٪ و 50٪ و 100٪ BME باستخدام وسط تمدد HCC (الجدول 1). قضبان المقياس = 1,000 ميكرومتر (أ) ، 250 ميكرومتر (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عضويات سرطان الكبد في التضخيم على المدى الطويل. (أ ، ب) صور تمثيلية لعضويات سرطان الكبد في اليوم العاشر من المقطع 8. شريط المقياس = 500 ميكرومتر (أ) ، 250 ميكرومتر (ب). اختصار: HCC = سرطان الخلايا الكبدية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الحد الأقصى لحجم عضويات سرطان الكبد. صور تمثيلية لعضويات سرطان الكبد في فترة استزراع مدتها 20 يوما في المقطع 8. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: الخصائص النسيجية المرضية لعضويات سرطان الكبد وأنسجة الورم المقترنة. تم الكشف عن التعبير عن علامات الجينات لعضويات سرطان الكبد وأنسجة الورم المقترنة ، وعلامة HCC AFP ، وعلامات خلايا الكبد المتمايزة HNF4A و ALB ، وعلامات الأقنية SOX9 و EPCAM ، وعلامة الصفراء KRT19 بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: AFP = ألفا فيتوبروتين. HNF4A = العامل النووي لخلايا الكبد 4 ألفا ؛ ALB = الزلال ؛ SOX9 = عامل نسخ صندوق SRY 9 ؛ EPCAM = جزيء التصاق الخلايا الظهارية ؛ KRT19 = الكيراتين 19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تكوين الوسائط والحلول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تكمن إحدى الفوائد الملحوظة للنماذج العضوية المشتقة من المريض في قدرتها على تكرار الخصائص البيولوجية للأورام بأمانة ، بما في ذلك بنية الأنسجة والمشهد الجينومي. تظهر هذه النماذج مستوى ملحوظا من الدقة وتعكس بشكل فعال عدم تجانس الأورام وتطورها ، حتى على مدى فترات طويلة من الزراعة6،8،9. من خلال استخدام بروتوكول الثقافة العضوية المكرر هذا ، أنشأنا بشكل فعال نماذج عضوية HCC مشتقة من المريض ، مما يسهل النمو المستدام في المختبر ، بالإضافة إلى القدرة على حفظ المواد العضوية بالتبريد وإنعاشها لاحقا كما هو مطلوب للأغراض التجريبية. بالمقارنة مع البروتوكولات السابقة ، تظهر هذه الكائنات العضوية معدلات نمو معززة وقادرة على تحقيق أبعاد أكبر في الثقافة. بعد ذلك ، أخضعنا المواد العضوية الراسخة للعقاقير المقترنة بالأجسام المضادة المشتقة من أهداف سرطانية محتملة تم فحصها مسبقا ، مما أدى إلى نتائج علاجية ملحوظة تتوافق مع النماذج الحيوانية PDX في الجسم الحي 10,11.
كان الهدف من هذه الدراسة هو تحسين أوجه القصور في بروتوكولات إنشاء HCC العضوية السابقة ، مما أدى إلى تكوين عضويات HCC أكبر حجما في ظل ظروف مرور وزراعة مستقرة. قمنا بتحسين تركيز BME لتحسين معدل نمو المواد العضوية مع تقليل تكلفة التجربة. إضافة عامل مهم ، CHIR99021 ، إلى صيغة الثقافة الأصلية ، والتي يمكن أن تعزز التجديد الذاتي للخلايا الجذعية في المواد العضوية وتعزيز انتشار المواد العضوية ؛ تحسين طريقة إزالة BME ، من طريقة الفصل الميكانيكي الأصلية إلى استخدام محلول حصاد خاص ، لزيادة كمية المواد العضوية التي تم الحصول عليها وتحسين الكفاءة ؛ استكملت خطوات تشغيل الحفظ بالتبريد العضوي والإنعاش ، وشيدت العملية الكاملة لثقافة HCC العضوية. باستخدام بروتوكول الاستزراع العضوي هذا ، من الممكن تحقيق متوسط حجم عضوي يبلغ 800 ميكرومتر في فترة استزراع واحدة مدتها 20 يوما ، مع نمو عدد قليل من عضويات HCC القوية إلى أكثر من 1000 ميكرومتر. الهدف النهائي هو تعزيز دقة استراتيجيات العلاج لسرطان الكبد وإنشاء نموذج ومنصة يمكن الاعتماد عليها لتطوير الأدوية. ستساهم هذه الجهود في تحسين معدلات بقاء مرضى سرطان الكبد على قيد الحياة وتوفير حلول جديدة لمكافحة تحديات مقاومة الأدوية11،12،13.
ومع ذلك ، من الضروري النظر في جوانب متعددة من الخطاب. في المقام الأول ، تنشأ عقبة كبيرة من انخفاض فعالية إنشاء عضويات سرطان الكبد ، خاصة للمرضى الذين يعانون من سرطان الكبد في المرحلة المتوسطة إلى المتقدمة الذين خضعوا لتدخلات علاجية متنوعة ، بما في ذلك الانصمام الكيميائي الشرياني عبر القسطرة (TACE) والعلاج الكيميائي والعلاج الموجه 4,5. في كثير من الأحيان ، يتعرض نشاط الورم لعينات سرطان الكبد المستأصلة للخطر ، مما يؤدي إلى انخفاض معدل النجاح في توليد المواد العضوية. وفي الوقت نفسه ، في التأسيس السابق لعضويات سرطان الكبد من قبل فرق أخرى ، وجد أن هناك علاقة بين نسبة الخلايا المتكاثرة في الورم ، ودرجة تمايز الورم ، وإنشاء المواد العضوية 6,9. وبالتالي ، فإن تحقيق معدل نجاح مرتفع في تطوير عضويات سرطان الكبد يرتبط ارتباطا وثيقا بالعلاجات المستخدمة قبل جراحة المريض ، فضلا عن الحاجة إلى أحكام مساعدة من أخصائي علم الأمراض بعد الحصول على أنسجة الورم. بالإضافة إلى ذلك ، في حين يزعم أن الكائنات العضوية تكرر عدم تجانس سرطان الكبد ، فإن تمييز ما إذا كان العضو العضوي في الثقافة ينشأ من استنساخ خلية انفرادية أو يشمل مزيجا من الخلايا ذات الملامح الجينية المتميزة يشكل تحديا. وبالتالي ، لا بد من إجراء المزيد من الاستفسارات لزيادة فهمنا للديناميات النسيلية والتنوع الجيني داخل عضويات سرطان الكبد. علاوة على ذلك ، من الضروري معالجة القيود المتأصلة في تقنيات الاستزراع العضوي الحالية القائمة على الصفائح. أحد القيود البارزة هو إمكانات النمو المقيدة للمواد العضوية. ثقافة عضويات HCC باستخدام هذا البروتوكول ، من الممكن تحقيق أقطار تزيد عن 1000 ميكرومتر. ومع ذلك ، في المراحل اللاحقة من الثقافة ، غالبا ما يحدث النخر الأسود في المنطقة الأساسية من العضو العضوي ، بسبب عدم كفاية إمدادات المغذيات والأكسجين ، مما يحد من إمكانات تطوير المواد العضوية. لذلك ، هناك حاجة ملحة لوضع استراتيجيات تهدف إلى تعزيز توصيل المغذيات والأوكسجين داخل نظام الاستزراع العضوي.
باختصار ، تقدم النماذج العضوية المشتقة من المريض فوائد ملحوظة في إعادة إنتاج السمات البيولوجية لسرطان الكبد بدقة. ومع ذلك ، لا تزال هناك عقبات يجب التغلب عليها فيما يتعلق بفعالية إنشاء الأعضاء ، والديناميات النسيلية ، والقيود الكامنة في تقنيات الزراعة العضوية. من خلال مواجهة هذه التحديات ، يمكن زيادة فائدة نماذج سرطان الكبد العضوية لفهم المرض وتعزيز مساعي تطوير الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82122048 ؛ 82003773 ؛ 82203380) ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (2023A1515011416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A.
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A.
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
