Summary
We bieden een uitgebreid overzicht en verfijning van bestaande protocollen voor de vorming van hepatocellulair carcinoom (HCC), die alle stadia van de organoïdeteelt omvatten. Dit systeem dient als een waardevol model voor de identificatie van potentiële therapeutische doelwitten en de beoordeling van de effectiviteit van kandidaat-geneesmiddelen.
Abstract
Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd een veel voorkomende en dodelijke tumor en de late ontdekking en het gebrek aan effectieve specifieke therapeutische middelen maken verder onderzoek naar de pathogenese en behandeling ervan noodzakelijk. Organoïden, een nieuw model dat sterk lijkt op inheems tumorweefsel en in vitro kan worden gekweekt, hebben de afgelopen jaren veel belangstelling gewekt, met tal van rapporten over de ontwikkeling van organoïdemodellen voor leverkanker. In deze studie hebben we met succes de procedure geoptimaliseerd en een kweekprotocol opgesteld dat de vorming van grotere HCC-organoïden met stabiele passaging en kweekomstandigheden mogelijk maakt. We hebben elke stap van de procedure uitgebreid geschetst, waarbij we het hele proces van HCC-weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie hebben behandeld, en in dit artikel gedetailleerde voorzorgsmaatregelen hebben gegeven. Deze organoïden vertonen genetische gelijkenis met de originele HCC-weefsels en kunnen worden gebruikt voor diverse toepassingen, waaronder de identificatie van potentiële therapeutische doelen voor tumoren en de daaropvolgende ontwikkeling van geneesmiddelen.
Introduction
Hepatocellulair carcinoom (HCC), een veel voorkomende en zeer diverse tumor1, heeft veel aandacht gekregen binnen de medische gemeenschap. De aanwezigheid van afstammingsplasticiteit en substantiële heterogeniteit in HCC suggereert dat tumorcellen afkomstig van verschillende patiënten en zelfs verschillende laesies binnen dezelfde patiënt ongelijke moleculaire en fenotypische eigenschappen kunnen vertonen, waardoor formidabele obstakels worden gevormd bij de vooruitgang van innovatieve therapeutische benaderingen 2,3,4,5 . Bijgevolg is er een dringende behoefte aan een beter begrip van de biologische kenmerken en mechanismen van geneesmiddelresistentie bij HCC om de formulering van effectievere behandelingsstrategieën te informeren.
In de afgelopen decennia hebben onderzoekers hun inspanningen gewijd aan de ontwikkeling van in vitro modellen met het oog op het bestuderen van HCC 3,4. Ondanks enkele vorderingen blijven er beperkingen bestaan. Deze modellen omvatten een reeks technieken, zoals het gebruik van cellijnen, primaire cellen en van patiënten afgeleide xenotransplantaten (PDX). Cellijnen dienen als in vitro modellen voor langdurige kweek van tumorcellen verkregen van HCC-patiënten, en bieden de voordelen van gemak en gemakkelijke uitbreiding. Primaire celmodellen omvatten directe isolatie en kweek van primaire tumorcellen uit tumorweefsels van patiënten, waardoor een weergave wordt verkregen van biologische kenmerken die sterk lijken op die van de patiënten zelf. PDX-modellen omvatten de transplantatie van tumorweefsels van patiënten in muizen, met als doel de tumorgroei en -respons getrouwer te simuleren. Deze modellen hebben een belangrijke rol gespeeld in HCC-onderzoek, maar ze hebben bepaalde beperkingen, waaronder de heterogeniteit van cellijnen en het onvermogen om in vivo omstandigheden volledig te repliceren. Bovendien kan langdurige in-vitrokweek leiden tot een verslechtering van de oorspronkelijke kenmerken en functionaliteiten van de cellen, wat een uitdaging vormt bij het nauwkeurig weergeven van de biologische eigenschappen van HCC. Bovendien is het gebruik van PDX-modellen zowel tijdrovend als kostbaar3.
Om deze beperkingen aan te pakken en de fysiologische eigenschappen van HCC nauwkeuriger te repliceren, is het gebruik van organoïdetechnologie geïntroduceerd als een veelbelovend onderzoeksplatform dat in staat is om eerdere beperkingen te overtreffen. Organoïden, driedimensionale celmodellen die in vitro worden gekweekt, hebben het vermogen om de structuur en functionaliteit van echte organen na te bootsen. In de context van HCC bestaan er echter bepaalde uitdagingen bij het opstellen van organoïdemodellen. Deze uitdagingen omvatten onvoldoende gedetailleerde beschrijvingen van HCC-organoïdeconstructieprocedures, een gebrek aan uitgebreide protocollen voor het hele proces van HCC-organoïdeconstructie en de typisch kleine omvang van gekweekte organoïden 6,7,8. In het licht van de doorgaans beperkte afmetingen van gekweekte organoïden, hebben we geprobeerd deze uitdagingen aan te pakken door de ontwikkeling van een uitgebreid protocol dat de volledige HCC-organoïdenconstructie omvat6. Dit protocol omvat weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie. Door de procedurele stappen te optimaliseren en de samenstelling van het kweekmedium te verfijnen, hebben we met succes HCC-organoïdemodellen ontwikkeld die in staat zijn tot duurzame groei en langdurige passaging 6,8. In de volgende paragrafen zal een uitgebreid verslag worden gegeven van de operationele fijne kneepjes en relevante factoren die betrokken zijn bij de constructie van HCC-organoïden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke biopsieweefsels werden verkregen van de betreffende patiënt in het Affiliated Cancer Hospital and Institute van de Guangzhou Medical University, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Het vaststellen van HCC-organoïden van patiënten uit chirurgische monsters
OPMERKING: De oprichting van HCC-organoïden omvat verschillende stadia, namelijk weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie. Het proces van weefseldissociatie duurt 2 uur, terwijl het zaaien van organoïden op een plaat ongeveer 40 minuten duurt. Hierna ondergaat de eerste generatie HCC-organoïden een kweekperiode van 10-14 dagen met behulp van HCC-isolatiemedium. Zodra een bevredigende dichtheid is bereikt, worden organoïdepassages uitgevoerd, wat 1 uur duurt. De volgende culturen van de organoïden worden vervolgens gedurende 7-10 dagen in stand gehouden met behulp van HCC-expansiemedium, wat kan variëren afhankelijk van de groeisnelheid en conditie van de organoïden.
- Weefsel dissociatie
- Voorbereiding van benodigdheden en materialen
- Verzamel 1-2cm3 HCC-weefsel van patiënten die vóór de operatie geen eerdere lokale of systemische behandeling hebben ondergaan. Houd het weefsel na chirurgische resectie bij 4 °C in weefselconserveringsoplossing (tabel 1) tot verwerking.
OPMERKING: Verse weefselmonsters van hoge kwaliteit zijn essentieel voor het succesvol opzetten van organoïden. Het is belangrijk om monsters snel te verwerken, idealiter binnen 1-4 uur na chirurgische resectie om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Voer alle volgende procedures uit in een aseptische omgeving met behulp van steriele materialen en reagentia. - Verwarm ultralage oppervlaktecelkweekplaten (24 putjes) gedurende 1 uur voor in een incubator bij 37 °C. Ontdooi het bevroren basaalmembraanextract (BME) een nacht bij 4 °C tot vlak voor gebruik.
NOTITIE: Om ervoor te zorgen dat de BME volledig ontdooit, moet deze minimaal 3 uur op ijs worden geplaatst. Het volledig smelten van de BME is essentieel voor een succesvolle organoïdekweek in de volgende stappen. - Zorg er vóór gebruik voor dat de digestieoplossing (tabel 1) is opgewarmd tot een temperatuur van 37 °C.
NOTITIE: Bereid de digestieoplossing vers in een aseptische omgeving en gebruik deze onmiddellijk.
- Verzamel 1-2cm3 HCC-weefsel van patiënten die vóór de operatie geen eerdere lokale of systemische behandeling hebben ondergaan. Houd het weefsel na chirurgische resectie bij 4 °C in weefselconserveringsoplossing (tabel 1) tot verwerking.
- Organisatorische verwerkingsstroom
- Knip in een laminaire flowkast het tumorweefsel in kleine stukjes (0,5-1mm3) met een chirurgische schaar op een petrischaaltje. Breng het geknipte weefsel over in een conische buis van 15 ml en voeg 5-10 ml basaal medium toe (tabel 1).
OPMERKING: Het basale medium (tabel 1) kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard. - Gebruik een barotrope pipet om zoveel mogelijk bloed weg te spoelen en laat het 1-2 minuten staan om een deel van het supernatant te verwijderen, inclusief eventuele bloedcellen en zwevende vetstolsels. Herhaal deze procedure twee keer.
- Centrifugeer het mengsel bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig het supernatant. Voeg 5 ml van de voorverwarmde digestieoplossing (tabel 1) toe aan het bijgesneden weefsel.
- Draai de buis op 37 °C voor de spijsvertering.
- Zoek na 30 minuten van de eerste vertering naar kleine clusters van cellen onder de microscoop. Controleer elke 5-10 minuten om overdigestie te voorkomen.
OPMERKING: De tijd die nodig is voor weefselvertering is afhankelijk van de grootte en het type weefsel. De weefselvertering mag niet langer duren dan 90 minuten. Oververteerd weefsel zal onder de microscoop verschijnen als een groot vel individuele cellen. Het juiste verteringsniveau wordt aangegeven door het feit dat de meeste hiervan celclusters zijn en een druifachtig uiterlijk hebben. - Stop de vertering door koud basaal medium toe te voegen (tabel 1) en filtreer in een nieuw buisje van 50 ml met een celfilter van 100 μm. Voeg koud basaal medium toe tot een volume van 50 ml.
- Centrifugeer de cellen bij 2 × g gedurende 10 minuten bij 8 °C. Verwijder voorzichtig het supernatans en resuspendeer de pellet door nog eens 50 ml koud basaal medium toe te voegen (tabel 1). Herhaal deze stap twee keer.
OPMERKING: Centrifugeren met lage snelheid wordt gebruikt om kleine celclusters te laten bezinken, terwijl bloedcellen en celresten nog steeds in het supernatant zweven; Het proces wordt meerdere keren herhaald om een relatief zuivere weefselcelmassa te verkrijgen.
- Knip in een laminaire flowkast het tumorweefsel in kleine stukjes (0,5-1mm3) met een chirurgische schaar op een petrischaaltje. Breng het geknipte weefsel over in een conische buis van 15 ml en voeg 5-10 ml basaal medium toe (tabel 1).
- Voorbereiding van benodigdheden en materialen
- Organoïde beplating
- Verwijder na de tweede wasbeurt zoveel mogelijk van het supernatans en resuspendeer het gewenste aantal cellen (1.000-5.000 cellen per putje van een plaat met 24 putjes) in de juiste BME voor plating.
NOTITIE: Houd de BME voor gebruik altijd op 4 °C. - Voeg BME toe en suspendeer kleine celclusters in Advanced DMEM/F-12 door BME toe te voegen en zachtjes op en neer te pipetteren totdat de celaggregaten volledig zijn opgeschort. Controleer de concentratie van de BME tussen 30% en 50%.
- Zaad 50 μL BME-druppeltjes gemengd met celclusters in het midden van kweekplaten met 24 putjes.
NOTITIE: Laat de druppels zich zoveel mogelijk niet verspreiden naar de zijwand van de putplaat. De zijwand van de adsorptiearme plaat bevindt zich niet in een lage adsorptietoestand en contact tussen de druppels en de zijwand zal leiden tot adhesie, wat niet bevorderlijk is voor de daaropvolgende incubatie. - Laat de platen met de toegevoegde druppels gedurende 20 minuten stollen bij 37 °C. Voeg aan het einde van de incubatie 500 μl voorverwarmd medium (tabel 1) toe aan elk putje en incubeer in een celincubator bij 37 °C.
- Verwijder na de tweede wasbeurt zoveel mogelijk van het supernatans en resuspendeer het gewenste aantal cellen (1.000-5.000 cellen per putje van een plaat met 24 putjes) in de juiste BME voor plating.
- Organoïde cultuur
- Ververs het kweekmedium (tabel 1) eens in de 2-3 dagen. Kweek aan het begin van de kweek de HCC-organoïden gedurende 2 weken in HCC-isolatiemedium (tabel 1).
- Vervang het medium na 2 weken incubatie met HCC-isolatiemedium door HCC-organoïde-expansiemedium (tabel 1) (maximaal 2 weken bewaard bij 4 °C).
- Ververs het kweekmedium eens in de 3 dagen.
- Na 7-10 dagen kweken met HCC-expansiemedium, wanneer de organoïde de juiste dichtheid of grootte heeft bereikt, start u experimentele interventies of passeert of lyofiliseert u de organoïden indien nodig.
- Organoïde passaging
- Voorbereiding van benodigdheden en materialen
- Verwarm ultralage oppervlaktecelkweekplaten (24 putjes) gedurende 1 uur voor in een incubator bij 37 °C. Ontdooi bevroren BME 's nachts bij 4 °C tot vlak voor gebruik.
- Verwarm de organoïde-oogstoplossing en trypsinevervanger bij 37 °C gedurende 30 min.
- passeerproces
- Nadat u het kweekmedium van de putplaat hebt verwijderd, brengt u de organoïdussuspensie over in een buis van 15 ml.
- Voeg organoïde-oogstoplossing toe volgens de hoeveelheid BME (500 μL organoïde-oogstoplossing per 50 μL BME) door op en neer te schrapen en pipetteren met een pipetpistool van 1.000 μL.
OPMERKING: Vermijd luchtbellen tijdens het hele proces om verlies van organoïden te voorkomen, aangezien de aanwezigheid van luchtbellen duidt op een hogere pipetteerdruk. - Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig de BME voorzichtig op met een pipet van 1.000 μl en controleer of de BME volledig is opgelost. Observeer elke 10 minuten totdat een heldere organoïdecelcluster wordt waargenomen, centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 400 × g en verwijder zoveel mogelijk van het supernatans.
OPMERKING: In dit stadium kan de organoïde worden ingevroren en geconserveerd. - Voeg voor de enzymatische vertering van organoïden 1-5 ml trypsinevervanger toe (afhankelijk van het aantal organoïden) en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 °C. Observeer onder de microscoop de mate van enzymatische vertering om te bepalen of de organoïden uiteenvallen in kleine clusters van 2-10 cellen; Als dit niet het geval is, ga dan door met de enzymatische vertering.
OPMERKING: Overdigestie zal resulteren in de lysis van organoïde celclusters in afzonderlijke cellen, waardoor hun levensvatbaarheid afneemt en de daaropvolgende kweektijd wordt verlengd. - Voeg het juiste volume koud basaal medium toe (tabel 1) om de vertering te stoppen.
- Centrifugeer de organoïden bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C; Verwijder het supernatans zoveel mogelijk.
- Resuspendeer het gewenste aantal organoïden (1.000-5.000 organoïden per putje van een plaat met 24 putjes) in de juiste matrix voor plating. Volg dezelfde stappen als in paragraaf 1.2.
OPMERKING: De dichtheid van de beplating moet worden geoptimaliseerd op basis van de groeisnelheid en de grootte van de organoïden. - Passage de organoïden elke 10 dagen in een verhouding van 1:3 of 1:4, afhankelijk van de dichtheid van de organoïdegroei.
- Voorbereiding van benodigdheden en materialen
- Cryopreservatie en reanimatie van organoïden
- Cryopreservatie van organoïden
- Bereid vriesdroogbuisjes voor, waarbij elke buis samenvloeit met twee putjes van een plaat met 24 putjes die organoïden bevat.
- Volg de stappen 1.4.2.1 tot en met 1.4.2.4 voor het passeren van organoïden om organoïden zonder BME te verkrijgen, en resuspendeer de organoïden voorzichtig door 500 μL/putje organoïde-vriesdroogoplossing toe te voegen aan een plaat met 24 putjes.
OPMERKING: Afhankelijk van de groeistatus en grootte van de organoïden wordt aanbevolen om de organoïden tot de derde generatie in cultuur te cryopreserveren. - Breng de suspensie over in vriesdroogbuizen en plaats deze in een gradiëntgekoelde doos bij -80 °C. Na gradiëntafkoeling bij -80 °C gedurende ten minste 24 uur, de buizen overbrengen naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
- Reanimatie van organoïden
- Incubeer gevriesdroogde buizen in een waterbad van 37 °C en stop de incubatie wanneer er nog maar een klein blokje ijs overblijft.
- Centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 8 °C om het supernatans volledig te verwijderen.
- Volg de paragrafen 1.2 en 1.3 voor de volgende bewerkingen.
- Cryopreservatie van organoïden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na implementatie van de bovengenoemde procedure is de opkomst van HCC-organoïde sferoïden doorgaans waarneembaar binnen een tijdsbestek van 3 dagen (Figuur 1). Figuur 1A,B toont de gevestigde HCC-organoïde, die op de eerste dag van vestiging onmiddellijk compacte sferoïden ontwikkelt die worden gekenmerkt door afgeronde randen en permeabel cytosol. Tijdens de groei van HCC-organoïden had het gebruik van verschillende concentraties BME verschillende effecten op de groeisnelheid van de organoïden. We kweekten twee van patiënten afkomstige HCC-organoïden in 10%, 30%, 50% en 100% van de BME gedurende 12 dagen in HCC-expansiemedium (tabel 1) en ontdekten dat de BME intact was bij 30% en 50% en dat de organoïden dicht bij elkaar lagen en de grootste diameter hadden bij deze BME-concentraties. Met 10% BME was de BME het meest gefragmenteerd, met een smalle ruimte voor organoïdegroei en de kleinste diameter. Bij 100% BME was de BME het meest intact, maar de diameter van de organoïden lag in het midden. Daarom wordt aanbevolen om de concentratie van BME te controleren op 30-50% in HCC-organoïdecultuur (Figuur 2). De prolifererende HCC-organoïde kan effectief worden vermeerderd in overeenstemming met het voorgeschreven protocol, waarbij na drie generaties cultuur een grootte van meer dan 500 μm in elke cultuur wordt bereikt (figuur 3). Latere experimenten, waaronder medicamenteuze interventie en immunohistochemische kleuring, kunnen worden uitgevoerd bij het bereiken van deze grootte. Door gebruik te maken van deze kweekstrategie bereikten we een substantiële groei van HCC-organoïden, met een grootte van meer dan 1.000 μm binnen een kweekperiode van 20 dagen (Figuur 4). Immunohistochemische kleuring van zowel HCC-organoïden als gepaarde tumorweefsels onthulde overeenkomsten in de expressie van markergenen (Figuur 5).
Figuur 1: HCC-organoïden afkomstig van chirurgisch weefsel van patiënten. (A,B) Representatieve beelden van robuuste HCC-organoïdeculturen op de eerste dag van plating. (C,D) De HCC-organoïdeculturen na 5 dagen teelt. Schaalbalken = 500 μm (A,C), 250 μm (B,D). Afkorting: HCC = hepatocellulair carcinoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Onderzoek naar de groei van HCC-organoïdemodellen bij verschillende BME-concentraties. HCC-organoïden A en B werden gedurende 12 dagen bij dezelfde plantdichtheid gekweekt in 10%, 30%, 50% en 100% BME met behulp van HCC-expansiemedium (tabel 1). Schaalbalken = 1.000 μm (A), 250 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: HCC-organoïden in langdurige versterking. (A,B) Representatieve beelden van HCC-organoïden op de tiende dag van passage 8. Schaalbalk = 500 μm (A), 250 μm (B). Afkorting: HCC = hepatocellulair carcinoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Maximale grootte van HCC-organoïden. Representatieve beelden van HCC-organoïden in een kweekperiode van 20 dagen in passage 8 . Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Histopathologische kenmerken van HCC-organoïden en gepaarde tumorweefsels. De expressie van genmarkers voor HCC-organoïden en gepaarde tumorweefsels, HCC-marker AFP, gedifferentieerde hepatocytmarkers HNF4A en ALB, ductale markers SOX9 en EPCAM, en galmarker KRT19 werden gedetecteerd door immunohistochemie. Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: AFP = Alpha Fetoprotein; HNF4A = Hepatocyt Nucleaire Factor 4 Alfa; ALB = albumine; SOX9 = SRY-Box transcriptiefactor 9; EPCAM = epitheelceladhesiemolecuul; KRT19 = Keratine 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van media en oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een opmerkelijk voordeel van van patiënten afgeleide organoïdemodellen ligt in hun vermogen om de biologische kenmerken van tumoren getrouw na te bootsen, inclusief weefselstructuur en genoomlandschap. Deze modellen vertonen een opmerkelijk niveau van nauwkeurigheid en weerspiegelen effectief de heterogeniteit en progressie van tumoren, zelfs over langere perioden van cultivatie 6,8,9. Door het gebruik van dit verfijnde organoïdekweekprotocol hebben we effectief van patiënten afgeleide HCC-organoïdemodellen ontwikkeld, waardoor duurzame groei in vitro mogelijk is, evenals de mogelijkheid om organoïden te cryopreservatie en vervolgens te reanimeren zoals vereist voor experimentele doeleinden. In vergelijking met voorgaande protocollen vertonen deze organoïden verhoogde groeisnelheden en zijn ze in staat om grotere dimensies in cultuur te bereiken. Vervolgens onderwierpen we de gevestigde organoïden aan antilichaamgekoppelde geneesmiddelen die waren afgeleid van vooraf gescreende potentiële oncogene doelen, wat leidde tot opmerkelijke therapeutische resultaten die overeenkomen met in vivo PDX-diermodellen10,11.
Het doel van deze studie was om de tekortkomingen van eerdere HCC-organoïde-inrichtingsprotocollen te verbeteren, wat resulteerde in de vorming van grotere HCC-organoïden onder stabiele passaging- en kweekomstandigheden. We optimaliseerden de concentratie van BME om de groeisnelheid van organoïden te verbeteren en tegelijkertijd de kosten van het experiment te verlagen; een belangrijke factor toegevoegd, CHIR99021, aan de oorspronkelijke kweekformule, die de zelfvernieuwing van stamcellen in organoïden kan bevorderen en de proliferatie van organoïden kan bevorderen; verbetering van de verwijderingsmethode van BME, van de oorspronkelijke mechanische scheidingsmethode tot het gebruik van een speciale oogstoplossing, om de verkregen hoeveelheid organoïde te verhogen en de efficiëntie te verbeteren; vulde de operatiestappen van cryopreservatie en reanimatie van organoïden aan, construeerde het hele proces van HCC-organoïdecultuur. Met dit organoïdekweekprotocol is het mogelijk om een gemiddelde organoïdegrootte van 800 μm te bereiken in een enkele kweekperiode van 20 dagen, waarbij enkele robuuste HCC-organoïden uitgroeien tot meer dan 1.000 μm. Het uiteindelijke doel is om de precisie van behandelingsstrategieën voor HCC te verbeteren en een betrouwbaar model en platform voor de ontwikkeling van geneesmiddelen tot stand te brengen. Deze inspanningen zullen bijdragen aan de verbetering van de overlevingskansen van HCC-patiënten en het bieden van nieuwe oplossingen om uitdagingen op het gebied van resistentie tegen geneesmiddelen te bestrijden 11,12,13.
Het is echter absoluut noodzakelijk om meerdere aspecten van het discours in overweging te nemen. In de eerste plaats komt een belangrijk obstakel voort uit de verminderde werkzaamheid van het vaststellen van HCC-organoïden, met name voor patiënten bij patiënten met HCC in een gemiddeld tot gevorderd stadium die diverse therapeutische interventies hebben ondergaan, waaronder transkatheter arteriële chemo-embolisatie (TACE), chemotherapie en gerichte therapie 4,5. Vaak wordt de tumoractiviteit van weggesneden HCC-monsters aangetast, wat leidt tot een verminderde mate van succes bij het genereren van organoïden. Ondertussen bleek bij de eerdere vaststelling van HCC-organoïden door andere teams dat er een correlatie bestaat tussen het aandeel prolifererende cellen in de tumor, de mate van differentiatie van de tumor en de oprichting van organoïden 6,9. Daarom is het bereiken van een hoog slagingspercentage bij de ontwikkeling van HCC-organoïden nauw verbonden met de behandelingen die voorafgaand aan de operatie van de patiënt worden gebruikt, evenals de noodzaak van aanvullende oordelen van de patholoog nadat de tumorweefsels zijn verkregen. Bovendien, hoewel organoïden de heterogeniteit van HCC zouden repliceren, is het een uitdaging om te onderscheiden of een organoïde in kweek afkomstig is van een enkele celkloon of een mix van cellen met verschillende genetische profielen omvat. Daarom is verder onderzoek noodzakelijk om ons begrip van de klonale dynamiek en genetische diversiteit binnen HCC-organoïden te vergroten. Bovendien is het absoluut noodzakelijk om de inherente beperkingen van de huidige plaatgebaseerde organoïdekweektechnieken aan te pakken. Een opvallende beperking is het beperkte groeipotentieel van organoïden. Door HCC-organoïden te kweken met behulp van dit protocol is het mogelijk om diameters van meer dan 1.000 μm te bereiken. In de latere stadia van de kweek treedt echter vaak zwartgeblakerde necrose op in het kerngebied van de organoïde, als gevolg van onvoldoende toevoer van voedingsstoffen en zuurstof, wat het ontwikkelingspotentieel van de organoïden beperkt. Daarom is er dringend behoefte aan strategieën die gericht zijn op het verbeteren van de afgifte van voedingsstoffen en de oxygenatie binnen het organoïdekweeksysteem.
Samenvattend bieden van patiënten afgeleide organoïdemodellen opmerkelijke voordelen bij het nauwkeurig reproduceren van de biologische kenmerken van HCC. Desalniettemin zijn er nog steeds obstakels die moeten worden overwonnen met betrekking tot de werkzaamheid van het opzetten van organoïden, klonale dynamiek en de beperkingen die inherent zijn aan organoïdekweektechnieken. Door deze uitdagingen aan te pakken, kan het nut van HCC-organoïdemodellen voor het begrijpen van de ziekte en het bevorderen van de ontwikkeling van geneesmiddelen verder worden vergroot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82122048; 82003773; 82203380) en Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A.
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A.
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
