Summary
אנו מספקים סקירה מקיפה וחידוד של פרוטוקולים קיימים ליצירת אורגנואידים של קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), המקיפים את כל שלבי גידול האורגנואידים. מערכת זו משמשת מודל רב ערך לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהערכת יעילות התרופה המועמדת לתרופה.
Abstract
קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא גידול נפוץ וקטלני ביותר ברחבי העולם וגילויו המאוחר והיעדר חומרים טיפוליים ספציפיים יעילים מחייבים מחקר נוסף על הפתוגנזה והטיפול בו. אורגנואידים, מודל חדשני הדומה מאוד לרקמת גידול מקומית וניתן לתרבית במבחנה, זכה להתעניינות רבה בשנים האחרונות, עם דיווחים רבים על פיתוח מודלים אורגנואידים לסרטן הכבד. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה מוצלחת של ההליך וביססנו פרוטוקול תרבית המאפשר היווצרות אורגנואידים HCC גדולים יותר עם תנאי מעבר ותרבית יציבים. תיארנו באופן מקיף כל שלב בהליך, המכסה את כל התהליך של דיסוציאציה של רקמות HCC, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה, וסיפקנו אמצעי זהירות מפורטים במאמר זה. אורגנואידים אלה מפגינים דמיון גנטי לרקמות HCC המקוריות וניתן להשתמש בהם ליישומים מגוונים, כולל זיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות לגידולים ופיתוח תרופות לאחר מכן.
Introduction
קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), גידול נפוץ ומגוון1, זכה לתשומת לב רבה בקהילה הרפואית. נוכחותה של פלסטיות שושלת והטרוגניות משמעותית ב-HCC מצביעה על כך שתאי גידול שמקורם בחולים שונים ואף בנגעים מובחנים בתוך אותו מטופל עשויים להפגין תכונות מולקולריות ופנוטיפיות שונות, ובכך להציב מכשולים עצומים בקידום גישות טיפוליות חדשניות 2,3,4,5 . כתוצאה מכך, יש צורך הכרחי בהבנה משופרת של התכונות והמנגנונים הביולוגיים של עמידות לתרופות ב- HCC כדי ליידע את הניסוח של אסטרטגיות טיפול יעילות יותר.
בעשורים האחרונים, חוקרים הקדישו את מאמציהם לפיתוח מודלים חוץ גופיים לצורך חקר HCC 3,4. למרות התקדמות מסוימת, המגבלות נמשכות. מודלים אלה מקיפים מגוון טכניקות, כגון ניצול קווי תאים, תאים ראשוניים וקסנוגרפטים שמקורם במטופל (PDX). קווי תאים משמשים כמודלים במבחנה לתרבית ארוכת טווח של תאי גידול המתקבלים מחולי HCC, ומציעים את היתרונות של נוחות והרחבה קלה. מודלים של תאים ראשוניים כוללים בידוד ישיר ותרבית של תאי גידול ראשוניים מרקמות הגידול של המטופל, ובכך מספקים ייצוג של מאפיינים ביולוגיים הדומים מאוד לאלה של החולים עצמם. מודלים של PDX כוללים השתלה של רקמות גידול של חולים בעכברים, במטרה לדמות בצורה נאמנה יותר את צמיחת הגידול ואת תגובתו. מודלים אלה סייעו במחקר HCC, אך יש להם מגבלות מסוימות, כולל ההטרוגניות של קווי תאים וחוסר היכולת לשכפל באופן מלא בתנאי vivo. יתר על כן, גידול מבחנה ממושך עלול לגרום להידרדרות המאפיינים והתפקודים המקוריים של התאים, מה שמציב אתגרים בייצוג מדויק של התכונות הביולוגיות של HCC. בנוסף, השימוש בדגמי PDX גוזל זמן ויקר3.
כדי להתמודד עם מגבלות אלה ולשכפל בצורה מדויקת יותר את התכונות הפיזיולוגיות של HCC, השימוש בטכנולוגיית אורגנואידים הוצג כפלטפורמת מחקר מבטיחה המסוגלת להתעלות על אילוצים קודמים. לאורגנואידים, שהם מודלים תלת-ממדיים של תאים בתרבית חוץ גופית, יש את היכולת לשכפל את המבנה והפונקציונליות של איברים בפועל. עם זאת, בהקשר של HCC, קיימים אתגרים מסוימים בהקמת מודלים אורגנואידים. אתגרים אלה כוללים תיאורים לא מפורטים מספיק של הליכי בניית אורגנואידים של HCC, היעדר פרוטוקולים מקיפים לכל התהליך של בניית אורגנואידים של HCC, והגודל הקטן בדרך כלל של אורגנואידים בתרבית 6,7,8. לאור הממדים המוגבלים בדרך כלל של אורגנואידים מתורבתים, השתדלנו להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות פיתוח פרוטוקול מקיף המקיף את כל מבנה האורגנואידים של HCC6. פרוטוקול זה כולל דיסוציאציה של רקמות, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה. על ידי אופטימיזציה של הצעדים הפרוצדורליים ושכלול הרכב מדיום התרבות, ביססנו בהצלחה מודלים אורגנואידים של HCC המסוגלים לצמיחה מתמשכת ומעבר ארוך טווח 6,8. בפרקים הבאים יוצג תיאור מקיף של המורכבויות התפעוליות והגורמים הרלוונטיים המעורבים בבניית אורגנואידים של HCC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמות ביופסיה אנושית התקבלו מהמטופל בהתאמה בבית החולים לסרטן המסונף ובמכון של האוניברסיטה הרפואית גואנגז'ו, והתקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. קביעת אורגנואידים HCC שמקורם במטופל מדגימות כירורגיות
הערה: הקמת אורגנואידים HCC מקיפה שלבים שונים, כלומר דיסוציאציה של רקמות, ציפוי אורגנואידים, תרבית, מעבר, שימור בהקפאה והחייאה. תהליך הדיסוציאציה של רקמות דורש משך של שעתיים, בעוד שזריעת אורגנואידים על צלחת אורכת כ-40 דקות. לאחר מכן, הדור הראשוני של אורגנואידים HCC עובר תקופת תרבית של 10-14 ימים באמצעות מדיום בידוד HCC. ברגע שמושגת צפיפות משביעת רצון, מתבצעים מעברי אורגנואידים, הדורשים שעה אחת. תרביות עוקבות של האורגנואידים נשמרות לאחר מכן באמצעות מדיום הרחבת HCC למשך 7-10 ימים, אשר עשויים להשתנות בהתאם לקצב הצמיחה ומצב האורגנואידים.
- דיסוציאציה של רקמות
- הכנת אספקה וחומרים
- לאסוף 1-2 ס"מ3 מרקמת HCC מחולים שלא קיבלו טיפול מקומי או סיסטמי קודם לפני הניתוח. לאחר כריתה כירורגית, יש לשמור את הרקמה בטמפרטורה של 4°C בתמיסת שימור רקמות (טבלה 1) עד לעיבוד.
הערה: דגימות רקמה טריות באיכות גבוהה חיוניות להקמה מוצלחת של אורגנואידים. חשוב לעבד דגימות באופן מיידי, רצוי תוך 1-4 שעות לאחר כריתה כירורגית כדי לשמור על כדאיות הרקמות. בצע את כל ההליכים הבאים בסביבה אספטית באמצעות חומרים סטריליים וריאגנטים. - חממו מראש לוחות תרבית תאי שטח חיבור נמוכים במיוחד (24 בארות) למשך שעה אחת באינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס. הפשירו את תמצית קרום המרתף הקפואה (BME) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C צלזיוס עד ממש לפני השימוש.
הערה: כדי להבטיח הפשרה מלאה של BME, יש להניח אותו על קרח למשך 3 שעות לפחות. התכה מלאה של BME חיונית לתרבית אורגנואידים מוצלחת בשלבים הבאים. - לפני השימוש, ודא שתמיסת העיכול (טבלה 1) מחוממת לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: הכינו את תמיסת העיכול טרייה בסביבה אספטית והשתמשו בה מיד.
- לאסוף 1-2 ס"מ3 מרקמת HCC מחולים שלא קיבלו טיפול מקומי או סיסטמי קודם לפני הניתוח. לאחר כריתה כירורגית, יש לשמור את הרקמה בטמפרטורה של 4°C בתמיסת שימור רקמות (טבלה 1) עד לעיבוד.
- זרימת עיבוד ארגונית
- בארון זרימה למינרית, חותכים את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (0.5-1 מ"מ3) באמצעות מספריים כירורגיים על צלחת פטרי. העבר את הרקמה החתוכה לצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסף 5-10 מ"ל של מדיום בסיסי (טבלה 1).
הערה: ניתן לאחסן את המדיום הבסיסי (טבלה 1) ב-4°C למשך עד חודש אחד. - השתמשו בפיפט ברוטרופי כדי לשטוף כמה שיותר דם ותנו לו לעמוד 1-2 דקות כדי להסיר חלק מהסופרנטנט, כולל תאי דם וקרישי שומן צפים. חזור על הליך זה פעמיים.
- צנטריפוגות את התערובת ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ובזהירות להסיר את supernatant. הוסף 5 מ"ל של תמיסת העיכול המחוממת מראש (טבלה 1) לרקמה החתוכה.
- סובב את הצינור ב 37 ° C לעיכול.
- לאחר 30 דקות של עיכול ראשוני, לחפש אשכולות קטנים של תאים מתחת למיקרוסקופ. בדוק כל 5-10 דקות כדי למנוע עיכול יתר.
הערה: הזמן הדרוש לעיכול רקמות יהיה תלוי בגודל ובסוג הרקמה. עיכול רקמות לא יעלה על 90 דקות. רקמה מעוכלת יתר תופיע מתחת למיקרוסקופ כיריעה גדולה של תאים בודדים. רמת העיכול המתאימה מסומנת על ידי העובדה כי רוב אלה הם אשכולות תאים ויש להם מראה דמוי ענבים. - עצור את העיכול על-ידי הוספת מדיום בסיסי קר (טבלה 1) וסנן לתוך צינור חדש של 50 מ"ל עם מסנן תאים של 100 מיקרומטר. מוסיפים מדיום בסיסי קר לנפח של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה את התאים ב 2 × גרם במשך 10 דקות ב 8 ° C. הסר בזהירות את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה על-ידי הוספת 50 מ"ל נוספים של מדיום בסיסי קר (טבלה 1). חזור על שלב זה פעמיים.
הערה: צנטריפוגה במהירות נמוכה משמשת כדי לאפשר לצברי תאים קטנים להתיישב, בעוד תאי דם ופסולת תאים עדיין מרחפים בסופרנטנט; התהליך חוזר על עצמו מספר פעמים כדי להשיג מסת תאי רקמה טהורה יחסית.
- בארון זרימה למינרית, חותכים את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (0.5-1 מ"מ3) באמצעות מספריים כירורגיים על צלחת פטרי. העבר את הרקמה החתוכה לצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסף 5-10 מ"ל של מדיום בסיסי (טבלה 1).
- הכנת אספקה וחומרים
- ציפוי אורגנואיד
- לאחר השטיפה השנייה, מוציאים כמה שיותר מהסופרנאטנט ומשהים מחדש את מספר התאים הרצוי (1,000-5,000 תאים לבאר של צלחת בת 24 בארות) ב-BME המתאים לציפוי.
הערה: יש לשמור תמיד את ה-BME על 4°C לפני השימוש. - הוסף BME והשהה אשכולות תאים קטנים ב- DMEM/F-12 מתקדם על-ידי הוספת BME ופיפטציה עדינה למעלה ולמטה עד לצברי התאים מושהים לחלוטין. לשלוט על ריכוז BME בין 30% ל 50%.
- זרע 50 μL טיפות BME מעורבב עם אשכולות תאים במרכז לוחות תרבית 24 בארות.
הערה: ככל האפשר, אל תתנו לטיפות להתפשט לדופן הדופן של צלחת הבאר. דופן לוחית הספיחה הנמוכה אינה במצב ספיחה נמוכה, ומגע בין הטיפות לדופן יוביל להידבקות, שאינה תורמת לדגירת ההמשך לאחר מכן. - אפשר ללוחות עם הטיפות הנוספות להתמצק ב-37°C למשך 20 דקות. בסוף הדגירה מוסיפים 500 מיקרוליטר של מדיום שחומם מראש (טבלה 1) לכל באר ודגרים באינקובטור תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר השטיפה השנייה, מוציאים כמה שיותר מהסופרנאטנט ומשהים מחדש את מספר התאים הרצוי (1,000-5,000 תאים לבאר של צלחת בת 24 בארות) ב-BME המתאים לציפוי.
- תרבית אורגנואידים
- רעננו את מדיום התרבות (טבלה 1) אחת ליומיים-שלושה. בתחילת התרבית, תרבית את אורגנואידי HCC בתווך בידוד HCC (טבלה 1) במשך שבועיים.
- לאחר שבועיים של דגירה עם מדיום בידוד HCC, החלף את המדיום בתווך הרחבת אורגנואיד HCC (טבלה 1) (מאוחסן ב -4 ° C למשך עד שבועיים).
- רעננו את מדיום התרבות אחת ל-3 ימים.
- לאחר 7-10 ימים של תרבית עם מדיום התפשטות HCC כאשר האורגנואיד הגיע לצפיפות או לגודל המתאימים, התחל התערבויות ניסיוניות או מעבר או ליופיליזציה של האורגנואידים לפי הצורך.
- מעבר אורגנואיד
- הכנת אספקה וחומרים
- חממו מראש לוחות תרבית תאי שטח חיבור נמוכים במיוחד (24 בארות) למשך שעה אחת באינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס. הפשירו BME קפוא למשך הלילה ב-4°C צלזיוס עד ממש לפני השימוש.
- יש לחמם מראש את תמיסת קציר האורגנואידים ולהחליף טריפסין בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
- תהליך מעבר
- לאחר הסרת מדיום התרבית מצלחת הבאר, מעבירים את מתלה האורגנואיד לצינור 15 מ"ל.
- הוסף תמיסת קציר אורגנואידים בהתאם לכמות BME (500 μL של תמיסת קציר אורגנואידים לכל 50 μL של BME) על ידי גירוד ו pipeting למעלה ולמטה באמצעות אקדח פיפטה 1,000 μL.
הערה: הימנע מבועות אוויר לאורך כל התהליך כדי למנוע אובדן אורגנואידים מכיוון שנוכחות של בועות אוויר מצביעה על לחץ פיפטינג גבוה יותר. - יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו בעדינות את ה-BME עם פיפטה של 1,000 μL ושימו לב שה-BME מומס לחלוטין. התבוננו כל 10 דקות עד שנצפה צביר תאי אורגנואיד ברור, ואז צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר והוציאו כמה שיותר מהסופרנאטנט.
הערה: בשלב זה ניתן להקפיא ולשמר את האורגנואיד. - לעיכול אנזימטי של אורגנואידים, יש להוסיף 1-5 מ"ל של תחליף טריפסין (בהתאם למספר האורגנואידים) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות. התבונן תחת המיקרוסקופ את מידת העיכול האנזימטי כדי לקבוע אם האורגנואידים מתפרקים לאשכולות קטנים של 2-10 תאים; אם לא, להמשיך את העיכול האנזימטי.
הערה: עיכול יתר יגרום לליזה של צבירי תאים אורגנואידים לתאים בודדים, מה שיפחית את יכולת הקיום שלהם ויאריך את זמן התרבית שלאחר מכן. - הוסף את הנפח המתאים של מדיום בסיסי קר (טבלה 1) כדי לעצור את העיכול.
- צנטריפוגה אורגנואידים ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 8 °C (8 °F); הסר את הסופרנאטנט ככל האפשר.
- השהה מחדש את מספר האורגנואידים הרצוי (1,000-5,000 אורגנואידים לבאר של צלחת בת 24 בארות) במטריצה המתאימה לציפוי. בצע את אותם השלבים כמו בסעיף 1.2.
הערה: צפיפות הציפוי צריכה להיות אופטימלית בהתאם לקצב הגידול והגודל של האורגנואידים. - עברו את האורגנואידים כל 10 ימים ביחס של 1:3 או 1:4 בהתאם לצפיפות גדילת האורגנואידים.
- הכנת אספקה וחומרים
- שימור והחייאה בהקפאה אורגנואידית
- שימור בהקפאה של אורגנואידים
- הכינו צינורות ליופיליזציה, כל צינור נפגש עם שתי בארות של צלחת 24 בארות המכילה אורגנואידים.
- בצע את השלבים 1.4.2.1 עד 1.4.2.4 עבור מעבר אורגנואידים לקבלת אורגנואידים ללא BME, והשהה מחדש בעדינות את האורגנואידים על ידי הוספת 500 μL / well של תמיסת ליופיליזציה אורגנואידית לצלחת של 24 בארות.
הערה: בהתאם למצב הגידול והגודל של האורגנואידים, מומלץ לשמר בהקפאה את האורגנואידים בתרבית עד הדור השלישי. - מעבירים את המתלה לצינורות ליופיליזציה ומניחים אותו בקופסה מקוררת הדרגתית בטמפרטורה של -80°C. לאחר קירור הדרגתי בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות לפחות, העבירו את הצינורות לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
- החייאה של אורגנואידים
- יש לדגור על צינורות ליופיליים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולהפסיק את הדגירה כאשר נותר רק גוש קרח קטן.
- צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 8 ° C כדי להסיר את supernatant לחלוטין.
- בצע את סעיפים 1.2 ו- 1.3 עבור הפעולות הבאות.
- שימור בהקפאה של אורגנואידים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם יישום ההליך הנ"ל, ניתן בדרך כלל להבחין בהופעתם של ספרואידים אורגנואידים HCC בטווח של 3 ימים (איור 1). איור 1A,B מראה את אורגנואיד HCC מבוסס, אשר מפתח מיד ספרואידים קומפקטיים המאופיינים בקצוות מעוגלים וציטוזול חדיר ביום הראשון להקמתו. במהלך הצמיחה של אורגנואידים HCC, לשימוש בריכוזים שונים של BME היו השפעות שונות על קצב הצמיחה של האורגנואידים. תרבינו שני אורגנואידים של HCC שמקורם במטופלים ב-10%, 30%, 50% ו-100% של BME במשך 12 יום בתווך התפשטות HCC (טבלה 1) ומצאנו שה-BME היה שלם ב-30% וב-50% והאורגנואידים היו קרובים בגודלם והיו בעלי הקוטר הגדול ביותר בריכוזי BME אלה. ב-10% BME, ה-BME היה המקוטע ביותר, עם מרחב צר לגידול אורגנואידים והקוטר הקטן ביותר. ב-100% BME, ה-BME היה השלם ביותר, אך קוטר האורגנואידים היה באמצע. לכן, מומלץ לשלוט בריכוז BME של 30-50% בתרבית אורגנואידים HCC (איור 2). אורגנואיד HCC המתפשט יכול להיות מופץ ביעילות בהתאם לפרוטוקול שנקבע, ולהגיע לגודל העולה על 500 מיקרומטר בכל תרבית לאחר שלושה דורות של תרבית (איור 3). ניסויים עוקבים, כולל התערבות בתרופות וצביעה אימונוהיסטוכימית, יכולים להתבצע עם השגת גודל זה. באמצעות אסטרטגיית הטיפוח הזו, השגנו צמיחה משמעותית של אורגנואידים HCC, והגענו לגדלים העולים על 1,000 מיקרומטר בתוך תקופת תרבית של 20 יום (איור 4). צביעה אימונוהיסטוכימית הן של אורגנואידים HCC והן של רקמות גידול מזווגות, חשפה דמיון בביטוי של גנים של סמן (איור 5).
איור 1: אורגנואידים של HCC שמקורם ברקמות הניתוח של מטופלים. (A,B) תמונות מייצגות של תרביות אורגנואידים HCC חזקות ביום הראשון של הציפוי. (ג,ד) תרביות אורגנואידים HCC לאחר 5 ימים של טיפוח. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר (A,C), 250 מיקרומטר (B,D). קיצור: HCC = קרצינומה hepatocellular. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: לחקור את הצמיחה של מודלים אורגנואידים HCC בריכוזי BME שונים. אורגנואידים HCC A ו-B תורבתו באותה צפיפות שתילה במשך 12 יום ב-10%, 30%, 50% ו-100% BME באמצעות מדיום התפשטות HCC (טבלה 1). פסי קנה מידה = 1,000 מיקרומטר (A), 250 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אורגנואידים HCC בהגברה ארוכת טווח. (A,B) תמונות מייצגות של אורגנואידים HCC ביום העשירי של מעבר 8. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (A), 250 מיקרומטר (B). קיצור: HCC = קרצינומה hepatocellular. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הגודל המרבי של אורגנואידים HCC. תמונות מייצגות של אורגנואידים HCC בתקופת תרבית של 20 יום בקטע 8 . סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מאפיינים היסטופתולוגיים של אורגנואידים HCC ורקמות גידול זוגיות. ביטוי של סמנים גנטיים עבור אורגנואידים HCC ורקמות גידול זוגיות, סמן HCC AFP, סמני כבד ממוינים HNF4A ו- ALB, סמנים דוקטליים SOX9 ו- EPCAM, וסמן מרה KRT19 זוהו על ידי אימונוהיסטוכימיה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: AFP = חלבון עוברי אלפא; HNF4A = פקטור גרעיני הפטוציטים 4 אלפא; ALB = אלבומין; SOX9 = גורם תמלול SRY-Box 9; EPCAM = מולקולת הידבקות תאי אפיתל; KRT19 = קרטין 19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: הרכב מדיה ופתרונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד היתרונות הבולטים של מודלים אורגנואידים שמקורם במטופל טמון ביכולתם לשכפל נאמנה את המאפיינים הביולוגיים של גידולים, המקיפים את מבנה הרקמה ואת הנוף הגנומי. מודלים אלה מפגינים רמת דיוק יוצאת דופן ומשקפים ביעילות את ההטרוגניות וההתקדמות של גידולים, אפילו לאורך תקופות ממושכות של גידול 6,8,9. באמצעות השימוש בפרוטוקול תרבית אורגנואידים מעודן זה, ביססנו ביעילות מודלים אורגנואידים HCC שמקורם במטופל, המאפשרים צמיחה מתמשכת במבחנה, כמו גם את היכולת לשמר בהקפאה ולאחר מכן להחיות אורגנואידים כנדרש למטרות ניסוי. בהשוואה לפרוטוקולים קודמים, אורגנואידים אלה מציגים שיעורי גדילה משופרים ומסוגלים להשיג ממדים גדולים יותר בתרבות. לאחר מכן, חשפנו את האורגנואידים המבוססים היטב לתרופות מצומדות נוגדנים שמקורן במטרות אונקוגניות פוטנציאליות שנבדקו מראש, מה שהוביל לתוצאות טיפוליות בולטות התואמות את המודלים של בעלי חיים in vivo PDX10,11.
מטרת מחקר זה הייתה לשפר את החסרונות של פרוטוקולים קודמים של הקמת אורגנואידים של HCC, וכתוצאה מכך להיווצר אורגנואידים HCC גדולים יותר בתנאי מעבר ותרבית יציבים. ביצענו אופטימיזציה של ריכוז ה-BME כדי לשפר את קצב הגידול של אורגנואידים תוך הפחתת עלות הניסוי; CHIR99021 הוסיף גורם חשוב לנוסחת התרבית המקורית, שיכול לקדם את ההתחדשות העצמית של תאי גזע באורגנואידים ולהגביר את התפשטות האורגנואידים; שיפר את שיטת ההסרה של BME, משיטת ההפרדה המכנית המקורית לשימוש בתמיסת קציר מיוחדת, כדי להגדיל את כמות האורגנואיד המתקבל ולשפר את היעילות; השלים את שלבי הפעולה של שימור והחייאה של אורגנואידים, בנה את כל התהליך של תרבית אורגנואידים HCC. עם פרוטוקול תרבית אורגנואידים זה, ניתן להשיג גודל אורגנואיד ממוצע של 800 מיקרומטר בתקופת תרבית אחת של 20 יום, עם כמה אורגנואידים HCC חזקים הגדלים ליותר מ-1,000 מיקרומטר. המטרה הסופית היא לשפר את הדיוק של אסטרטגיות הטיפול עבור HCC ולהקים מודל אמין ופלטפורמה לפיתוח תרופות. מאמצים אלה יתרמו לשיפור שיעורי ההישרדות של חולי HCC ולמתן פתרונות חדשניים למאבק באתגרי העמידות לתרופות 11,12,13.
עם זאת, חובה לתת את הדעת על היבטים רבים של השיח. בראש ובראשונה, מכשול משמעותי נובע מהיעילות המופחתת של הקמת אורגנואידים של HCC, במיוחד עבור חולים בחולים עם HCC בשלב בינוני עד מתקדם שעברו התערבויות טיפוליות מגוונות, כולל כימואמבוליזציה עורקית טרנסקטטרית (TACE), כימותרפיה וטיפול ממוקד 4,5. לעתים קרובות, פעילות הגידול של דגימות HCC שנכרתו נפגעת, מה שמוביל לירידה בשיעור ההצלחה ביצירת אורגנואידים. בינתיים, בהקמה הקודמת של אורגנואידים HCC על ידי צוותים אחרים, נמצא כי קיים מתאם בין שיעור התאים המתרבים בגידול, דרגת ההתמיינות של הגידול והקמת אורגנואידים 6,9. לפיכך, השגת אחוזי הצלחה גבוהים בפיתוח אורגנואידים HCC קשורה באופן מורכב לטיפולים שננקטו לפני הניתוח של המטופל, כמו גם לצורך בשיפוט משלים של הפתולוג לאחר קבלת רקמות הגידול. בנוסף, בעוד אורגנואידים מתיימרים לשכפל את ההטרוגניות של HCC, ההבחנה אם אורגנואיד בתרבית מקורו בשיבוט של תא בודד או כולל תערובת של תאים עם פרופילים גנטיים מובחנים מהווה אתגר. כתוצאה מכך, חקירות נוספות הכרחיות כדי להרחיב את הבנתנו את הדינמיקה השבטית ואת המגוון הגנטי בתוך אורגנואידים HCC. יתר על כן, הכרחי להתייחס למגבלות הטבועות בטכניקות הנוכחיות של תרביות אורגנואידים מבוססות צלחות. אילוץ בולט אחד הוא פוטנציאל הצמיחה המוגבל של אורגנואידים. התרבית של אורגנואידים HCC באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להשיג קטרים של יותר מ -1,000 מיקרומטר. עם זאת, בשלבים מאוחרים יותר של התרבית, נמק מושחר מתרחש לעתים קרובות באזור הליבה של האורגנואידים, בשל אספקת מספיק חומרים מזינים וחמצן, מה שמגביל את פוטנציאל הפיתוח של האורגנואידים. לכן, יש צורך דחוף לתכנן אסטרטגיות שמטרתן לשפר את אספקת החומרים המזינים ואת חמצון בתוך מערכת תרבית אורגנואידים.
לסיכום, מודלים אורגנואידים שמקורם במטופל מציגים יתרונות בולטים בשחזור מדויק של התכונות הביולוגיות של HCC. עם זאת, ישנם עדיין מכשולים שיש להתגבר עליהם בנוגע ליעילות של יצירת אורגנואידים, דינמיקה של שבטים, והמגבלות הטבועות בטכניקות של תרבית אורגנואידים. על ידי התמודדות עם אתגרים אלה, ניתן להרחיב עוד יותר את התועלת של מודלים אורגנואידים של HCC להבנת המחלה ולקידום מאמצי פיתוח תרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82122048; 82003773; 82203380) וקרן המחקר הבסיסית והיישומית גואנגדונג (2023A1515011416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
References
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A.
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A.
- Yang, J. D., et al. A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).
- Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma. Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).
- Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
- Liu, M., et al. A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).
- Kong, F. E., et al. Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate. Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).
- Li, M. M., et al. Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma. STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).
- Li, M., et al. Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. Hepatoma Research. 8, 36 (2022).
