L'adhésion des plaquettes et l'agrégation sous flux en utilisant des cellules de débit microfluidique

Le système de flux biologique est un instrument automatisé et un dispositif microfluidique permettant d’effectuer des tests sur cellules vivantes sous un flux contrôlé. Ce système utilise la technologie microfluidique des plaques à puits pour intégrer des dispositifs de cellules d’écoulement à l’échelle du micron dans les plaques à puits standard SBS. BioFlex peut être utilisé pour mener des études d’adhésion et d’agrégation plaquettaires avec un débit élevé et des volumes sanguins réduits.

Le sang total marqué avec un colorant fluorescent est ajouté aux puits, puis circule dans les canaux. Dans un flux pur contrôlé, des données de microscopie à haute résolution sont produites, qui quantifient l’adhésion et l’agrégation plaquettaires en présence de composés médicamenteux et d’autres paramètres variables. Bonjour, je suis Mike Schwartz du laboratoire RD de Flexion Biosciences.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’utilisation des cellules d’écoulement microfluidique dans les tests d’adhésion plaquettaire. Nous utilisons ce protocole dans notre laboratoire pour une variété de tests de biologie vasculaire. Alors commençons.

Bœuf, avant d’exécuter l’expérience de la cellule d’écoulement, les canaux microfluidiques de la plaque de flux biologique doivent être préparés avec un enrobage protéique d’intérêt collagène qui sera utilisé dans cette expérience. Chacun des 24 canaux expérimentaux de la plaque de flux biologique se connecte à un puits d’entrée et à un puits de sortie pour cette plaque. Le puits d’entrée est le puits gauche alimentant le canal et le puits de sortie est à droite, diluez le collagène d’un stock à une concentration de 200 microgrammes par millilitre.

Dans l’acide acétique 0,02 molaire, 20 microlitres seront nécessaires pour chaque canal utilisé. Étant donné que cette expérience nécessite 11 canaux, faites 200 microlitres de revêtement de collagène. Un canal reste non couché mélangé par itération douce avec une pointe de micro-pipette.

Ajoutez 20 microlitres de revêtement à chaque canal respectif à l’aide d’une micro-pipette pour distribuer le liquide dans le poinçon intérieur du puits. L’alimentation du canal microfluidique d’intérêt, comme indiqué ici avec le colorant jaune, comprend un canal sans collagène comme contrôle négatif de l’adhésion et de l’agrégation plaquettaires. Une fois que le revêtement de collagène a été ajouté à tous les canaux respectifs, fixez l’interface à la plaque.

Si vous utilisez l’interface bio flux 1000, vous pouvez fixer les deux loquets sur la scène. Si vous utilisez l’interface Bio flux 200 avec le premier doigt, serrez les quatre vis. Et puis une fois qu’ils sont tous prêts, utilisez le tournevis dynamométrique pour serrer complètement.

Le tournevis dynamométrique s’enclenche lorsqu’il atteint le maximum. En utilisant le mode manuel dans le logiciel de bio flux, appliquez la perfusion sur les canaux d’intérêt à 2D par centimètre carré de la sortie. Eh bien, utilisez un objectif de faible puissance sur un microscope pour trouver le puits d’entrée et observez le poinçon intérieur opposé être rempli de liquide.

Vous devriez d’abord voir un petit être de liquide, remplissant lentement le poinçon intérieur après plusieurs minutes et lorsque le poinçon intérieur d’entrée est rempli, arrêtez la profusion sur tous les canaux en appuyant sur stop dans le logiciel. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure. Pendant cette période d’incubation, vous pouvez commencer à préparer le sang entier à la fin de l’incubation d’une heure.

Une fois le sang préparé, retirez l’interface et ajoutez un millilitre de PBS plus des ions calcium et magnésium dans la sortie. Eh bien, commencez la profusion à partir du puits de sortie à deux dines par centimètre carré et continuez la profusion pendant 10 minutes. Après 10 minutes, arrêtez la profusion Après avoir retiré l’interface, retirez l’excès de PBS des puits d’entrée et de sortie.

Ne retirez jamais le liquide qui remplit le poinçon intérieur. Pour bloquer les canaux, ajoutez un millilitre de solution de blocage à chaque sortie. Bien à utiliser, perfuser à partir de la sortie à deux dine par centimètre carré et continuer la perfusion pendant 10 minutes.

Arrêtez la profusion au bout de 10 minutes et retirez l’interface. Les canaux sont maintenant prêts et peuvent être utilisés tout au long de la journée pendant que la plaque est recouverte de collagène. Au cours d’une incubation d’une heure, du sang humain frais d’un individu à jeun doit être préparé pour l’imagerie et l’écoulement dans la plaque.

Le sang doit être prélevé dans du citrate de sodium, un anticoagulant, et utilisé dans les trois heures suivant le prélèvement. Tout d’abord, ajoutez un stock de quatre millimolaires de calcium M dans le DMSO dans le sang à une dilution de un à 1000 volume par volume. Pour obtenir quatre micromolaires de calcium, je suis mélangé par inversion douce.

Ensuite, distribuez un millilitre du sang marqué au calcium dans dix microtubes d’un virgule cinq millilitres. Ajouter l’anticorps inhibiteur GP deux B trois a dans chaque tube à la dilution souhaitée. Assurez-vous d’inclure un contrôle négatif sans anticorps et un contrôle positif sans anticorps non apparenté mélangé par inversion douce.

Incuber les tubes à température ambiante pendant une heure en les mélangeant par inversion douce toutes les 10 minutes avant d’exécuter l’expérience de la cellule d’écoulement. Un protocole automatisé doit être mis en place dans le module de contrôle des flux biologiques pour le collagène. Un. Mettez en place un protocole pour faire couler le sang à dix neuf centimètres carrés pendant 10 minutes à partir de la sortie.

Eh bien, à l’aide de la station de travail BioFlex 1000, les paramètres d’acquisition de données doivent être configurés, notamment l’acquisition des positions de scène souhaitées dans la longueur d’onde fitz et le réglage time-lapse. Un plan d’acquisition d’images typique pour ce protocole comprendrait un champ de vision par canal à capturer à l’aide d’un objectif 10x toutes les 30 secondes pendant une durée totale de 10 minutes. Des champs de vision supplémentaires et d’autres paramètres TimeLapse sont également possibles.

Une fois le protocole automatisé et les paramètres d’acquisition de données configurés, retournez sur la plaque BioFlex et retirez le liquide des deux côtés du canal, à l’exception des poinçons intérieurs. En prenant soin de travailler rapidement, placez 500 microlitres de sang de chaque condition dans les puits de sortie de chaque canal. Notez que les puits de sortie sont utilisés pour livrer le sang car il s’agit du chemin le plus court vers la zone d’observation et fournira une réaction plus immédiate du sang à l’enrobage de collagène.

De plus, placez le sang de contrôle sans anticorps dans un canal recouvert de collagène et qui est simplement bloqué. Placez la plaque sur le microscope de poste de travail BioFlex 1000 et fixez-la sur l’interface. Effectuez l’étalonnage de la liste d’étapes en localisant le premier point d’étalonnage défini comme l’origine.

Localisez et marquez ensuite le deuxième point d’étalonnage. Appliquez ce calibrage à la liste d’étapes appropriée. Cela garantit que tous les emplacements de visualisation sur la plaque peuvent être trouvés automatiquement.

Déplacez la platine vers l’un des canaux contenant le sang set set ajustements e paramètres de capture d’image tels que le temps d’exposition et le gain dans le logiciel de montage BioFlex. Lancez le flux de travail approprié en cliquant sur le bouton souhaité. Cela lancera simultanément le protocole de flux et l’acquisition d’images.

À la fin de l’expérience, retirez la plaque du poste de travail BIOFLU 1000 et jetez-la conformément aux directives de l’établissement. Utilisation de canaux microfluidiques enrobés de collagène du système de flux biologique. Une formation agressive de thrombus est observée au fil du temps avec l’échantillon de sang témoin non traité.

En revanche, aucune formation de thrombus n’est observée avec le canal non revêtu. Dans une expérience récemment réalisée, la taille moyenne des agrégats dans des conditions de contrôle était de 2000 micromètres carrés. GP deux B trois A est un puissant médiateur des interactions plaquettaires et de la stabilisation de l’agrégation lorsqu’il est activé par l’adhésion au collagène comme montré ici après l’incubation avec un anticorps anti GB deux B trois a pendant une heure avant l’exposition pure, une diminution de la taille des thrombus ainsi qu’une diminution de la fréquence de formation de thrombus est observée.

Une réponse dose-dépendante peut généralement être observée à dix neuf centimètres carrés et la valeur IC 50 pour cet inhibiteur particulier était de 17 nanomolaires. L’inhibition maximale pour ce donneur par rapport au témoin sans anticorps était de 11 % à 10 dine centimètre carré. Une plaque de cisaillement de 48 puits de haut est également disponible pour effectuer des expériences sur le sang total jusqu’à 200 D par centimètre carré ou 5 000 secondes inverses.

Nous venons de vous montrer comment utiliser les canaux d’écoulement microfluidique pour mener des expériences de biologie vasculaire physiologiquement pertinentes. Lors de ce protocole, il est important de ne pas oublier de diluer le collagène dans le bon tampon. Utilisez toujours la bonne technique de pipetage pour éviter d’introduire des bulles d’air et respectez toujours les réglementations de biosécurité de votre laboratoire.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.