La transgénèse Zebrafish Mosaic pour évaluer des séquences Enhancer

Bonjour, je m’appelle Erica Kgi et je travaille dans le laboratoire de Shannon Fisher au Département de biologie cellulaire et du développement de l’Université de Pennsylvanie. Je m’appelle Chris Weber et je travaille également au Fisher Lab. Et je m’appelle Shannon Fisher.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’analyse de la fonction des éléments amplificateurs à l’aide de la transgenèse du poisson-zèbre. Nous utilisons cette procédure pour étudier les régulations transcriptionnelles des gènes importants dans le développement du squelette. Alors commençons.

Pour identifier les séquences non codantes entourant les gènes candidats, nous utilisons l’algorithme fast cons, qui est accessible sous forme de piste sur le navigateur génomique uc SC. Nous nous intéressons principalement aux gènes exprimés au cours du développement squelettique, mais la même approche peut être utilisée pour étudier tous les gènes exprimés au cours du développement précoce. Dans l’exemple présenté ici, nous avons identifié des séquences conservées.

Dans l’intervalle entourant le gène du pare-chocs humain, nous examinons l’ensemble de l’intervalle jusqu’aux gènes adjacents et déterminons un seuil de score logarithmique spécifique de faible taille correspondant à environ les 5 % supérieurs de la séquence non codante. Après avoir sélectionné les séquences, concevez des amorces à l’aide de l’amorce trois pour amplifier chaque séquence de génomique humaine, des amorces d’ADN doivent être sélectionnées pour amplifier la région conservée plus 30 paires de bases ou plus de chaque côté. Amplifiez la région d’intérêt avec une polymérase de haute qualité à l’aide d’ADN génomique humain, utilisez des procédures standard de biologie moléculaire en laboratoire pour cloner le produit amplifié en un vecteur d’expression.

Le vecteur utilisé dans ce protocole est la passerelle GFPA PG wc FOS. Vecteur de destination. Suite à la création du vecteur, il est dit de transposer.

L’enzyme nécessaire à la transposition est d’abord transcrite in vitro à l’aide du kit machine M message M d’Ambion et du plasmide PGB 600 avant les injections expérimentales. Testez l’efficacité de chaque lot de transposes en injectant un activateur connu tel que les chaussettes de souris. 10 amplificateur.

Pour préparer les injections, tirez les aiguilles utilisées pour la micro-injection dans un verre capillaire à filament de 1,2 millimètre de diamètre extérieur sur un extracteur de micropipettes Sutter P 97. Utilisez un programme qui donne une pointe forte avec un cône pointu pour pénétrer les corion intacts avec une lame de rasoir propre et une lame micrométrique. Cassez les pointes à la main sous un stéréomicroscope jusqu’à un diamètre extérieur d’environ 15 micromètres.

Les aiguilles peuvent être stockées pendant une journée dans un plat de maintien couvert. Maintenir la population de poissons-zèbres sur un cycle régulier de lumière et d’obscurité avec 14 heures de lumière dans des conditions standard la veille des micro-injections. Préparez les poissons pour des accouplements chronométrés dans de petits bassins d’élevage.

Placez trois femelles ou deux mâles par réservoir en rangées parallèles le matin des micro-injections, peu de temps après le début du cycle de lumière. Combiner les mâles et les femelles dans de l’eau traitée propre pour la production d’œufs. Vérifiez fréquemment le poisson et collectez les œufs quelques minutes après la production pour obtenir des lots bien synchronisés.

Maintenez la production d’œufs pendant deux à trois heures en continuant à combiner des groupes de poissons frais tout au long de la matinée avec une pipette en verre de cinq pouces et quart de large équipée d’une poire en latex. Triez les embryons collectés dans des boîtes de Pétri de 60 x 15 millimètres, partiellement remplies de milieu embryonnaire par groupes de 50 embryons. Marquez le temps recueilli sur le couvercle de chaque plat.

Pour chaque couvée d’embryons collectée, conservez une boîte de 50 embryons pour le contrôle non injecté entre les collections d’œufs. Préparez des solutions d’injection fraîches en mélangeant les ingrédients suivants dans un tube de micro-fuge et conservez-les sur de la glace. Posez les aiguilles d’injection dans des plats de maintien et remplissez-les de 1,5 à deux microlitres de solution d’injection.

En pipetant des gouttes de 500 nanolitres sur l’extrémité large de chaque aiguille. Le liquide sera aspiré vers l’extrémité par capillarité. Préparez au moins deux aiguilles pour chaque solution d’injection.

Chargez l’aiguille remplie dans le porte-aiguille portatif d’une pompe pico pneumatique ou d’un injecteur de pression similaire. Configuré et connecté à un réservoir d’azote selon les instructions du fabricant. Calibrez les volumes d’injection en mesurant le diamètre des gouttelettes expulsées dans l’huile minérale sur une lame micrométrique, généralement un temps d’injection de 120 millisecondes.

Avec une pression de 20 PS, je vais produire une gouttelette d’environ un nanolitre à l’aide d’un microscope stéréoscopique à un grossissement de six à 10 x. Maintenez l’embryon en place à l’aide d’une paire de pinces fines et poussez l’aiguille d’injection avec une pression constante à travers le corion dans le jaune d’un embryon au stade d’une cellule ou au stade précoce de deux cellules, positionnez l’extrémité de l’aiguille dans le jaune juste en dessous des blastomères, expulsez environ un litre de solution d’injection et retirez l’aiguille pour chaque construction que nous injectons supérieure ou égale à 200 embryons après l’injection. Triez les embryons en enlevant les ovules non fécondés, les embryons endommagés et les injections ratées ou les embryons sans rouge de phénol dans les blasphémateurs.

Nous incubons ensuite les embryons et le milieu embryonnaire à 28,5 degrés Celsius jusqu’au moment approprié pour les observations. Nous allons maintenant vous montrer quelques résultats représentatifs d’éléments amplificateurs qui produisent des modèles spécifiques aux tissus d’expression de la GFP dans l’embryon de poisson zèbre. Nous étudions les gènes exprimés dans l’os ou le cartilage au cours de l’opération.

Voici un exemple d’un élément amplificateur en amont du gène acan qui régule l’expression dans le cartilage crânien facial trois jours après la fécondation. Voici un autre amplificateur, cette fois du gène bumper qui régule l’expression dans les cellules osseuses. À cinq jours des nombreux amplificateurs que nous avons identifiés, nous trouvons peu de corrélation entre l’emplacement par rapport au gène et la régulation de l’expression.

Lors du choix des séquences à tester, il est important de se rappeler qu’un amplificateur peut se trouver à des centaines de kilobases en amont ou en aval d’un gène ou dans l’un des introns comme on le voit chez cet embryon. Une partie substantielle des séquences ne semble pas réguler l’expression spécifique des tissus. Ceux-ci présentent souvent une très faible fluorescence ou peuvent avoir quelques cellules dispersées dans deux sites communs d’expression ectopique, l’épiderme et le muscle squelettique.

Nous venons de vous montrer comment identifier les éléments amplificateurs potentiels grâce à la conservation de séquence et tester leur fonction grâce à la transgenèse mosaïque chez le poisson zèbre. Lors de cette procédure, il est important d’examiner la qualité de votre ADN et de votre ARN pour les injections. Assurez-vous également d’examiner attentivement tous vos embryons injectés, surtout si vous ne vous attendez qu’à une expression dans un petit groupe de ventes.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.