L’accouplement et la mise en scène des ovules : une méthode pour générer des embryons et les trier par stade de développement

- Commencez par un réservoir d’accouplement, un réservoir avec un insert amovible qui permet aux œufs de tomber à travers. Ajoutez deux poissons adultes mâles et trois femelles dans un bassin d’accouplement divisé le soir avant la collecte des embryons pour s’acclimater les uns aux autres pendant la nuit.

Le lendemain matin, transférez le poisson dans un nouveau réservoir d’accouplement contenant l’eau du système et retirez le séparateur. Attendez 15 à 30 minutes pour donner au poisson le temps de s’accoupler et de frayer.

Maintenant, collectez les embryons et conservez-les dans une boîte de Pétri contenant le milieu embryonnaire de Hank. Cultivez-les à 28,5 degrés Celsius tout au long du protocole. Examinez la morphologie des embryons au microscope à dissection.

Vous observerez plusieurs caractéristiques de développement. Le clivage du blastodisque donne naissance à plusieurs cellules. Le blastoderme prend la forme d’une coupe inversée au-dessus de la cellule vitelline. Des segments de mésoderme paraxiaux se développent sur la partie dorsale de l’embryon et ainsi de suite.

Au-delà de 24 heures après la fécondation, il suffit de trier les embryons par longueur corporelle totale. Dans l’exemple de protocole, nous allons mettre en place l’accouplement de poissons rapporteurs transgéniques mCherry et trier les embryons résultants.

- Pour commencer, cultivez les embryons jusqu’à l’âge de trois mois, c’est-à-dire la maturité reproductive. Séparez deux poissons mâles adultes et trois poissons femelles de la souche désirée dans des bassins d’accouplement divisés d’eau douce la veille de la collecte des embryons. Le lendemain matin, après l’allumage des lumières, retirez le séparateur et laissez les poissons s’accoupler naturellement jusqu’à ce que des embryons soient observés au fond de l’aquarium.

Prélevez les embryons à intervalles de 30 minutes et séparez les boîtes de Pétri du milieu embryonnaire jusqu’à ce que le nombre souhaité soit collecté. Pour stadifier les embryons, cultivez-les en groupes de 50 à 75 par boîte de Pétri de 10 centimètres afin de favoriser un calendrier de développement cohérent de tous les embryons. Gardez ensuite les plaques à 28,5 degrés Celsius.

Mesurez l’âge de l’embryon à l’aide du nombre de somites après segmentation jusqu’à environ 24 heures après la fécondation, ou HPF, et séparez les embryons en fonction de l’âge de développement.