Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Un abonnement à JoVE est nécessaire pour afficher ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
תא גזע סרטן השד יחיד מעורר מקבץ של תאים הנקרא ממוספרה ראשונית. כדי להשיג אותם, התרבות הראשונה קו תאים סרטן השד עד 70% עד 80% confluent, כדי להבטיח את התאים נמצאים בשלב הצמיחה שלהם. הוסף Tripsin-EDTA כדי לנתק תאים מן הבקבוק, ולהוסיף מדיום עם סרום כדי לעצור את הפעולה של Tripsin.
עכשיו, קח את התאים בצינור וצנטריפוגה כדי להשיג את גלולת התא. Resuspend את גלולה במדיום mammosphere ללא סרום ולהעביר את ההשעיה דרך מסנן כובע מסננת התא, כדי לקבל השעיה תא יחיד. השעיה זו מורכבת מתאי גזע, תאי אב ותאים מובחנים המראים ביטויי חלבון שונים.
CD44 ו- CD24 הם חלבונים משטח התא האופייניים לתאי גזע סרטניים בשד. הם חיוביים עבור ביטוי CD44 ושלילי עבור CD24. לבודד תאים מהשעיית התא באמצעות פלואורסצנטיות או מיון תאים המופעלים מגנטית. לאחר מכן, קח כתם כחול aliquot ו ad trypan לתאים, ולחשב את מספר התאים קיימא למיליליטר באמצעות שקופית המוציטופומטר כדי למצוא את צפיפות הזריעה.
לבסוף, זרעו את התאים בצלחת חסידות נמוכה במיוחד, כך שהתאים יישארו תלויים. דגירה את הצלחת במשך 5 עד 10 ימים מבלי להפריע לצלחת עד הכדורים הם 40 מיקרון קוטר. בפרוטוקול הבא, ניצור ממוספרות ראשוניות מקו תאים של סרטן השד.
- עבודה תחת מכסה המנוע תרבות סטרילית, להתחיל הליך זה עם MCF7 או MDA-MB-231 תאים כי הם 70% כדי 80% confluent. שאף את המדיום מהבקבוקון. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן להוסיף Tripsin-EDTA ולהדגיר במשך שתיים עד שש דקות. לאחר הניתוק, להרוות על ידי הוספת מדיום mammosphere המכיל 10% FBS.
לאחר שהתאים התנתקו, העבירו אותם לצינור צנטריפוגה חרוט 15 מיליליטר וסובבו אותו 200 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. בעקבות צנטריפוגה זו לפענח את supernatant, ואז resuspended התאים באחד עד חמישה מיליליטר של מדיום ממוספרה. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לשבור את גלולת התא.
לאחר מכן, להעביר את המתלה התא 40 תא מיקרון מאמץ מסנן כובע ולאסוף את הזרימה דרך הצינור המצורף כדי לקבל השעיה תא יחיד. פיפט אלציטוט 20 מיקרוליטר של התאים resuspended על hemocytometer ולהשתמש במיקרוסקופ כדי לבחון את זה. אם אשכולות תאים נצפו כפי שניתן לראות כאן, להשתמש במזרק כדי לחלק את ההשעיה פנימה והחוצה של מחט 25 מד פעם או פעמיים.
לאחר התאים פוזרו לתוך השעיית תא יחיד כפי שמוצג כאן, להמשיך לבודד CD44 חיובי, CD24 תת-קבוצות הסלולר שלילי באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי או מיון תאים מופעל מגנטי באמצעות LS-column כדי לבחור באופן חיובי את CD44 תאים חיוביים. מכיוון שהתאים הרצויים מתחברים לקירות עמודת ה- LS, השלך את הזרימה ולאחר מכן הסר תאים מהעמודה, החל חמישה מיליליטרים של חיץ והחל ודכא את הבוכנה שסופקה עם העמודה כדי לשטוף את התאים הרצויים.
לאחר מכן, השתמש בעמודת LD כדי לטהר עוד יותר את האוכלוסיה על-ידי בחירה שלילית. כאן, התאים החיוביים CD24 לצרף את עמודות LD. אסוף את הזרימה המכילה את התאים השליליים CD24. לאחר מכן, שימוש בציטומטריית זרימה מאשר את הפנוטיפים של כל התאים המבודדים. באמצעות שיטת אי-הכללה כחולה trypan, לחשב את הצפיפות של תאים קיימא.
לאחר דילול מתאים של השעיית התא, זרע כל באר של צלחת התקשרות אולטרה-רזה עם 500 עד 4,000 תאים לריבוע סנטימטר ב 2 מיליליטר של מדיום ממוספרה מלאה. הדגירה את הצלחות מקפיד לא להפריע להם במשך 5 עד 10 ימים עד הכדורים נצפו. המשיכו לכת עד שהכדורים היו בקוטר של לפחות 40 מיקרון, אך טרם החלו להפוך לאפוטוטיים.
