प्राथमिक मैमोस्फीयर का उत्पादन: सेल शक्ति निर्धारित करने के लिए एक तकनीक

एक एकल स्तन कैंसर स्टेम सेल कोशिकाओं के एक समूह को जन्म देता है जिसे प्राथमिक मैमोस्फीयर कहा जाता है। उन्हें प्राप्त करने के लिए, पहली संस्कृति एक स्तन कैंसर सेल लाइन जब तक 70% से 80% ढुलमुल, यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को उनके विकास के चरण में हैं. फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्रिपसिन-ईडीटीए जोड़ें, और ट्रिपसिन की कार्रवाई को रोकने के लिए सीरम के साथ एक माध्यम जोड़ें।

अब, कोशिकाओं को एक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सेल पेलेट प्राप्त करने के लिए लें। सीरम के बिना मैमोस्फीयर माध्यम में गोली को फिर से रीसुस्ल करें और एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए सेल छन्नी कैप फिल्टर के माध्यम से निलंबन पारित करें। इस निलंबन में स्टेम सेल, जनक कोशिकाएं और अलग-अलग प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाने वाले विभेदित कोशिकाएं होती हैं।

CD44 और CD24 कोशिका सतह प्रोटीन स्तन कैंसर स्टेम सेल की विशेषता है। वे CD44 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक और CD24 के लिए नकारात्मक हैं। फ्लोरेसेंस या चुंबकीय सक्रिय कोशिका छंटाई का उपयोग करके कोशिका निलंबन से कोशिकाओं को अलग करें। इसके बाद, कोशिकाओं के लिए एक aliquot और विज्ञापन ट्राइपैन नीले दाग ले लो, और एक हीमोसाइटोमीटर स्लाइड का उपयोग कर मिलीलीटर प्रति व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए बोने घनत्व लगता है ।

अंत में, कोशिकाओं को छह अच्छी तरह से अल्ट्रा कम अनुयायी प्लेट में बीज करें, ताकि कोशिकाएं निलंबित रहें। प्लेट को परेशान किए बिना 5 से 10 दिनों तक प्लेट को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि गोले व्यास में 40 माइक्रोन न हों। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम स्तन कैंसर सेल लाइन से प्राथमिक मैमोस्फीयर उत्पन्न करेंगे।

- बाँझ संस्कृति हुड के तहत काम करना, एमसीएफ 7 या एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के साथ इस प्रक्रिया को शुरू करें जो 70% से 80% कॉन्फ्लूंट हैं। फ्लास्क से माध्यम को एस्पिरेट करें। कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोएं, फिर ट्रिप्सिन-ईडीटीए जोड़ें और दो से छह मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। टुकड़ी के बाद, 10% एफबीएस युक्त मैमोस्फीयर माध्यम जोड़कर बुझाएं।

एक बार कोशिकाओं को अलग कर दिया है, उन्हें एक 15 मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए हस्तांतरण और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 बार ग्राम स्पिन। इस अपकेंद्रित्र के बाद सुपरनैंट को कम करें, फिर कोशिकाओं को मैमोस्फीयर माध्यम के एक से पांच मिलीलीटर में फिर से निलंबित कर दिया। सेल पैलेट को तोड़ने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।

इसके बाद, सेल सस्पेंशन को 40 माइक्रोन सेल स्ट्रेनिंग कैप फिल्टर में स्थानांतरित करें और एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए संलग्न ट्यूब में प्रवाह को इकट्ठा करें। एक हीमोसाइटोमीटर पर पुनर्नोकेड कोशिकाओं के 20 माइक्रोलीटर एलिकोट पिपेट और इसकी जांच करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। यदि सेल क्लस्टर यहां देखे जाते हैं, तो एक सिरिंज का उपयोग 25 गेज सुई में या दो बार निलंबन से बाहर निकलने के लिए करें।

एक बार कोशिकाओं को एक एकल सेल निलंबन में फैलाया गया है जैसा कि यहां दिखाया गया है, तो सीडी 44 सकारात्मक, सीडी 24 नकारात्मक सेलुलर सबसेट को फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई या एलएस-कॉलम का उपयोग करके चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई के माध्यम से अलग करने के लिए आगे बढ़ें सीडी 44 सकारात्मक कोशिकाओं का सकारात्मक चयन करने के लिए। चूंकि वांछित कोशिकाएं एलएस-कॉलम की दीवारों से जुड़ी होती हैं, इसलिए प्रवाह को हटा दें, फिर कॉलम से कोशिकाओं को हटा दें, बफर के पांच मिलीलीटर लागू करें और वांछित कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए कॉलम के साथ आपूर्ति किए गए प्लंजर को लागू करें और दबाना।

इसके बाद, नकारात्मक चयन द्वारा जनसंख्या को और शुद्ध करने के लिए एलडी-कॉलम का उपयोग करें। यहां, सीडी 24 सकारात्मक कोशिकाएं एलडी-कॉलम से जुड़ी होती हैं। फ्लिकेथ्रथ को इकट्ठा करें जिसमें सीडी24 नकारात्मक कोशिकाएं शामिल हैं। इसके बाद, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके सभी अलग-थलग कोशिकाओं के फेनोटाइप की पुष्टि करें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके, व्यवहार्य कोशिकाओं के घनत्व की गणना करें।

कोशिका निलंबन को उचित रूप से कमजोर करने के बाद, पूर्ण मैमोस्फीयर माध्यम के 2 मिलीलीटर में 500 से 4,000 कोशिकाओं प्रति सेंटीमीटर वर्ग के साथ छह अच्छी तरह से अल्ट्रालो अटैचमेंट प्लेट के प्रत्येक कुएं को बीज दें। प्लेटों को 5 से 10 दिनों तक परेशान न करने का ख्याल रखते हुए जब तक गोले मनाए जाते हैं। जब तक गोले व्यास में कम से कम 40 माइक्रोन नहीं थे, तब तक खेती जारी रखें, लेकिन अभी तक एपोटोटिक करना शुरू नहीं किया है।