Birincil Mammosferlerin Üretimi: Hücre Gücünü Belirleme Tekniği

Tek bir meme kanseri kök hücresi, birincil mammosfer adı verilen bir hücre kümesine yol açar. Bunları elde etmek için, önce hücrelerin büyüme evrelerinde olduğundan emin olmak için% 70 ila% 80 birleştiğine kadar bir meme kanseri hücre hattını kültüre edin. Hücreleri şişeden ayırmak için Tripsin-EDTA ekleyin ve Tripsin'in eylemini durdurmak için serumlu bir ortam ekleyin.

Şimdi, hücre peletini elde etmek için hücreleri bir tüpe ve santrifüje alın. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için peletin mammosphere ortamında serum olmadan yeniden kullanılabilir ve süspansiyonu bir hücre süzgeç kapağı filtresinden geçirin. Bu süspansiyon kök hücrelerden, progenitör hücrelerden ve farklı protein ifadelerini gösteren farklılaştırılmış hücrelerden oluşur.

CD44 ve CD24 meme kanseri kök hücrelerinin karakteristik hücre yüzey proteinleridir. CD44 ifadesi için pozitif, CD24 için negatiftirler. Floresan veya manyetik aktif hücre sıralama kullanarak hücreleri hücre süspansiyonundan izole edin. Ardından, hücrelere bir aliquot ve reklam deneme mavisi lekesi alın ve tohumlama yoğunluğunu bulmak için bir hemositometre slaytı kullanarak mililitre başına uygulanabilir hücre sayısını hesaplayın.

Son olarak, hücreleri altı kuyu ultra düşük yapışan plakaya tohumlar, böylece hücreler askıya alınır. Kürelerin çapı 40 mikron olana kadar plakayı bozmadan 5 ila 10 gün kuluçkaya yatırın. Aşağıdaki protokolde, meme kanseri hücre hattından birincil mammosferler üreteceğiz.

- Steril bir kültür başlığı altında çalışarak, bu prosedüre% 70 ila% 80 bir arada olan MCF7 veya MDA-MB-231 hücreleri ile başlayın. Ortamı şişeden epire edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından Tripsin-EDTA ekleyin ve iki ila altı dakika kuluçkaya yatırın. Müfrezeyi takiben% 10 FBS içeren mammosfer ortamı ekleyerek söndürün.

Hücreler ayrıldıktan sonra, 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında 200 kez döndürün. Bu santrifüjün süpernatantı yok etmesini takiben, hücreleri bir ila beş mililitre mammosfer ortamında yeniden biriktirdi. Hücre saçmasını parçalamak için pipet 10 kez yukarı ve aşağı.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu 40 mikron hücre germe kapağı filtresine aktarın ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için akışı bağlı tüpte toplayın. Pipet, yeniden kullanılan hücrelerin 20 mikroliter aliquot'u bir hemositometreye ve incelemek için bir mikroskop kullanın. Hücre kümeleri burada görüldüğü gibi gözlenirse, süspansiyonu 25 kalibrelik bir iğneye bir veya iki kez girip çıkarmak için bir şırınga kullanın.

Hücreler burada gösterildiği gibi tek bir hücre süspansiyonuna dağıtıldıktan sonra, CD44 pozitif hücrelerini pozitif olarak seçmek için LS sütunu kullanılarak floresan aktif hücre sıralama veya manyetik aktif hücre sıralama yoluyla CD44 pozitif, CD24 negatif hücresel alt kümelerini izole etmeye devam edin. İstenen hücreler LS sütununun duvarlarına takıldığından, akış akışını atın, ardından hücreleri sütundan çıkarın, beş mililitre tampon uygulayın ve istenen hücreleri temizlemek için sütunla birlikte verilen pistonu uygulayın ve bastırın.

Ardından, negatif seçimle popülasyonu daha da arındırmak için bir LD sütunu kullanın. Burada, CD24 pozitif hücreler LD sütunlarına bağlanır. CD24 negatif hücrelerini içeren akış akışını toplayın. Daha sonra, akış sitometrisi kullanarak tüm izole hücrelerin fenotiplerini onaylayın. Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak, uygulanabilir hücrelerin yoğunluğunu hesaplayın.

Hücre süspansiyonunun uygun şekilde seyreltilmesinin ardından, 2 mililitrelik tam mammosfer ortamında santimetrekare kare başına 500 ila 4.000 hücreli altı kuyu ultraifer bağlanma plakasının her bir kuyusunun tohumlarını koyun. Plakaları küreler gözlemlenene kadar 5 ila 10 gün boyunca rahatsız etmemeye dikkat ederek kuluçkaya yatırın. Kürelerin çapı en az 40 mikron olana kadar kültlü olmaya devam edin, ancak henüz apoptotik olmaya başlamadı.