Generering av primära mammosfärer: En teknik för att bestämma cellpotens

En enda stamcell för bröstcancer ger upphov till ett kluster av celler som kallas en primär mammosfär. För att få dem, först odla en bröstcancer cellinje fram till 70% till 80% sammanflöde, för att säkerställa att cellerna är i sin tillväxtfas. Tillsätt Tripsin-EDTA för att lossa celler från kolven och tillsätt ett medium med serum för att stoppa Tripsins verkan.

Ta cellerna i ett rör och centrifugera för att få cellpelleten. Återanvänd pelleten i mammosfärmediet utan serum och skicka suspensionen genom ett cellsillockfilter för att få en enda cellupphängning. Denna suspension består av stamceller, stamceller och differentierade celler som visar olika proteinuttryck.

CD44 och CD24 är cell ytproteiner som är karakteristiska för bröstcancer stamceller. De är positiva för CD44-uttryck och negativa för CD24. Isolera celler från cellupphängningen med fluorescens eller magnetisk aktiverad cellsortering. Ta sedan en alikvot och ad trypan blå fläck till cellerna och beräkna antalet livskraftiga celler per milliliter med hjälp av en hemocytometerbild för att hitta såddtätheten.

Slutligen så cellerna i en sex brunn ultra låg vidhäftande platta, så att cellerna förblir upphängda. Inkubera plattan i 5 till 10 dagar utan att störa plattan tills sfärerna är 40 mikron i diameter. I följande protokoll kommer vi att generera primära mammosfärer från en bröstcancercelllinje.

- Arbeta under en steril odlingshuv, börja denna procedur med MCF7- eller MDA-MB-231-celler som är 70% till 80% konfluenta. Aspirera mediet från kolven. Tvätta cellerna två gånger med PBS, tillsätt sedan Tripsin-EDTA och inkubera i två till sex minuter. Efter lossning, släcka genom att tillsätta mammosfärmedium som innehåller 10% FBS.

När cellerna har lossnat, överför dem till ett 15 milliliter koniskt centrifugerör och snurra det 200 gånger g vid rumstemperatur i fem minuter. Efter denna centrifugation dekanterade supernatanten cellerna i en till fem milliliter mammosfärmedium. Pipett upp och ner 10 gånger för att bryta upp cellpelleten.

Överför sedan cellfjädringen till ett 40 mikroncellsspänningslockfilter och samla in flödet i det bifogade röret för att få en enda cellupphängning. Pipett en 20 mikroliter alikvot av de återanvända cellerna på en hemocytometer och använd ett mikroskop för att undersöka det. Om cellkluster observeras som ses här, använd en spruta för att skicka ut suspensionen in och ut ur en 25 gauge nål en eller två gånger.

När cellerna har spridits till en enda cell suspension som visas här, fortsätt att isolera CD44 positiva, CD24 negativa cellulära delmängder via fluorescens aktiverad cell sortering eller magnetisk aktiverad cell sortering med LS-kolumn för att positivt välja CD44 positiva celler. Eftersom de önskade cellerna fästs på väggarna i LS-kolumnen, kasserar genomströmningen och tar sedan bort celler från kolumnen, applicerar fem milliliter buffert och applicerar och trycker in kolven som medföljer kolonnen för att spola ut önskade celler.

Använd sedan en LD-kolumn för att ytterligare rena populationen genom negativt urval. Här bifogas de positiva CD24-cellerna till LD-kolumnerna. Samla in genomströmningen som innehåller CD24-negativa celler. Därefter bekräftar användning av flödescytometri fenotyperna av alla isolerade celler. Beräkna densiteten för livskraftiga celler med hjälp av trypan blue exclusion-metoden.

Efter att cellupphängningen spädts ut på lämpligt sätt, så varje brunn av en sex brunn ultralätt fästplatta med 500 till 4 000 celler per centimeter kvadrat i 2 milliliter komplett mammosfärmedium. Inkubera plattorna och var noga med att inte störa dem i 5 till 10 dagar tills sfärer observeras. Fortsätt odlingen tills sfärerna var minst 40 mikrometer i diameter men har ännu inte börjat bli apoptotiska.