Génération de mammosphères primaires : une technique pour déterminer la puissance cellulaire

Une seule cellule souche du cancer du sein donne naissance à un groupe de cellules appelée mammosphère primaire. Pour les obtenir, la première culture d’une lignée de cellules cancéreuses du sein jusqu’à 70% à 80% confluent, pour s’assurer que les cellules sont dans leur phase de croissance. Ajouter Tripsin-EDTA pour détacher les cellules du flacon, et ajouter un milieu avec sérum pour arrêter l’action de Tripsin.

Maintenant, prenez les cellules dans un tube et une centrifugeuse pour obtenir la pastille cellulaire. Resuspendez la pastille dans le milieu de la mammosphère sans sérum et passez la suspension à travers un filtre à bouchon de passoire cellulaire, pour obtenir une suspension cellulaire unique. Cette suspension se compose de cellules souches, de cellules progénitrices et de cellules différenciées montrant différentes expressions protéiques.

Le CD44 et le CD24 sont des protéines de surface cellulaire caractéristiques des cellules souches du cancer du sein. Ils sont positifs pour l’expression CD44 et négatifs pour le CD24. Isoler les cellules de la suspension cellulaire à l’aide de fluorescence ou de tri cellulaire magnétique activé. Ensuite, prenez une tache bleue d’aliquot et d’annonce trypan aux cellules, et calculez le nombre de cellules viables par millilitre à l’aide d’une glissière d’hémocytomètre pour trouver la densité d’ensemencement.

Enfin, ensemencer les cellules dans une plaque d’adhérence six puits ultra faible, de sorte que les cellules restent suspendues. Incuber la plaque pendant 5 à 10 jours sans déranger la plaque jusqu’à ce que les sphères mesurent 40 microns de diamètre. Dans le protocole suivant, nous allons générer des mammosphères primaires à partir d’une lignée cellulaire du cancer du sein.

- Travailler sous un capot de culture stérile, commencer cette procédure avec MCF7 ou MDA-MB-231 cellules qui sont 70% à 80% confluent. Aspirer le milieu du flacon. Lavez les cellules deux fois avec PBS, puis ajoutez Tripsin-EDTA et incubez pendant deux à six minutes. Après le détachement, étanchez en ajoutant un milieu de mammosphère contenant 10 % de FBS.

Une fois que les cellules se sont détachées, transférez-les dans un tube de centrifugeuse conique de 15 millilitres et faites-le tourner 200 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Après cette centrifugation décanté le supernatant, puis réutilisé les cellules dans un à cinq millilitres de milieu mammosphère. Pipette de haut en bas 10 fois pour briser la pastille cellulaire.

Ensuite, transférez la suspension cellulaire à un filtre à bouchon de contrainte cellulaire de 40 microns et recueillez le flux dans le tube attaché pour obtenir une suspension à cellule unique. Pipette un aliquot de 20 microlitres des cellules résuspendues sur un hémocytomètre et utiliser un microscope pour l’examiner. Si des grappes cellulaires sont observées comme on le voit ici, utilisez une seringue pour passer la suspension dans et hors d’une aiguille de calibre 25 une ou deux fois.

Une fois que les cellules ont été dispersées en une seule suspension cellulaire comme indiqué ici, procéder à isoler CD44 positif, CD24 sous-ensembles cellulaires négatifs par fluorescence activé le tri cellulaire ou magnétique activé le tri cellulaire à l’aide de la colonne LS pour sélectionner positivement les cellules CD44 positives. Puisque les cellules désirées s’attachent aux parois de la colonne LS, jetez le flowthrough, puis retirez les cellules de la colonne, appliquez cinq millilitres de tampon et appliquez et pressez le piston fourni avec la colonne pour rincer les cellules désirées.

Ensuite, utilisez une colonne LD pour purifier davantage la population par sélection négative. Ici, les cellules positives CD24 s’attachent aux colonnes LD. Recueillir le flowthrough qui contient les cellules négatives CD24. Ensuite, l’utilisation de la cytométrie du débit confirme les phénotypes de toutes les cellules isolées. À l’aide de la méthode d’exclusion bleue trypan, calculer la densité des cellules viables.

Après avoir correctement dilué la suspension cellulaire, ensemencer chaque puits d’une plaque de fixation ultralow de six puits avec 500 à 4 000 cellules par centimètre carré en 2 millilitres de milieu de mammosphère complet. Incuber les plaques en prenant soin de ne pas les déranger pendant 5 à 10 jours jusqu’à ce que les sphères soient observées. Continuer à se culturer jusqu’à ce que les sphères étaient d’au moins 40 microns de diamètre, mais n’ont pas encore commencé à devenir apoptotique.