Un test in vitro basé sur la fluorescence pour mesurer l’efficacité de l’étanchéité de la membrane plasmique

Prenez une microplaque contenant des cellules de mammifères sur de la glace.

Ajoutez un milieu contenant du calcium aux puits sélectionnés et un milieu sans calcium aux autres.

Introduire les monomères d’une toxine bactérienne formant des pores. Une basse température empêche l’agrégation des monomères, facilitant la liaison au cholestérol de la membrane cellulaire.

Incuber à une température physiologique, permettant aux monomères liés au cholestérol de s’oligomériser et de s’insérer dans la membrane, formant un pore.

Dans les puits avec du calcium extracellulaire, le pore provoque un afflux de calcium.

L’afflux déclenche l’excrétion exosomale de la toxine et la refermeture de la membrane.

L’augmentation du calcium intracellulaire induit également une exocytose lysosomale, libérant une enzyme qui convertit la sphingomyéline de la membrane en céramide.

La membrane enrichie en céramides déclenche l’endocytose de la toxine, refermant la membrane.

La refermeture de la membrane est entravée dans les puits sans calcium extracellulaire.

Ajoutez de l’iodure de propidium ou PI – un colorant fluorescent – qui ne peut pas pénétrer dans les cellules avec une membrane réparée, mais pénètre dans les cellules endommagées pour lier l’ADN, émettant une fluorescence.

Mesurez la fluorescence à des intervalles définis pour évaluer l’efficacité de l’étanchéité de la membrane.

Pour mettre en place un test basé sur la fluorescence à haut débit pour les conditions permissives de réparation, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de milieu à 37 degrés Celsius M1 par puits, et ajoutez 100 microlitres de milieu frais à 37 degrés Celsius M1 complétés par de l’iodure de propidium à 30 micromolaires après avoir jeté le deuxième lavage.

Pour les conditions restrictives de réparation, lavez les cellules une fois avec 200 microlitres de milieu M2 à 37 degrés Celsius complété par 5 millimolaires d’EGTA par puits, suivi d’un lavage avec 200 microlitres de milieu M2 seul.

Après avoir jeté le deuxième lavage, ajoutez 100 microlitres de milieu frais M2 à 37 degrés Celsius complété par de l’iodure de propidium de 30 micromolaires par puits. Ensuite, imagez la plaque sous la lumière transmise, GFP et PI, comme nous venons de le démontrer. Pendant que la plaque est imagée, placez une microplaque de polypropylène à fond rond de 96 puits sur de la glace et configurez la plaque comme il vient d’être démontré pour la plaque précédente.

Pour les conditions permissives de réparation, ajoutez 100 microlitres de milieu glacé M1 complété par 60 micromolaires d’iodure de propidium par puits, suivi de l’ajout de 100 microlitres de M1 glacé avec ou sans 4x listériolysine O par puits.

Pour les conditions restrictives de réparation, ajoutez 100 microlitres de milieu M2 glacé complété par 60 iodure de propidium micromolaire par puits, suivi de l’ajout de 100 microlitres de M2 glacé avec ou sans 4x listériolysine O par puits.

Il est impératif de préparer la listériolysine O à la concentration expérimentale appropriée sur la glace environ 5 minutes avant le début de l’essai cinétique lorsque la plaque 1 est sur la glace et que la plaque 2 est en cours de préparation.

Lorsque la première plaque est terminée l’imagerie, transférez-la immédiatement sur une feuille de papier d’aluminium sur de la glace. Après 5 minutes, transférez 100 microlitres de chaque puits de la deuxième plaque vers le puits correspondant approprié dans la première plaque refroidie, en insérant les pointes de pipette sous le ménisque de la solution dans chaque puits avant d’éjecter le volume sans mélanger pour une bonne distribution de la toxine.

Laissez la toxine se lier aux cellules hôtes pendant 1 minute et transférez immédiatement la première plaque dans le lecteur de plaques pour le test postcinétique à l’aide du mode spectrofluorimètre. À la fin du test cinétique, acquérir immédiatement une imagerie postcinétique de l’image de la plaque comme démontré pour l’imagerie précinétique.