Un test pour l’analyse du cycle cellulaire des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de l’antigène

Prélever des cellules d’organes lymphoïdes secondaires d’une souris immunisée contre l’antigène, contenant des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de l’antigène à différents stades du cycle cellulaire.

G₁, S, G₂ et M sont des stades de division active des cellules, tandis que les cellules du stade G₀ sont quiescentes.

Ajoutez un colorant de viabilité fluorescente pour marquer les cellules mortes et des anticorps marqués au fluorophore se liant aux marqueurs de surface des lymphocytes T CD3 et CD8.

Introduire des multimères peptide-CMH antigéniques conjugués aux fluorophores pour se lier aux récepteurs des lymphocytes T, marquant ainsi les lymphocytes T spécifiques de l’antigène.

À l’aide d’un tampon, fixez et perméabilisez les cellules.

Introduire des anticorps marqués au fluorophore pour se lier à une protéine nucléaire associée à la prolifération cellulaire, colorant ainsi les cellules en division active.

Ajoutez une coloration fluorescente pour marquer l’ADN.

À l’aide de la cytométrie en flux, sélectionnez les cellules vivantes et identifiez les lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de l’antigène à l’aide des marqueurs liés à la surface.

L’intensité de la coloration de l’ADN distingue les cellules G₀ et G₁ avec une quantité d’ADN plus faible des cellules S, G₂ et M avec une quantité d’ADN plus élevée. L’absence d’anticorps spécifique à la protéine nucléaire sépare les cellules G₀.

Préparez un tampon de lavage de perméabilisation 1X frais en diluant le tampon de perméabilisation 10X avec de l’eau distillée, et filtrez-le à travers un filtre de 0,45 micromètre pour éliminer les agrégats. Diluer l’anticorps monoclonal Ki67-FITC dans un tampon de lavage de perméabilisation 1X, tel que déterminé par une expérience de titrage pour un volume final de 100 microlitres par échantillon.

Ajouter 3 millilitres de tampon de lavage à perméabilisation 1X dans chaque tube avec cellules et centrifuger à 400 g pendant 5 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant. Encore une fois, ajoutez le tampon de lavage de perméabilisation 1X et centrifugez pour granuler les cellules, puis jetez le surnageant.

Ajoutez 100 microlitres d’anticorps monoclonal dilué Ki67-FITC à la pastille, puis vortex et incubez pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après l’incubation, laver les cellules deux fois avec 4 millilitres de tampon de perméabilisation 1X, en centrifugeant après chaque lavage, et jeter le surnageant.

Ajoutez 350 microlitres de PBS à la pastille cellulaire pour les échantillons à acquérir directement au cytomètre en flux, et 250 microlitres de PBS à la pastille cellulaire pour les échantillons à incuber avec Hoechst pour la coloration de l’ADN. Préparez la solution de Hoechst et de PBS et ajoutez-la à chaque échantillon, de sorte que la concentration finale soit de 2 microgrammes par millilitre. Vortex et incuber les échantillons pendant 15 minutes dans l’obscurité. Ensuite, centrifugez les échantillons pendant 5 minutes et ajoutez 350 microlitres de PBS à la pastille de cellule.

Ouvrez le logiciel et créez différents groupes correspondant aux différents organes à analyser en cliquant sur Créer un groupe dans la section du ruban de l’espace de travail. Ouvrez la fenêtre Modifier le groupe en double-cliquant sur le nom du groupe et synchronisez les groupes nouvellement créés en cochant la fonction Synchronisé.

Faites glisser chaque fichier FCS vers le groupe correspondant, puis créez une stratégie de contrôle commençant par un groupe Infor LN. Ouvrez la fenêtre graphique en double-cliquant sur l’échantillon entièrement coloré pour afficher les événements non marqués acquis pour cet échantillon dans un graphique à points. Notez que les axes x et y sont étiquetés comme dans les fichiers FCS, comme indiqué dans le tableau 2 du fichier des paramètres du cytomètre en flux de ce manuscrit. Vérifiez qu’un nombre suffisant d’événements est affiché pour une visualisation appropriée.

Si nécessaire, ouvrez les Préférences en cliquant sur l’icône en forme de cœur dans le ruban de l’espace de travail, sélectionnez Graphiques, puis Graphique de points comme type de graphique, et vérifiez que le nombre de points dessinés dans la case correspondante est correct ou modifiez-le. Affichez les événements non liés dans la fenêtre graphique sous forme de graphique à points avec l’ADN-A sur l’axe des x et l’ADN-W sur l’axe des y. Utilisez une échelle linéaire pour les deux axes. Si nécessaire, changez l’échelle de logarithmique à linéaire en cliquant sur la case indiquée par un T près de chaque axe dans la fenêtre du graphique.

Sélectionnez une population de cellules uniques en cliquant sur Rectangle dans la section Outils de contrôle, puis double-cliquez au centre de la porte rectangulaire pour afficher des cellules uniques dans un graphique à points avec le paramètre FSC-A sur l’axe des x et le colorant des cellules mortes sur l’axe des y.

Cliquez sur le polygone pour sélectionner la population de cellules vivantes, qui sont négatives pour le colorant de cellules mortes. Double-cliquez au centre de la porte polygonale pour afficher les cellules dans un graphique à points avec le paramètre FSC-A sur l’axe des x et le paramètre SSC-A sur l’axe des y.

Cliquez sur Rectangle et créez une porte « détendue » pour inclure toutes les cellules actives uniques dans ce graphique. Double-cliquez au centre de la porte détendue pour afficher les cellules dans un graphique à points avec CD3 sur l’axe des x et CD8 sur l’axe des y.

Utilisez l’échelle d’axe appropriée pour la visualisation dans la fenêtre graphique. Si nécessaire, modifiez l’échelle x et y en cliquant sur la case indiquée par un T proche de chaque axe. Choisissez Personnaliser la fonction d’axe et modifiez les décades négatives supplémentaires , la base de largeur et les décennies positives si nécessaire.

Sélectionnez les cellules CD3 positives et CD8 positives en cliquant sur Polygone. Double-cliquez au centre de la porte CD3-positive, CD8-positive pour afficher les cellules dans un graphique à points avec Tetr-gag sur l’axe des x et Pent-gag sur l’axe des y. Sélectionnez les lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène en cliquant sur Polygone. Double-cliquez au centre de la porte spécifique au gag pour afficher les cellules dans un graphique à points avec l’ADN-A sur l’axe des x et Ki67 sur l’axe des y. Sélectionnez les cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire en cliquant sur Quad dans la section Outils de contrôle de la fenêtre graphique.