Visualisation des intermédiaires de réplication induite par les UV dans les E. coli En utilisant deux dimensions agarose gel Analyse

L’objectif global de cette procédure est de visualiser les intermédiaires structurels de l’ADN qui se produisent lorsque la réplication rencontre des lésions d’ADN à l’aide d’une analyse sur gel bidimensionnelle. Ceci est accompli en isolant d’abord l’ADN des cellules en division active dans lesquelles des lésions bloquant la réplication ont été induites. Ensuite, l’électrophorèse sur gel est utilisée pour séparer l’ADN récupéré en fonction de sa taille.

Ensuite, les voies sont découpées et refondues horizontalement dans un deuxième gel qui sépare davantage l’ADN en fonction de la taille et de la forme. Enfin, l’analyse sud est utilisée pour visualiser les structures d’ADN associées à la réplication des fragments d’ADN à des moments antérieurs et postérieurs à l’introduction des dommages induits par les UV. En fin de compte, cette procédure peut être utilisée pour montrer que l’incapacité à traiter les lésions d’ADN chez certains mutants entraîne l’accumulation d’intermédiaires de réparation de l’ADN.

Bonjour, je m’appelle Arthur Ian. Je travaille au laboratoire Corella de l’Université d’État de Portland. Bonjour, je m’appelle Brand she, je suis aussi du Corella Lab.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’électrophorèse sur gel bidimensionnelle. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la réplication de l’ADN et les intermédiaires de réparation. Alors commençons.

Pour commencer cette procédure, cultivez une culture nocturne de 200 microlitres d’e coli contenant le plasmide PBR 3 22 dans un milieu de cuisse DGC avec de l’ampicilline à 37 degrés Celsius. L’utilisation de DGC thigh medium minimise la protection UV. Après une nuit d’incubation, granulez les cellules à 14 000 RRP M pendant 30 secondes.

Ensuite, réinstallez la pastille cellulaire en suspension dans 200 microlitres de milieu DG C dépourvu d’ampicilline et inoculez. 20 millilitres de milieu de cuisse DG C cultivent des cultures sans sélection d’ampicilline. Dans un incubateur agitateur à 37 degrés Celsius à une DO 600 de 0,5, ce qui correspond à environ cinq fois 10 à la huitième cellule, la croissance par millilitre sans ampicilline évite la sélection contre les intermédiaires de réplication anormaux ou improductifs qui peuvent survenir chez certains mutants.

De plus, si vous utilisez la lumière UV pour induire des dommages, l’élimination de l’ampicilline du milieu est nécessaire car elle absorbe fortement à ces longueurs d’onde et protège. Les cellules réduisent la dose efficace d’UV pendant la croissance des cellules. Utilisez un photomètre UVC pour déterminer la distance d’une lampe germicide de 15 watts qui produit un taux d’exposition d’environ un JUUL par mètre carré par seconde.

Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une lumière jaune, car cela empêchera l’inversion de la photoréactivation des dimères de cyclobutane périne par photoliaison après irradiation UV. Une fois que la densité cellulaire souhaitée est atteinte, utilisez une pipette pour transférer la culture dans une boîte de Pétri de 15 centimètres de diamètre sur une plate-forme rotative pour assurer une irradiation uniforme de l’ensemble de la population cellulaire. Ensuite, irradiez les cultures avec 50 joules par mètre carré et transférez-les immédiatement dans une fiole de préchauffage stérile et remettez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Pendant la durée de l’expérience, cette dose produit en moyenne un dimère de cyclobutane-périne, tous les 4,5 kilobases, d’ADN simple brin pour chaque point temporel à examiner. Pipeter une aliquote de 0,75 millilitre de la culture dans 0,75 millilitres de filet glacé 30. Le filet tampon 30 sert de tampon d’arrêt qui empêche la réplication et la réparation par excision de nucléotides.

Une fois que le tampon d’arrêt a été ajouté, l’échantillon peut être conservé sur de la glace jusqu’à la fin de la course temporelle. Après la durée de la granulation, frottez chaque échantillon et remettez les granulés en suspension. Dans 150 microlitres de tampon de lyse, lyce les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes sans agitation.

Étant donné que les structures répliquatives avec des régions à un seul brin ou des points de ramification sont plus sensibles au cisaillement, coupez les pointes des pipettes avec une lame de rasoir pour élargir la bouche et minimiser les forces de cisaillement. En général, le pipetage et l’agitation doivent être réduits au minimum jusqu’à ce que l’ADN ait été digéré avec des enzymes de restriction, après la lyse, ajoutez de la protéinase K et de la cellule sarcas et laissez l’incubation se poursuivre pendant une heure. Cela sert à libérer des fragments d’ADN associés à des protéines.

Étant donné que la réplication active de l’ADN est souvent liée à des complexes protéiques ou membranaires, cela permet d’augmenter le rendement des fragments de réplication. Au bout d’une heure, extrayez les échantillons en ajoutant deux volumes de phénol à chaque échantillon et en inversant doucement les tubes pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite deux volumes de chloroforme, d’isoamyle, d’alcool et retournez doucement les tubes pendant cinq minutes supplémentaires.

Ensuite, centrifugez les échantillons à 14 000 tr/min dans une micro-centrifugeuse pendant cinq minutes et transférez la phase aqueuse supérieure de chaque échantillon dans un tube frais. Ajoutez ensuite quatre volumes d’alcool ISO chloroforme, et encore une fois, retournez doucement les tubes pendant cinq minutes. Centrifugez à nouveau les échantillons à 14 000 tr/min pendant cinq minutes.

Placez une membrane de dialyse sur 250 millilitres de 0,1 xte dans un bécher et placez 100 microlitres de chaque échantillon sur la membrane. Laissez les échantillons dialyser pendant une heure après la dialyse. Placez 80 microlitres de chaque échantillon dans un tube frais de 1,5 millilitre contenant 20 microlitres de mélange d’enzymes.

Digérer les échantillons pendant la nuit à 37 degrés Celsius. PV deux linéarise le plasmide juste en aval de l’origine de la réplication. Avant de charger l’agros gel, ajoutez 100 microlitres de chloroforme et 20 microlitres de six x colorant de chargement contenant du bromo.

Du bleu de phénol et du cyan de xylène dans chaque échantillon et chaque mélange de chloroforme éliminera tout PV restant lié aux extrémités de l’ADN. Commencez l’analyse bidimensionnelle du gel aros en faisant passer les échantillons d’ADN restreints à travers la première dimension. Chargez d’abord un marqueur Lambda hind de trois tailles dans la première voie d’un gel agros à 0,4 % préalablement préparé dans un XTBE.

Chargez ensuite 40 microlitres de phase aqueuse contenant le colorant de chargement pour chaque échantillon, en sautant les voies pour faciliter le tranchage du gel. Après l’électrophorèse, faites fonctionner la première dimension à un volt par centimètre pendant environ 12 à 15 heures. Le gel AGROS à basse tension et à faible pourcentage sert à séparer les fragments d’ADN principalement en fonction de leur taille.

Une fois que la première dimension a été exécutée, utilisez un grand couteau de boucher pour découper la première allée contenant le marqueur Lambda hinda trois et colorer avec du bromure d’atérium. Pour la deuxième dimension, découpez les couloirs de gel à l’aide du grand couteau de boucher en utilisant le marqueur Lambda Hind three comme culture guide et jetez la région en dessous de laquelle le plasmide linéarisé est censé courir sur chaque couloir. Pour lancer la deuxième dimension, placez chaque tranche horizontalement sur le dessus d’une roulette de gel vide.

Préparez une solution de 1 % d’AROS dans un XTBE et laissez refroidir à 55 degrés Celsius. Une fois refroidi, versez la solution de gel pour couler la deuxième dimension, en vous assurant de couvrir complètement les tranches de gel. Il est important de s’assurer que les tranches sont uniformément orientées et que le ricin est de niveau avant de verser le gel.

Une fois que le gel a pris, exécutez la deuxième dimension, cinq heures et demie à sept heures à 6,5 vol. par centimètre dans une unité d’électrophorèse qui permet au tampon de faire recirculer la haute tension et le gel Agros à haut pourcentage sépare efficacement les fragments d’ADN en fonction de leur forme ainsi que de leur taille. Les formes non linéaires traversent plus lentement la deuxième dimension après l’électrophorèse. Rincez le gel à l’eau une fois, puis lavez-le deux fois dans 400 millilitres d’acide chlorhydrique 0,25 molaire pendant 15 minutes en agitant doucement.

Les lavages à l’acide servent à entailler partiellement les molécules d’ADN en fragments plus petits qui se transfèrent plus efficacement lors de l’analyse sud et sont nécessaires en raison de la grande taille et de la forme inhabituelle des intermédiaires de réplication de l’ADN. Pour préparer le gel au transfert alcalin, rincez à nouveau le gel à l’eau, puis lavez-le deux fois dans 400 millilitres d’hydroxyde de sodium 0,4 molaire pendant 30 minutes. L’ADN dans les gels est ensuite transféré sur une membrane en nylon n plus à haute liaison à l’aide d’un système de transfert alcalin vers le bas avec de l’hydroxyde de sodium de 0,4 molaire comme décrit dans la partie écrite de cette procédure, laissez le transfert d’ADN pendant six à 12 heures après le transfert d’ADN se poursuivre avec l’hybridation de la sonde comme décrit dans le protocole écrit.

Une fois la membrane sondée et lavée, placez la membrane sur une serviette en papier jusqu’à ce que le liquide ait visiblement disparu. Ensuite, enveloppez la membrane dans une pellicule plastique en polychlorure de vinyle et exposez-la à un écran d’imageur phospho. Enfin, la radioactivité peut être visualisée et quantifiée à l’aide d’une tempête huit 40 et de son image quantitative associée.

Le schéma de migration du plasmide PBR 3 22 digéré par PV deux observé par l’analyse 2D sur gel est schématisé. Les plasmides linéaires non réplicatifs fonctionnent sous forme de fragments linéaires de 4,4 Ko sous forme de structures en forme de Y qui migrent plus lentement que les fragments non réplicatifs en raison de leur taille plus grande et de leur forme non linéaire. Ce modèle de migration forme un arc qui s’étend de la région linéaire vers le puits suivant l’irradiation UV.

Les molécules en forme de Double Y ou de X sont observées dans la région du cône et migrent plus lentement que l’arc des molécules en forme de Y. Un exemple de l’analyse sud du gel 2D sondé avec P 32 marqué PBR 3 22 est montré pour les cellules immédiatement après l’irradiation UV et 15 minutes après l’irradiation UV immédiatement après l’irradiation UV. Environ 1 % de l’ADN plasmatique total se trouve dans l’arc Y lorsque les cellules se développent rapidement en phase exponentielle à la suite d’un rayonnement.

Une augmentation transitoire des molécules en forme de YS est observée à mesure que les fourches de réplication bloquées s’accumulent sur les sites endommagés. Les intermédiaires de réplication en forme de L s’accumulent et persistent également de manière transitoire jusqu’à un moment qui correspond au moment où les lésions sont réparées. Nous venons de vous montrer comment visualiser les intermédiaires de réparation de l’ADN à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.

Lors de cette procédure, il est important d’être conscient des forces de cisaillement qui peuvent réduire le rendement et d’être doux avec tous les échantillons et gels. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.