Visualisation des intermédiaires de réplication induite par les UV dans les E. coli En utilisant deux dimensions agarose gel Analyse

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les intermédiaires structuraux de l'ADN qui se forment lorsque la réplication rencontre des lésions de l'ADN, en utilisant une analyse par électrophorèse sur gel bidimensionnel. Cela est réalisé en isolant d'abord l'ADN de cellules en division active dans lesquelles des lésions bloquant la réplication ont été induites. Ensuite, une électrophorèse sur gel est utilisée pour séparer l'ADN récupéré en fonction de sa taille.

Ensuite, les bandes sont découpées et recoulées horizontalement dans un second gel qui sépare davantage l'ADN en fonction de sa taille et de sa forme. Enfin, une analyse de type Southern est utilisée pour visualiser les structures d'ADN associées aux fragments d'ADN en cours de réplication, à des moments précédant et suivant à divers intervalles l'induction de dommages par UV. En définitive, cette procédure permet de démontrer que l'incapacité à traiter les lésions de l'ADN chez certains mutants entraîne l'accumulation d'intermédiaires de réparation de l'ADN.

Bonjour, je m'appelle Arthur Ian. Je viens du laboratoire Corella de l'Université d'État de Portland. Bonjour, je m'appelle Brand She, je viens également du laboratoire Corella.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'électrophorèse en gel bidimensionnel. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les intermédiaires de la réplication et de la réparation de l'ADN. Commençons donc.

Pour commencer cette procédure, cultiver une culture de 200 microlitres en bouillon contenant le plasmide PBR 3 22 dans du milieu DGC thigh avec de l'ampicilline à 37 degrés Celsius. L'utilisation du milieu DGC thigh minimise le blindage UV. Après une incubation nocturne, récupérer les cellules par centrifugation à 14 000 RRP M pendant 30 secondes.

Ensuite, resuspendre le culot cellulaire dans 200 microlitres de milieu DG C th dépourvu d'ampicilline et ensemencer. Faire croître des cultures de 20 millilitres de milieu DG C thigh sans sélection par l'ampicilline dans un incubateur agité à 37 degrés Celsius jusqu'à une DO 600 de 0,5, ce qui correspond à environ cinq fois 10 à la puissance huit cellules par millilitre. La croissance sans amplicilline évite la sélection contre les intermédiaires de réplication anormaux ou improductifs qui pourraient apparaître chez certains mutants.

En outre, si l'on utilise une lumière UV pour induire des dommages, il est nécessaire de retirer l'ampicilline du milieu, car elle absorbe fortement à ces longueurs d'onde et fait écran, réduisant ainsi la dose efficace de rayonnement UV pendant la croissance des cellules. Utilisez un photomètre UVC pour déterminer la distance par rapport à une lampe germicide de 15 watts qui produit un débit d'exposition d'environ un JUUL par mètre carré par seconde.

Les étapes suivantes doivent être effectuées sous lumière jaune, car cela empêchera la reversion photo-induite des dimères de cyclobutane par la photolyase après l'irradiation UV. Une fois la densité cellulaire souhaitée atteinte, utilisez une pipette pour transférer la culture dans une boîte de Pétri de 15 centimètres de diamètre placée sur une plateforme tournante afin d'assurer une irradiation uniforme de l'ensemble de la population cellulaire. Ensuite, irradiez les cultures avec 50 joules par mètre carré et transférez-les immédiatement dans un flacon stérile préchauffé, puis replacez-les dans l'incubateur à 37 degrés Celsius avec agitation.

Pendant toute la durée de l'expérience, cette dose produit en moyenne un dimère de cyclobutane par 4,5 kilobases d'ADN simple brin à chaque point temporel à analyser. Prélevez par pipette un aliquot de 0,75 millilitre de la culture et ajoutez-le à 0,75 millilitre de tampon NET 30 glacé. Le tampon NET 30 agit comme un tampon d'arrêt qui empêche la poursuite de la réplication et de la réparation par excision de nucléotides.

Une fois le tampon d'arrêt ajouté, l'échantillon peut être conservé sur de la glace jusqu'à la fin du cours du temps. Après le cours du temps, centrifuger chaque échantillon et resuspendre les culots. Dans 150 microlitres de tampon de lyse, lyser les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes sans agitation.

Étant donné que les structures en cours de réplication comportant des régions à simple brin ou des points de branchement sont plus sensibles à la cisaillement, coupez les extrémités des pipettes avec une lame de rasoir afin d'agrandir l'orifice et de minimiser les forces de cisaillement. En règle générale, il convient de limiter au minimum les opérations de pipetage et d'agitation jusqu'à ce que l'ADN ait été digéré par des enzymes de restriction. Après la lyse, ajoutez de la protéinase K et de la sarkosyl, puis poursuivez l'incubation pendant une heure. Cette étape permet de libérer les fragments d'ADN associés aux protéines.

Étant donné que l'ADN en cours de réplication active est souvent lié à des complexes protéiques ou membranaires, cela permet d'augmenter le rendement des fragments de réplication. Après une heure, extraire les échantillons en ajoutant deux volumes de phénol à chaque échantillon et en retournant doucement les tubes pendant cinq minutes. Puis ajouter deux volumes de chloroforme, d'isoamyl et d'alcool, et retourner délicatement les tubes pendant cinq minutes supplémentaires.

Ensuite, centrifuger les échantillons à 14 000 tr/min dans une microcentrifugeuse pendant cinq minutes et transférer la phase aqueuse supérieure de chaque échantillon dans un tube propre. Puis ajouter quatre volumes d'alcool ISO de chloroforme et, à nouveau, retourner doucement les tubes pendant cinq minutes. Centrifuger à nouveau les échantillons à 14 000 tr/min pendant cinq minutes.

Placer une membrane de dialyse au-dessus de 250 millilitres de 0,1 xte dans un bécher et déposer 100 microlitres de chaque échantillon sur la membrane. Laisser les échantillons dialyser pendant une heure après la dialyse. Placer 80 microlitres de chaque échantillon dans un tube frais de 1,5 millilitre contenant 20 microlitres de mélange enzymatique.

Incubez les échantillons toute la nuit à 37 degrés Celsius. PV deux linéarise le plasmide juste en aval de l'origine de réplication. Avant de charger le gel d'agarose, ajoutez 100 microlitres de chloroforme et 20 microlitres de colorant de charge six x contenant du bromo.

Phénol bleu et xylène cyan de chaque échantillon et mélanger le chloroforme éliminera toute trace restante de PV liée aux extrémités de l'ADN. Commencez l'analyse sur gel d'agarose bidimensionnel en faisant migrer les échantillons d'ADN digérés dans la première dimension. Chargez d'abord un marqueur de taille Lambda Hind III dans la première piste d'un gel d'agarose à 0,4 % préparé précédemment dans du TBE 1X.

Ensuite, chargez 40 microlitres de la phase aqueuse contenant le colorant de charge pour chaque échantillon, en sautant des pistes pour faciliter la découpe du gel. Après l'électrophorèse, faites migrer la première dimension à un volt par centimètre pendant environ 12 à 15 heures. La basse tension et le gel d'AGROS à faible pourcentage permettent de séparer les fragments d'ADN principalement en fonction de leur taille.

Une fois la première dimension terminée, utilisez un grand couteau de boucher pour découper la première piste contenant le marqueur Lambda Hind III et faites-la réagir avec le bromure d'athidium. Pour la seconde dimension, découpez les pistes du gel à l’aide du grand couteau de boucher en utilisant le marqueur Lambda Hind III comme repère de découpage, puis éliminez la région située en dessous de l’endroit où le plasmide linéarisé est censé migrer sur chaque piste. Pour réaliser la seconde dimension, placez chaque tranche horizontalement en haut d’un moule à gel vide.

Préparez une solution de 1 % d'AROS dans un XTBE et refroidissez à 55 degrés Celsius. Une fois refroidie, versez la solution de gel pour couler la seconde dimension, en veillant à recouvrir complètement les tranches de gel. Il est important de s'assurer que les tranches sont orientées de manière uniforme et que le moule est bien à niveau avant de verser le gel.

Une fois que le gel est pris, réalisez la seconde dimension pendant cinq heures et demie à sept heures à 6,5 volts par centimètre dans un appareil d'électrophorèse permettant la recirculation du tampon ; le gel d'agarose à haute tension et à pourcentage élevé sépare efficacement les fragments d'ADN selon leur forme ainsi que leur taille. Les formes non linéaires migrent plus lentement lors de la seconde dimension après électrophorèse. Rincez le gel à l'eau une fois, puis lavez-le deux fois dans 400 millilitres d'acide chlorhydrique 0,25 molaire pendant 15 minutes avec une agitation douce.

Les lavages acides ont pour but de fragmenter partiellement les molécules d'ADN en fragments plus petits, ce qui permet un transfert plus efficace lors de l'analyse de Southern, et sont nécessaires en raison de la grande taille et de la forme inhabituelle des intermédiaires de réplication de l'ADN. Pour préparer le gel au transfert alcalin, rincez à nouveau le gel à l'eau, puis effectuez deux lavages dans 400 millilitres de soude à 0,4 molaire pendant 30 minutes. L'ADN contenu dans les gels est ensuite transféré sur une membrane en nylon haute performance N+ à l'aide d'un système de transfert alcalin descendant utilisant de la soude à 0,4 molaire, comme décrit dans la partie écrite de cette procédure. Laissez le transfert de l'ADN se poursuivre pendant six à douze heures, puis continuez avec l'hybridation de la sonde selon les indications du protocole écrit.

Une fois que la membrane a été sondée et lavée, placez-la sur une serviette en papier jusqu'à ce que le liquide ait disparu visiblement. Ensuite, enveloppez la membrane dans un film plastique en chlorure de polyvinyle et exposez-la à un écran de révélateur phosphorescent. Enfin, la radioactivité peut être visualisée et quantifiée à l'aide d'un Storm 840 et de son logiciel ImageQuant associé.

Le schéma représente le profil de migration du plasmide PBR 322 digéré par PV2, observé par analyse sur gel d'agarose 2D. Les plasmides linéaires non répliqués migrent sous forme de fragments linéaires de 4,4 kb, tandis que les plasmides en cours de réplication forment des structures en forme de Y qui migrent plus lentement que les fragments non répliqués en raison de leur taille plus importante et de leur forme non linéaire. Ce profil de migration forme un arc qui s'étend depuis la région linéaire vers le puits après irradiation UV.

Des molécules en forme de double Y ou de X sont observées dans la région du cône et migrent plus lentement que l'arc de molécules en forme de Y. Un exemple de l'analyse southern sur gel 2D, réalisée avec une sonde PBR 3 22 marquée au P 32, est présenté pour des cellules prélevées immédiatement après une irradiation UV et 15 minutes après cette irradiation. Environ 1 % de l'ADN plasmidique total se retrouve dans l'arc de Y lorsque les cellules se divisent rapidement en phase exponentielle après une irradiation.

Une augmentation transitoire des molécules en forme de YS est observée lorsque les fourches de réplication bloquées s'accumulent au niveau des sites endommagés. Les intermédiaires de réplication en forme de L s'accumulent également de manière transitoire et persistent jusqu'à un moment qui correspond au réparation des lésions. Nous venons de vous montrer comment visualiser les intermédiaires de réparation de l'ADN à l'aide d'une électrophorèse sur gel bidimensionnelle.

Lors de cette procédure, il est important de prendre en compte les forces de cisaillement qui peuvent réduire le rendement, et de manipuler délicatement tous les échantillons et gels. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.