Name: Visualisation des intermédiaires de réplication induite par les UV dans les E. coli En utilisant deux dimensions agarose gel Analyse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Découvrez la visualisation des intermédiaires de réplication ADN après irradiation UV chez E. coli par électrophorèse sur gel d'agarose bidimensionnelle. Cette méthode révèle les structures de réparation et les mécanismes de réponse aux lésions.

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Le travail dans notre laboratoire est soutenu par MCB0551798 bourse de carrière de la Fondation nationale des sciences et AREA octroi R15GM86839 du NIGMS-NIH.

1. La croissance et l'irradiation UV. <ol><li> 200 ul d'une culture fraîche nuit contenant le plasmide pBR322 cultivées en moyenne 1 Davis supplémenté en glucose 0,4%, 0,2% casaminoacides, et 10 pg / ml thymine (moyenne DGCthy) et 100 pg / ml ampicilline est granulé. Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans un milieu de DGCthy 200 pl manquent à l'ampicilline et utilisées pour inoculer 20 ml de milieu DGCthy. </li><li> Les cultures sont cultivées sans sélection à l'ampicilline dans un incubateur agitateur à 37 ° C à une DO 600 de 0,5 (~ 5 x 10 8 cellules / ml). La croissance sans ampicilline évite la sélection contre les intermédiaires de réplication anormale ou improductives qui peuvent survenir dans certains mutants. De plus, si vous utilisez la lumière UV à induire des lésions, la suppression de l'ampicilline par les médias est nécessaire car il absorbe fortement à ces longueurs d'onde et les cellules de boucliers, en réduisant la dose efficace des UV. </li><li> Travaillant sous les lumières jaunes, la culture est placée dans une boîte de Pétri de diamètre 15cm sur une plateforme tournante pour l'agitation. Nos cultures sont placées à une distance d'une lampe de 15 watts qui produit des germicides un taux d'exposition de ~ 1 J/m2/sec, qui est mesurée à l'aide d'un photomètre UVC. Les cultures sont irradiées avec 50 J/m2 puis placé immédiatement en arrière dans le secouant à 37 ° C incubateur pour la durée de l'expérience. Cette dose produit, en moyenne, 1 cyclobutane pyrimidine dimère tous les 4,5 kb d'ADN simple brin. L'éclairage jaune empêche photoréactivation-inversion des dimères de pyrimidine cyclobutane par photolyase. </li></ol> 2. Isolation d'ADN. <ol><li> À l'époque où les intermédiaires de réplication sont à examiner, une aliquote de 0,75 ml de la culture est placée dans 0,75 ml de glace froide NET30 tampon (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM d'EDTA) et placé sur la glace jusqu'à la fin de le cours du temps. Nous généralement un cours de 90 minutes, avec des échantillons examinés à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes. L'EDTA et de la température froide servent à stopper efficacement la réplication et la réparation par excision de nucléotides. </li><li> Chaque échantillon est ensuite granulé, remis en suspension dans 150 ul de 1,5 mg / ml de lysozyme et 0,2 mg / ml dans le RNaseA TE (10 mM Tris, pH 8,0, EDTA 1 mM), et lysées à 37 ° C pendant 20 min. A cette époque, 10 ul de la protéinase K (10mg/ml) et 10 pi de Sarkosyl 20% sont ajoutés et l'incubation est autorisé à continuer pendant 1 heure. Protéinase K et sarkosyl aider à libérer des fragments d'ADN qui peuvent être associés à la membrane ou de protéines avant l'extraction du phénol se produit. Comme l'ADN se répliquant activement est souvent lié à des complexes de protéines ou de la membrane, ce qui contribue d'augmenter le rendement des fragments de réplication qui sont récupérés. </li><li> Les échantillons sont ensuite extraits par addition de 2 volumes de phénol pour chaque échantillon et les tubes sont délicatement inversé pendant 5 minutes. Puis 2 volumes de chloroforme / alcool isoamylique (24 / 1) sont ajoutés et les tubes sont à nouveau délicatement retourné pendant 5 minutes. </li><li> Les échantillons sont centrifugés à 14000 rpm dans une microcentrifugeuse pendant 5 minutes et la phase aqueuse supérieure de chaque échantillon est retiré et placé dans un tube neuf. Puis 4 volumes de chloroforme / alcool isoamylique (24 / 1) sont ajoutés, les tubes sont délicatement inversé pendant 5 minutes, et de nouveau centrifugé à 14000 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Le haut, la phase aqueuse dans chaque échantillon est ensuite dialysée pendant 1 heure en repérant 100 ul de chaque échantillon sur un disque 47mm Whatman um 0,025 pores qui flotte sur 250 ml de 0,1 X TE dans un bécher. Parce que les structures répliquant avec des régions simple brin ou points de branchements sont plus sensibles au cisaillement, nous avons généralement coupés de nos embouts de pipette avec une lame de rasoir pour faire la bouche large et de minimiser les forces de cisaillement. En général, pipetage doit être maintenu au minimum jusqu'à ce que l'ADN a été digéré par les enzymes de restriction. </li><li> Chaque échantillon est ensuite digéré par PvuII (New England Biolabs) qui linéarise le plasmide juste en aval de l'origine de réplication. </li><li> Avant de charger dans le gel d'agarose, 100 ul de chloroforme et de 20 pi de colorant de chargement 6X qui contient bromophénol cyanol bleu et le xylène sont ajoutés à chaque échantillon et mélangés. Puis, 40μl de la phase aqueuse contenant le colorant de chargement est chargé dans le gel. Afin de minimiser les biais structurels, des artefacts de structure, et de cisaillement de l'ADN, cette procédure d'isolement ne comprend aucune mesure d'enrichir des régions simple brin, précipité, ou de concentrer les échantillons d'ADN après lyse cellulaire. </li></ol> 3. Gel 2D et Analyse du Sud. <ol><li> Les deux dimensions de gel d'agarose d'analyse est modifié à partir de 3. Pour la dimension 1ER, les échantillons d'ADN limités sont gérés via un gel d'agarose 0,4% en 1X TBE à 1V/cm. Un litre de solution stock de TBE 10X contient: <ul><li> 108 g de Tris base </li><li> 55 g d'acide borique </li><li> 40 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8,0) </li></ul></li><li> Un marqueur de lambda Hind III de taille est chargé dans la voie d'abord, puis les échantillons sont chargés dans chaque autre voie. Nous fonctionnent généralement le premier dDIMENSION ~ 12-15 heures. Skipping voies rend plus facile à couper les voies de sortir de jeter dans la deuxième dimension. La basse tension et basse pour cent gel d'agarose permet de séparer les fragments d'ADN principalement basée sur la taille. </li><li> Pour la deuxième dimension, les voies de gel sont tranchées de la première dimension du gel en utilisant un couteau de boucher de grande. La première voie contenant le marqueur de Hind III lambda peut être coloré avec du bromure d'éthidium. Utilisation du marqueur lambda Hind III comme un guide, des cultures et jeter la région du gel qui est ci-dessous où le plasmide linéarisé est prévu pour fonctionner. Dans ces conditions, nous constatons que pBR322 linéarisé tourne légèrement au-dessus du xylène cyanol tache. </li><li> Pour lancer la deuxième dimension, chaque voie est placée horizontalement sur le sommet d'un lanceur de gel vide. Une solution de 1,0% d'agarose dans TBE 1X est préparé et refroidi à 55 ° C. A cette époque, la solution de gel est coulé dans de jeter la deuxième dimension, en veillant à recouvrir complètement les tranches de gel. Une fois que le gel a mis, il est exécuté au 6.5V/cm dans une unité d'électrophorèse, qui permet de faire circuler le tampon. Nous fonctionnent généralement la deuxième dimension de 5,5 à 7 heures ~. La haute tension et haute pour cent gel d'agarose sépare efficacement les fragments d'ADN en fonction de leur forme, ainsi que la taille. Formes non linéaires fonctionnent plus lentement dans la deuxième dimension. </li><li> Après électrophorèse, le gel est ensuite rincé à l'H 2 O, lavé deux fois dans 400ml d'acide chlorhydrique à 0,25 M pendant 15 minutes, rincer avec H 2 O;, puis lavé à deux reprises dans 400 ml de NaOH 0,4 M pendant 30 minutes. L'acide lave servent partiellement Nick les molécules d'ADN en petits fragments que le transfert de façon plus efficace. Cette étape est nécessaire en raison de la grande taille et de formes inhabituelles de l'intermédiaires de réplication d'ADN. </li><li> L'ADN dans les gels sont ensuite transférées à un Hybond N + membrane de nylon 4. Nous utilisons un système de transfert vers le bas alcalin avec 0,4 M NaOH. En bref, deux feuilles de papier buvard imbibé d'NaOH 0,4 M sont placés sur une grande pile de serviettes en papier. La membrane de nylon est également trempé dans NaOH 0,4 M et placé sur le dessus du papier buvard. Le gel est ensuite soigneusement couches sur le dessus de cela, suivi par un autre morceau de papier buvard humidifié dans la solution de NaOH. Enfin, un long morceau de papier buvard mouillé est posée sur le dessus et ses deux extrémités sont placées dans une des boîtes contenant 1 L de NaOH 0,4 M solution pour servir de mèche. En général, nous laisse le transfert d'ADN pour heures 6-12. </li><li> La membrane de nylon est retirée, lavée 20-30 secondes dans du tampon SSC 5X, et placé dans un flacon roulant hybridation contenant solution de préhybridation 10.5ml. Ensuite, la membrane est incubée à 42 ° C avec une rotation de plus de 6 heures. Solution de préhybridation: <ul><li> 5,0 ml de formamide </li><li> 0,5 ml SDS à 20% </li><li> 2,5 ml 20X SSC * </li><li> 2,0 ml 50X Denhardt * </li><li> 0,5 ml d'ADN de sperme de saumon (10mg/ml) Recettes * pour SSC et Denhardt peuvent être trouvés dans 5 </li></ul></li><li> Pendant la période de pré-hybridation, 1 ug de plasmide pBR322 est marquée au 32P par translation de coupure selon le protocole fourni par alpha Roche utilisant étiquetés [32 P]-dCTP. La sonde radiomarquée (100 pi) est dénaturé par incubation à 98 ° C pendant 10 minutes dans un tube à centrifuger à vis, puis placé immédiatement sur la glace. </li><li> La sonde dénaturée est ajouté à 5,9 ml solution d'hybridation, qui contient: <ul><li> 3,0 ml de formamide </li><li> 1,5 ml SSC </li><li> 1,0 ml H 2 O </li><li> 0,15 ml 50X Denhardt </li><li> 0,10 ml SDS à 20% </li><li> 0,15 ml d'ADN de sperme de saumon 10mg/ml </li></ul></li><li> La solution de préhybridation est versé hors de la bouteille à rouleaux et la solution d'hybridation est versé po La bouteille rouleau est ensuite retourné à l'incubateur à 42 ° C et une rotation de plus de 12 heures. </li><li> La solution d'hybridation est versé hors de la bouteille à rouleaux. Puis, la tache est lavée 4 fois pendant 20 minutes dans la bouteille à rouleaux avec ~ 150 ml d'une solution de lavage contenant 0.5X SSC, 0,1% SDS à 42 ° C avec rotation. </li><li> Après le dernier lavage, la membrane est placée sur une serviette en papier jusqu'à ce que le liquide a visiblement disparu. La membrane est ensuite enveloppé dans une pellicule de plastique polychlorure de vinyle et exposés à un écran phosphorimager. Nous visualiser et de quantifier la radioactivité en utilisant un Storm 840 et son logiciel associé ImageQuant. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Intermédiaires de réplication plasmidique observée dans la présence et l'absence de dommages à l'ADN induites par les UV. Le schéma de migration des PvuII digérer le plasmide pBR322 observé par 2D-agarose gel de l'analyse est schématisé. Non-réplication des plasmides linéaires exécuté comme un linéaire de 4,4 kb de fragment. Réplication des plasmides forme en forme de Y structures qui migrent plus lentement que les fragments non répliquant en raison de leur grande taille et aucunenlinear forme. Ce modèle de migration forme un arc qui s'étend de la région linéaire vers le bien. Après irradiation UV, double-Y ou X-molécules en forme sont observées dans la région de cône qui migre plus lentement que l'arc de Y-forme des molécules. Un exemple de l'analyse Southern du gel 2D sondé avec marqué au 32P pBR322 est révélée pour des cellules immédiatement après l'irradiation UV et 15 minutes après l'irradiation UV (reproduit avec l'autorisation de l'éditeur).

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
<li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%3A+A+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning - A laboratory manual</a>. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

Les résultats typiques obtenus à partir de cellules de type sauvage en présence et en absence de rayonnement UV-induite dégâts sont présentés dans la figure 1. En l&#39;absence de dégâts, environ 1% de l&#39;ADN plasmidique totale peut être trouvée dans l&#39;arc Y lorsque les cellules sont en croissance rapide dans la phase exponentielle. Après irradiation, une augmentation transitoire de molécules en forme de Y est observé que les fourches de réplication bloquées s&#39;accumuler aux sites endommagés. Les intermédiaire...

<table><tbody><tr><td>Exemple d'analyse Southern sur gel 2D sondé</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Éclairage jaune</td></tr><tr><td>Lampe germicide de 15 &amp;mu;watt</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>Lampe UV</td></tr><tr><td>Mesureur d'intensité UV Blak-Ray 254 nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>Photomètre UVC</td></tr><tr><td>Disques à pores de 0,025 &amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>Disques de dialyse flottants</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>Endonucléase de restriction</td></tr><tr><td>Kit de traduction par entaille</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>Pour fabriquer une sonde marquée au 32P</td></tr><tr><td>Papier buvard</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>Pour le transfert Southern</td></tr><tr><td>Membrane en nylon</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>Pour le transfert Southern</td></tr></tbody></table>

visualisation des intermédiaires de réplication induite par les uv dans les e. coli en utilisant deux dimensions agarose gel analyse

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Réplication inexacte dans la présence de dommages à l&#39;ADN est responsable de la majorité des réarrangements cellulaires et mutagenèse observée dans tous les types de cellules et est largement perçue comme étant directement associés au développement du cancer chez les humains. Dommages à l&#39;ADN, telles que celle induite par une irradiation UV, altère sévèrement la capacité de réplication de dupliquer le modèle génomique précision. Un certain nombre de produits de gènes ont été identifiés qui sont nécessaires lorsque la réplication rencontres lésions de l&#39;ADN dans le modèle. Toutefois, un défi reste a été de déterminer comment ces protéines lésions processus lors de la réplication<em&gt; In vivo</em&gt;. En utilisant Escherichia coli comme système modèle, nous décrivons une procédure dans laquelle deux dimensions agarose gel d&#39;analyse peuvent être utilisés pour identifier les intermédiaires structuraux qui surviennent sur des plasmides répliquant<em&gt; In vivo</em&gt; Suivantes dommages à l&#39;ADN induites par les UV. Cette procédure a été utilisée pour démontrer que fourches de réplication bloquées par UV des dommages induits par subir une inversion transitoire qui est stabilisé par RecA et de produits de gènes de plusieurs associé à la filière RecF. La technique démontre que ces intermédiaires de réplication sont maintenues jusqu&#39;à une époque qui correspond à l&#39;élimination des lésions par réparation par excision de nucléotides et reprend la réplication.

Nous présentons une procédure par laquelle deux dimensions agarose gel d&#39;analyse peuvent être utilisés pour identifier la structure des intermédiaires de réplication qui se produisent après irradiation UV.

Visualisation des intermédiaires de réplication induite par les UV dans les E. coli En utilisant deux dimensions agarose gel Analyse

La réplication inexacte en présence de dommages à l'ADN est responsable de la majorité des réarrangements cellulaires et de la mutagenèse observés dans tous les types cellulaires ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les intermédiaires structuraux de l'ADN qui se forment lorsque la réplication rencontre des lésions de l'ADN, en utilisant une analyse par électrophorèse sur gel bidimensionnel. Cela est réalisé en isolant d'abord l'ADN de cellules en division active dans lesquelles des lésions bloquant la réplication ont été induites. Ensuite, une électrophorèse sur gel est utilisée pour séparer l'ADN récupéré en fonction de sa taille.Ensuite, les bandes sont découpées et recoulées horizontalement dans un second gel qui sépare davantage l'ADN en fonction de sa taille et de sa forme. Enfin, une analyse de type Southern est utilisée pour visualiser les structures d'ADN associées aux fragments d'ADN en cours de réplication, à des moments précédant et suivant à divers intervalles l'induction de dommages par UV. En définitive, cette procédure permet de démontrer que l'incapacité à traiter les lésions de l'ADN chez certains mutants entraîne l'accumulation d'intermédiaires de réparation de l'ADN.Bonjour, je m'appelle Arthur Ian. Je viens du laboratoire Corella de l'Université d'État de Portland. Bonjour, je m'appelle Brand She, je viens également du laboratoire Corella.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'électrophorèse en gel bidimensionnel. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les intermédiaires de la réplication et de la réparation de l'ADN. Commençons donc.Pour commencer cette procédure, cultiver une culture de 200 microlitres en bouillon contenant le plasmide PBR 3 22 dans du milieu DGC thigh avec de l'ampicilline à 37 degrés Celsius. L'utilisation du milieu DGC thigh minimise le blindage UV. Après une incubation nocturne, récupérer les cellules par centrifugation à 14 000 RRP M pendant 30 secondes.Ensuite, resuspendre le culot cellulaire dans 200 microlitres de milieu DG C th dépourvu d'ampicilline et ensemencer. Faire croître des cultures de 20 millilitres de milieu DG C thigh sans sélection par l'ampicilline dans un incubateur agité à 37 degrés Celsius jusqu'à une DO 600 de 0,5, ce qui correspond à environ cinq fois 10 à la puissance huit cellules par millilitre. La croissance sans amplicilline évite la sélection contre les intermédiaires de réplication anormaux ou improductifs qui pourraient apparaître chez certains mutants.En outre, si l'on utilise une lumière UV pour induire des dommages, il est nécessaire de retirer l'ampicilline du milieu, car elle absorbe fortement à ces longueurs d'onde et fait écran, réduisant ainsi la dose efficace de rayonnement UV pendant la croissance des cellules. Utilisez un photomètre UVC pour déterminer la distance par rapport à une lampe germicide de 15 watts qui produit un débit d'exposition d'environ un JUUL par mètre carré par seconde.Les étapes suivantes doivent être effectuées sous lumière jaune, car cela empêchera la reversion photo-induite des dimères de cyclobutane par la photolyase après l'irradiation UV. Une fois la densité cellulaire souhaitée atteinte, utilisez une pipette pour transférer la culture dans une boîte de Pétri de 15 centimètres de diamètre placée sur une plateforme tournante afin d'assurer une irradiation uniforme de l'ensemble de la population cellulaire. Ensuite, irradiez les cultures avec 50 joules par mètre carré et transférez-les immédiatement dans un flacon stérile préchauffé, puis replacez-les dans l'incubateur à 37 degrés Celsius avec agitation.Pendant toute la durée de l'expérience, cette dose produit en moyenne un dimère de cyclobutane par 4,5 kilobases d'ADN simple brin à chaque point temporel à analyser. Prélevez par pipette un aliquot de 0,75 millilitre de la culture et ajoutez-le à 0,75 millilitre de tampon NET 30 glacé. Le tampon NET 30 agit comme un tampon d'arrêt qui empêche la poursuite de la réplication et de la réparation par excision de nucléotides.Une fois le tampon d'arrêt ajouté, l'échantillon peut être conservé sur de la glace jusqu'à la fin du cours du temps. Après le cours du temps, centrifuger chaque échantillon et resuspendre les culots. Dans 150 microlitres de tampon de lyse, lyser les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes sans agitation.Étant donné que les structures en cours de réplication comportant des régions à simple brin ou des points de branchement sont plus sensibles à la cisaillement, coupez les extrémités des pipettes avec une lame de rasoir afin d'agrandir l'orifice et de minimiser les forces de cisaillement. En règle générale, il convient de limiter au minimum les opérations de pipetage et d'agitation jusqu'à ce que l'ADN ait été digéré par des enzymes de restriction. Après la lyse, ajoutez de la protéinase K et de la sarkosyl, puis poursuivez l'incubation pendant une heure. Cette étape permet de libérer les fragments d'ADN associés aux protéines.Étant donné que l'ADN en cours de réplication active est souvent lié à des complexes protéiques ou membranaires, cela permet d'augmenter le rendement des fragments de réplication. Après une heure, extraire les échantillons en ajoutant deux volumes de phénol à chaque échantillon et en retournant doucement les tubes pendant cinq minutes. Puis ajouter deux volumes de chloroforme, d'isoamyl et d'alcool, et retourner délicatement les tubes pendant cinq minutes supplémentaires.Ensuite, centrifuger les échantillons à 14 000 tr/min dans une microcentrifugeuse pendant cinq minutes et transférer la phase aqueuse supérieure de chaque échantillon dans un tube propre. Puis ajouter quatre volumes d'alcool ISO de chloroforme et, à nouveau, retourner doucement les tubes pendant cinq minutes. Centrifuger à nouveau les échantillons à 14 000 tr/min pendant cinq minutes.Placer une membrane de dialyse au-dessus de 250 millilitres de 0,1 xte dans un bécher et déposer 100 microlitres de chaque échantillon sur la membrane. Laisser les échantillons dialyser pendant une heure après la dialyse. Placer 80 microlitres de chaque échantillon dans un tube frais de 1,5 millilitre contenant 20 microlitres de mélange enzymatique.Incubez les échantillons toute la nuit à 37 degrés Celsius. PV deux linéarise le plasmide juste en aval de l'origine de réplication. Avant de charger le gel d'agarose, ajoutez 100 microlitres de chloroforme et 20 microlitres de colorant de charge six x contenant du bromo.Phénol bleu et xylène cyan de chaque échantillon et mélanger le chloroforme éliminera toute trace restante de PV liée aux extrémités de l'ADN. Commencez l'analyse sur gel d'agarose bidimensionnel en faisant migrer les échantillons d'ADN digérés dans la première dimension. Chargez d'abord un marqueur de taille Lambda Hind III dans la première piste d'un gel d'agarose à 0,4 % préparé précédemment dans du TBE 1X.Ensuite, chargez 40 microlitres de la phase aqueuse contenant le colorant de charge pour chaque échantillon, en sautant des pistes pour faciliter la découpe du gel. Après l'électrophorèse, faites migrer la première dimension à un volt par centimètre pendant environ 12 à 15 heures. La basse tension et le gel d'AGROS à faible pourcentage permettent de séparer les fragments d'ADN principalement en fonction de leur taille.Une fois la première dimension terminée, utilisez un grand couteau de boucher pour découper la première piste contenant le marqueur Lambda Hind III et faites-la réagir avec le bromure d'athidium. Pour la seconde dimension, découpez les pistes du gel à l’aide du grand couteau de boucher en utilisant le marqueur Lambda Hind III comme repère de découpage, puis éliminez la région située en dessous de l’endroit où le plasmide linéarisé est censé migrer sur chaque piste. Pour réaliser la seconde dimension, placez chaque tranche horizontalement en haut d’un moule à gel vide.Préparez une solution de 1 % d'AROS dans un XTBE et refroidissez à 55 degrés Celsius. Une fois refroidie, versez la solution de gel pour couler la seconde dimension, en veillant à recouvrir complètement les tranches de gel. Il est important de s'assurer que les tranches sont orientées de manière uniforme et que le moule est bien à niveau avant de verser le gel.Une fois que le gel est pris, réalisez la seconde dimension pendant cinq heures et demie à sept heures à 6,5 volts par centimètre dans un appareil d'électrophorèse permettant la recirculation du tampon ; le gel d'agarose à haute tension et à pourcentage élevé sépare efficacement les fragments d'ADN selon leur forme ainsi que leur taille. Les formes non linéaires migrent plus lentement lors de la seconde dimension après électrophorèse. Rincez le gel à l'eau une fois, puis lavez-le deux fois dans 400 millilitres d'acide chlorhydrique 0,25 molaire pendant 15 minutes avec une agitation douce.Les lavages acides ont pour but de fragmenter partiellement les molécules d'ADN en fragments plus petits, ce qui permet un transfert plus efficace lors de l'analyse de Southern, et sont nécessaires en raison de la grande taille et de la forme inhabituelle des intermédiaires de réplication de l'ADN. Pour préparer le gel au transfert alcalin, rincez à nouveau le gel à l'eau, puis effectuez deux lavages dans 400 millilitres de soude à 0,4 molaire pendant 30 minutes. L'ADN contenu dans les gels est ensuite transféré sur une membrane en nylon haute performance N+ à l'aide d'un système de transfert alcalin descendant utilisant de la soude à 0,4 molaire, comme décrit dans la partie écrite de cette procédure. Laissez le transfert de l'ADN se poursuivre pendant six à douze heures, puis continuez avec l'hybridation de la sonde selon les indications du protocole écrit.Une fois que la membrane a été sondée et lavée, placez-la sur une serviette en papier jusqu'à ce que le liquide ait disparu visiblement. Ensuite, enveloppez la membrane dans un film plastique en chlorure de polyvinyle et exposez-la à un écran de révélateur phosphorescent. Enfin, la radioactivité peut être visualisée et quantifiée à l'aide d'un Storm 840 et de son logiciel ImageQuant associé.Le schéma représente le profil de migration du plasmide PBR 322 digéré par PV2, observé par analyse sur gel d'agarose 2D. Les plasmides linéaires non répliqués migrent sous forme de fragments linéaires de 4,4 kb, tandis que les plasmides en cours de réplication forment des structures en forme de Y qui migrent plus lentement que les fragments non répliqués en raison de leur taille plus importante et de leur forme non linéaire. Ce profil de migration forme un arc qui s'étend depuis la région linéaire vers le puits après irradiation UV.Des molécules en forme de double Y ou de X sont observées dans la région du cône et migrent plus lentement que l'arc de molécules en forme de Y. Un exemple de l'analyse southern sur gel 2D, réalisée avec une sonde PBR 3 22 marquée au P 32, est présenté pour des cellules prélevées immédiatement après une irradiation UV et 15 minutes après cette irradiation. Environ 1 % de l'ADN plasmidique total se retrouve dans l'arc de Y lorsque les cellules se divisent rapidement en phase exponentielle après une irradiation.Une augmentation transitoire des molécules en forme de YS est observée lorsque les fourches de réplication bloquées s'accumulent au niveau des sites endommagés. Les intermédiaires de réplication en forme de L s'accumulent également de manière transitoire et persistent jusqu'à un moment qui correspond au réparation des lésions. Nous venons de vous montrer comment visualiser les intermédiaires de réparation de l'ADN à l'aide d'une électrophorèse sur gel bidimensionnelle.Lors de cette procédure, il est important de prendre en compte les forces de cisaillement qui peuvent réduire le rendement, et de manipuler délicatement tous les échantillons et gels. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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