Induire un blocage du site de réplication spécifique dans

L'objectif général de cette expérience est d'arrêter une fourche de réplication au niveau d'un obstacle nucléoprotéique et d'observer les structures de l'ADN sur le site de cet obstacle afin d'étudier les voies de réparation de l'ADN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la réplication et la réparation de l'ADN, comme la manière dont l'ADN est traité lorsque l'appareil de réplication de la cellule rencontre un obstacle protéique. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons arrêter de façon réversible une fourche de réplication à un emplacement précis du chromosome dans une population entière de cellules vivantes.

Les membres suivants de mon laboratoire, le Dr Karla Mettrick, l'étudiante diplômante Georgia Weaver et Tayla-Ann Corocher, démontreront cette procédure. Une souche d'E.coli portant un réseau d'opérateurs de tétracycline sur le plasmide pKM1 est utilisée pour cette procédure. Le plasmide pKM1 code pour TetR-YFP, une protéine répresseur de la tétracycline marquée par une protéine fluorescente jaune, exprimée de façon inductible.

Diluez une culture fraîche de cette souche d'E.coli, incubée toute la nuit, à une densité optique à 600 nanomètres de 0,01 dans un milieu complexe dilué contenant des antibiotiques selon les besoins pour la sélection. Faites croître la culture à 30 degrés Celsius sous agitation jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres comprise entre 0,05 et 0,1. Prélevez un échantillon de 10 millilitres destiné à servir de témoin non induit.

Ajouter 0,01 % d'arabinose à la culture restante afin d'induire la production de TetR-YFP à partir du plasmide pKM1. Poursuivre la croissance des cultures non induite et induite à 30 degrés Celsius avec agitation. Après une heure, vérifier la présence d'un unique point focal dans chaque cellule de la culture induite en utilisant la microscopie de fluorescence.

Si les cellules induites sont confirmées bloquées, indiqué par plus de 70 % des cellules présentant un seul foyer, enregistrez la densité optique et prélève 7,5 millilitres de l'échantillon pour analyse par électrophorèse en gel bidimensionnel. Prélevez un échantillon équivalent à partir de la culture témoin non induite. Avant la microscopie à fluorescence, préparez les lames d'agarose afin d'empêcher le déplacement des cellules pendant la visualisation.

Pour chaque tampon d'agarose, pipeter 500 microlitres d'agarose fondue sur une lame de microscope et recouvrir immédiatement avec une lamelle avant que l'agarose ne durcisse. Conserver les lames entre des mouchoirs humides à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation. Lorsqu'il est temps d'examiner les cellules, retirer la lamelle du tampon d'agarose et pipeter 10 microlitres de culture bactérienne au centre du tampon.

Après environ cinq minutes, lorsque la lame d'agarose est sèche, remettez en place la lamelle. Déposez une goutte d'huile à immersion sur la lamelle et placez la préparation sous l'objectif. Observez les cellules en microscopie de phase avec un grossissement de 100x.

Dans la boîte de dialogue Acquérir du logiciel d'imagerie, régler le temps d'exposition sur 100 millisecondes. Sélectionner Acquérir pour capturer l'image. Ne pas déplacer la platine.

Dans la boîte de dialogue Acquired, sélectionnez YFP comme illumination pour l'obturateur externe relié à la caméra. Réglez le temps d'exposition à 1 000 millisecondes. Éteignez la lumière de la platine et sélectionnez Acquérir pour capturer l'image de fluorescence.

Pour commencer cette procédure, ajouter de l'azoture de sodium à des échantillons de culture préalablement collectés afin d'obtenir une concentration finale de 0,1 %, puis incuber sur glace pendant au moins cinq minutes. Centrifuger les cellules à 5 000 fois g pendant dix minutes. Éliminer le surnageant.

Ressuspendre chaque culot cellulaire dans 200 microlitres de tampon PIV et transférer les cellules dans un tube microcentrifuge. Microcentrifuger pour former un culot cellulaire et éliminer le surnageant. Traiter une lame de microscope avec 40 microlitres d'une solution appropriée hydrophobe pour verre ou d'une solution de silicone.

Frottez la lame avec un mouchoir jusqu'à ce qu'elle soit sèche. Resuspendez les cellules ayant la densité cellulaire la plus faible dans 50 microlitres de PIV et placez-les à 50 degrés Celsius dans un bloc chauffant. Pour tous les autres échantillons, ajustez les volumes de PIV afin que la densité cellulaire finale soit la même dans chaque tube.

Ajouter un volume égal de solution d'agarose fraîchement préparée à 0,8 % dans du PIV aux échantillons. Maintenir les échantillons dans le bloc chauffant afin de garantir une température supérieure à 50 degrés Celsius pour éviter la solidification. Déposer des gouttes de 20 microlitres de la suspension cellulaire dans l'agarose sur la lame traitée afin d'obtenir des bouchons de forme hémisphérique.

Une fois les bouchons solidifiés, faites glisser délicatement tous les bouchons provenant d'un même échantillon dans un tube microcentrifugeé et ajoutez un millilitre de tampon de lyse cellulaire. Incubez à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, retirez le tampon de lyse cellulaire et ajoutez 1 millilitre de solution EDTA-Sarkosyl-protéinase K ou solution ESP.

Incuber à 50 degrés Celsius toute la nuit ou jusqu'à ce que les plugs deviennent transparents. Une fois les plugs transparents, éliminer le tampon ESP et transférer les plugs dans un tube de 15 millilitres. Ajouter 12 millilitres de tampon TE et laisser reposer pendant 30 minutes.

Lavez les plugs un total de cinq fois avec du tampon TE. Conservez les plugs à quatre degrés Celsius dans un millilitre de tampon TE. Pour analyser les intermédiaires de réplication, l'ADN contenu dans les plugs d'agarose est digéré avec une enzyme de restriction appropriée pour la région d'intérêt.

Dans cet exemple, EcoRV coupe l'ADN juste avant le tableau, à l'intérieur du tableau et après le tableau, produisant des fragments de 5,5 kb et 6,7 kb dans la région d'intérêt. Pour commencer cette procédure, transférez un bouchon d'agarose dans un nouveau tube microfuge et ajoutez 150 microlitres de tampon pour enzyme de restriction. Ajoutez 25 à 100 unités d'enzyme de restriction et effectuez la digestion à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures.

Préparez un gel d'agarose à 0,4 % à quatre degrés Celsius. Versez 300 millilitres d'agarose fondu dans un bac à gel d'environ 25 sur 25 centimètres. Insérez un peigne afin que les puits aient une largeur approximativement équivalente au diamètre du plug.

Une fois le gel solidifié, retirez le peigne et déplacez le gel à température ambiante. À l’aide d’une anse d’inoculation, faites glisser l’un des bouchons d’agarose digérés dans un puits, en plaçant le côté plat du bouchon contre la paroi du puits par laquelle l’ADN pénétrera dans le gel. Insérez un bouchon unique de la même manière dans chaque deuxième puits.

Introduisez par pipette de l'agarose fondue à 0,4 % dans les puits afin de fixer les bouchons en place. Chargez une échelle d'ADN de 1 kb dans un puit vide, en laissant un espace entre l'échelle et les échantillons. Faites migrer le gel toute la nuit dans du TBE 1x à température ambiante.

Le jour suivant, colorer le gel dans un bain d'eau contenant 0,3 microgrammes par millilitre de bromure d'éthidium pendant 20 minutes. Visualiser l'ADN à l'aide d'un transilluminateur UV à onde longue et découper chaque fragment de piste avec une coupe droite et régulière, en minimisant l'inclusion d'excès d'agarose de chaque côté de la piste. Placer la piste de gel excisée dans un bac à gel à 90 degrés par rapport à la direction de migration de l'ADN.

L'étape suivante consiste à préparer 300 millilitres d'agarose pour le gel de seconde dimension. Lorsque l'agarose a refroidi à 50 degrés Celsius, pipetez l'agarose fondue autour des tranches de gel pour solidifier leur position. Versez l'agarose restante dans le bac jusqu'à une profondeur au moins égale à celle des tranches de gel.

Une fois le gel solidifié, faire une électrophorèse dans du TBE 1x contenant 0,3 microgramme par millilitre de bromure d'éthidium à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que l'ADN ait migré d'environ 10 centimètres. Découper les blocs où l'ADN génomique est présent, y compris le gel au-dessus, afin d'inclure l'ADN non visible. L'ADN contenu dans le gel est ensuite visualisé par hybridation de type Southern, comme décrit dans le protocole écrit.

Dans ce système, un blocage de la réplication a été confirmé par la présence, dans la majorité des cellules, d'un seul foyer correspondant à une copie unique de l'arrangement au sein de la cellule. L'ajout d'anhydrotétracycline a inversé ce blocage, et la duplication subséquente de l'arrangement a été visualisée par l'accumulation de cellules présentant plusieurs foyers. Les cellules dont la réplication était bloquée présentaient également une inhibition de croissance, qui était inversée par une croissance ultérieure en présence d'anhydrotétracycline.

Pour analyser les intermédiaires de réplication, l'ADN a été électrophorésé en première dimension. L'ADN d'intérêt a ensuite été excisé et une électrophorèse en seconde dimension a donné une diagonale d'ADN linéaire. L'hybridation de Southern de l'ADN du réseau a révélé deux taches dans l'échantillon non bloqué, correspondant aux fragments attendus de 5,5 kb et 6,7 kb du réseau.

L'échantillon bloqué a montré une diminution du spot de 5,5 kb et l'apparition d'un signal elliptique indiquant une accumulation d'ADN en forme de Y. L'ajout d'anhydrotétracycline a éliminé le signal d'ADN en forme de Y. Un autre intermédiaire courant est la jonction de Holliday, visualisée comme un signal en forme de cône au sommet de l'arc en Y et un pic provenant de l'ADN linéaire à l'extrémité de l'arc en Y.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit jours si elle est correctement effectuée. Bien qu'il s'agisse d'une procédure en 2D, il est essentiel de se rappeler que la qualité des plugs d'ADN est cruciale pour une visualisation optimale des structures d'ADN.