Name: Induire un blocage du site de réplication spécifique dans E. coli Utilisation dun système fluorescent répresseur opérateur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Apprenez à bloquer les fourches de réplication dans Escherichia coli à l'aide d'un système répresseur-opérateur fluorescent. Cette méthode permet d'observer les structures d'ADN et d'étudier les voies de réparation cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par le Conseil australien de la recherche [DP11010246].

<ol><li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+stalling+at+natural+impediments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li>
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<li>Mettrick, K. A., Grainge, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+blocked+replication+forks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of blocked replication forks in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Church, G. M., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).</li>
<li>Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Lors de la duplication chromosomique, la machinerie de réplication rencontrera divers obstacles qui empêchent sa progression. Pour s’assurer que l’ensemble du chromosome d’origine unique est répliqué, les bactéries disposent de nombreuses voies de réparation de l’ADN qui permettent ensuite au réplisome d’être rechargé20,21. Les lésions, les cassures simple brin, les cassures double brin et les protéines étroitement liées à l’ADN peuvent chacune être traitées à l’aide d’une voie dédiée, bien qu’il soit probable...

Lors de la réplication de l&#39;ADN, l&#39;replisome fait face à des obstacles sur l&#39;ADN qui entrave sa progression. Lésions de l&#39; ADN , y compris les lésions et les lacunes ainsi que des structures aberrantes peuvent empêcher la replisome de procéder 1. Récemment, il a été découvert que les protéines liées à l&#39;ADN sont la source la plus courante d&#39;obstacle à la progression de la replication fourche 2. La connaissance des événements suivants la rencontre de l&#39;replisome avec un bloc de nucléoprotéine a déjà été limitée par l&#39;incapacité à induire un tel bloc dans le chromosome d&#39;une cellule vivante à un endroit connu. Analyse in vitro a permis d&#39; améliorer notre compréhension du comportement cinétique d&#39;un replisome actif lorsqu&#39;il rencontre un blocage de la nucléoprotéine 3, ainsi que les détails mécanistiques de la replisome lui - même 4,5. La compréhension actuelle de la réparation de la réplication est généralement réalisée avec UV comme agent dommageable et étudié en utilisant l&#39; ADN plasmidique in vivo 6-8 </sup&gt;. Alors que les protéines qui peuvent être impliqués dans la réparation de l&#39; ADN après il rencontre un in vivo bloc de nucléoprotéine sont généralement compris à partir de ces études, s&#39;il y a des variations dans les événements moléculaires dans les voies de réparation en raison de la cause distincte dans le bloc de réplication est toujours encore être déterminé. Ici, nous décrivons un système qui permet à un bloc de nucléoprotéine à établir dans un emplacement spécifique du chromosome en utilisant un système opérateur répresseur Fluorescent (FROS). Nous utilisons une souche de E. coli qui a eu un réseau de 240 sites de tetO incorporés dans le chromosome 9. Chaque site tetO dans la matrice présente une séquence aléatoire de 10 pb flanquant pour augmenter la stabilité du réseau , en empêchant la recombinaison médiée par RecA dans le tableau. Ce tableau, et les variations de celle - ci, ont été initialement utilisées pour comprendre E. coli dynamique des chromosomes 10,11 , mais ont ensuite été adaptés à prevent in vivo de la réplication 12. Le tableau a été trouvé pour être maintenu de manière stable et de bloquer près de 100% des fourches de réplication lorsqu&#39;ils sont liés par TetR 10,12. L&#39;utilisation de la matrice lacO similaire in vitro a trouvé aussi peu que 22 sites étaient suffisants pour bloquer 90% de la replication, bien que cette gamme courte est moins efficace in vivo 13. Pour adapter le réseau pour créer un blocage de la nucléoprotéine, la protéine répresseur doit être fortement surproduit dans des conditions optimisées où il se lie alors à la matrice pour créer un barrage routier. La formation du blocage, et sa libération subséquente, peuvent être contrôlés par l&#39;utilisation de la microscopie à fluorescence si un variant étiqueté par fluorescence du répresseur Tet est utilisé. L&#39;état de la réplication dans chaque cellule est indiquée par le nombre de foyers vu, où un point focal unique signifie une seule copie du tableau est présent dans la cellule et plusieurs foyers sont révélateurs de la réplication active. Cette nouvelle activitéplicature est activé lorsque le blocage de la nucléoprotéine est inversée par l&#39;addition de l&#39;inducteur gratuit qui diminue l&#39;affinité de liaison de TetR pour le site de l&#39;opérateur suffisamment pour que le replisome se fasse à travers la matrice. La protéine répresseur est encore capable de se lier à l&#39;ADN avec une affinité suffisamment élevée pour que les maintenant des copies multiples du réseau peut être visualisée. Plus de détails complexes des événements au blocage de la nucléoprotéine peuvent être découverts en utilisant neutre neutre à deux dimensions électrophorèse sur gel d&#39; agarose et hybridation Southern 14-16. Ces techniques permettent l&#39;analyse des structures d&#39;ADN dans la population. Les intermédiaires de réplication qui sont formés lors de l&#39;événement, et potentiellement restent unrepaired, peuvent être visualisées. En faisant varier l&#39;enzyme de restriction et des sondes utilisées, les intermédiaires peuvent être visualisées non seulement dans la région de matrice mais aussi en amont de la matrice lorsque la fourche de réplication régresse 17,18. lerégression a lieu à la suite de la dissociation de replisome; les brins avancés et retardés naissants se séparent des brins de matrice et recuire les uns aux autres les brins de matrice simultanément ré-annelage résultant en une structure d&#39;ADN à quatre voies (une jonction de Holliday). En utilisant ce système , il a été démontré que la fourche de réplication est instable lorsqu&#39;il rencontre ce bloc 18. En outre, des dérivés sensibles à la température des composants de replisome peuvent être utilisés pour empêcher le rechargement de la fourche de réplication lorsqu&#39;elle est effondrée. Une fois qu&#39;un bloc est établie, la déformation peut être déplacé à une température non permissive pour assurer une désactivation synchrone du réplisome et la prévention contrôlée de rechargement. Cette désactivation induite par la température assure toutes les fourches au sein de la population se sont effondrés à un moment donné et permet l&#39;évaluation de ce qui se passe lorsque le replisome effondre, comment l&#39;ADN est traité, et ce qui est nécessaire pour rétablircommencer le processus de réplication de l&#39;ADN. Un avantage du système décrit ici est que le bloc de nucléoprotéine est totalement réversible; Par conséquent, la capacité des cellules à récupérer à partir du bloc de nucléoprotéine est susceptible d&#39;être suivie. L&#39;ajout de anhydrotétracycline les cellules soulagera la liaison étanche du répresseur, ce qui permet une fourche de réplication pour passer à travers et la cellule de retrouver la viabilité. Le soulagement de l&#39;obstruction peut être visualisée par électrophorèse neutre neutre sur un gel d&#39;agarose à deux dimensions, après 5 min, et par la microscopie à 10 min. En outre, l&#39;analyse de la viabilité peut révéler l&#39;aptitude de la souche à récupérer le blocage de réplication et continuent à proliférer. En modifiant le fond génétique des souches utilisées dans le mode opératoire expérimental décrit ici, les voies de réparation de ce type de blocage peut être élucidés.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>Composant du milieu de croissance</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>Composant du milieu de croissance</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>Composant du milieu de croissance</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Composant du milieu de croissance ; Composant tampon potassique</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Composant de milieu de croissance ; Composant tampon potassique</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>Pour l’induction de la production de TetR-YFP</td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’anhydrotétracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>Libération du bloackage de réplication</td></tr><tr><td>Axioskop 2 Microscope à fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>Visualisation des cellules</td></tr><tr><td>Kit de filtres eYFP</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>Visualisation de la</td></tr><tr><td>caméra CCD</td> YFP <td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>Visualisation des cellules</td></tr><tr><td>MetaMorph Logiciel (Molecular Devices)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 utilisé dans la préparation de ce manuscrit</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>Pour les bouchons d’agarose et l’électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>Verre original Hydrofuge (Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>Pour la fabrication de bouchons d’agarose</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE, composant</td></tr> <tr><td>tampon TBEAcide éthylène diaminetétraacétique</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0,5 M EDTA solution de sel disodique ajustée à pH 8,0 avec NaOH.</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Agent bactériostatique</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>Composant tampon TE</td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Composant tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sel de sodium (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>Composant tampon de lyse cellulaire et ESP</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Composant tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>Composant tampon de lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>Composant tampon ESP</td></tr> Modèle <tr><td>de sous-cellule 192 Cellule</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>Système d’électrophorèse</td></tr><tr><td>Transilluminateur UV 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>Visualisation de l’ADN</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>BioRad</td><td>1610433</td><td>Visualisation de l’ADN</td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>Composant TBE</td></tr><tr><td>Hybond-XL Nylon Memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) peut également être utilisé</td></tr><tr><td>Papier de chromatographie Whatman</td><td>3MM GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blot</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>Réticulation de l’ADN et hybridation</td></tr><tr><td>Acide désoxyribonucléique du sperme de saumon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>Composant du tampon d’hybridation</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Composant du tampon de dénaturation</td></tr><tr><td>Citrate trisodique dihydraté</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>Tampon de transfert</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Composant tampon de lavage</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Composant tampon d’hybridation</td></tr><tr><td>Amorces hexamères aléatoires</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Fragment de Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5'-triphosphate-32P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage Écran au phosphore</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E écran polyvalent standard de 35 cm x 43 cm</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Visualisation du transfert Bouteille d’hybridation</td></tr><tr><td></td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

induire un blocage du site de réplication spécifique dans<i&gt; e. coli</i&gt; utilisation d&#39;un système fluorescent répresseur opérateur

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Les obstacles présents sur l&#39;ADN, y compris des protéines étroitement liés et lésions diverses, peuvent gravement entraver la progression de la machinerie de réplication de la cellule. Le blocage d&#39;un replisome peut conduire à sa dissociation du chromosome, en partie ou intégralement, ce qui conduit à l&#39;effondrement de la fourche de réplication. La récupération de cet effondrement est une nécessité pour la cellule de précision complète de duplication chromosomique et diviser ultérieurement. divers mécanismes Par conséquent, lorsque l&#39;effondrement se produit, la cellule a évolué qui ont lieu pour restaurer la fourche de l&#39;ADN et permettre la réplication à compléter avec une grande fidélité. Auparavant, ces voies réplication de réparation dans les bactéries ont été étudiés en utilisant les dommages UV, ce qui présente l&#39;inconvénient de ne pas être localisée sur un site connu. Ce manuscrit décrit un système utilisant un système Fluorescence répresseur opérateur (FROS) pour créer un bloc de protéine spécifique au site qui peut induire le blocage et l&#39;effondrement de la réplication forks dans Escherichia coli. Protocoles détail comment l&#39;état de la réplication peut être visualisée dans des cellules vivantes simples en utilisant la microscopie de fluorescence et de réplication d&#39;ADN intermédiaires peut être analysée par électrophorèse sur gel d&#39;agarose à 2 dimensions. Des mutants sensibles à la température des composants de replisome (par exemple DnaBts) peuvent être incorporés dans le système pour provoquer un effondrement synchrone des fourches de réplication. En outre, les rôles des protéines de recombinaison et hélicases qui sont impliqués dans ces processus peuvent être étudiés en utilisant débouchures génétiques au sein de ce système.

Le FROS est un bloc de nucléoprotéine spécifique au site inductible qui permet des intermédiaires de réplication à visualiser dans les cellules vivantes 12,18. Une conception expérimentale générale pour l&#39; échantillonnage des cellules est illustrée à la figure 1. Le moment de l&#39;échantillonnage et des variations de fond génétique font un système polyvalent pour l&#39; étude de la réparation d&#39;un tel bloc. Le schéma illustre comment des mutants sensi...

Nous décrivons ici un système utilisant un bloc protéique in vivo réversible spécifique au site pour bloquer et effondrer les fourches de réplication chez Escherichia coli. L’établissement du bloc de réplication est évalué par microscopie à fluorescence et l’électrophorèse sur gel d’agarose neutre-neutre est utilisée pour visualiser les intermédiaires de réplication.

Induire un blocage du site de réplication spécifique dans<i&gt; E. coli</i&gt; Utilisation d&#39;un système fluorescent répresseur opérateur

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

L'objectif général de cette expérience est d'arrêter une fourche de réplication au niveau d'un obstacle nucléoprotéique et d'observer les structures de l'ADN sur le site de cet obstacle afin d'étudier les voies de réparation de l'ADN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la réplication et la réparation de l'ADN, comme la manière dont l'ADN est traité lorsque l'appareil de réplication de la cellule rencontre un obstacle protéique. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons arrêter de façon réversible une fourche de réplication à un emplacement précis du chromosome dans une population entière de cellules vivantes.Les membres suivants de mon laboratoire, le Dr Karla Mettrick, l'étudiante diplômante Georgia Weaver et Tayla-Ann Corocher, démontreront cette procédure. Une souche d'E.coli portant un réseau d'opérateurs de tétracycline sur le plasmide pKM1 est utilisée pour cette procédure. Le plasmide pKM1 code pour TetR-YFP, une protéine répresseur de la tétracycline marquée par une protéine fluorescente jaune, exprimée de façon inductible.Diluez une culture fraîche de cette souche d'E.coli, incubée toute la nuit, à une densité optique à 600 nanomètres de 0,01 dans un milieu complexe dilué contenant des antibiotiques selon les besoins pour la sélection. Faites croître la culture à 30 degrés Celsius sous agitation jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres comprise entre 0,05 et 0,1. Prélevez un échantillon de 10 millilitres destiné à servir de témoin non induit.Ajouter 0,01 % d'arabinose à la culture restante afin d'induire la production de TetR-YFP à partir du plasmide pKM1. Poursuivre la croissance des cultures non induite et induite à 30 degrés Celsius avec agitation. Après une heure, vérifier la présence d'un unique point focal dans chaque cellule de la culture induite en utilisant la microscopie de fluorescence.Si les cellules induites sont confirmées bloquées, indiqué par plus de 70 % des cellules présentant un seul foyer, enregistrez la densité optique et prélève 7,5 millilitres de l'échantillon pour analyse par électrophorèse en gel bidimensionnel. Prélevez un échantillon équivalent à partir de la culture témoin non induite. Avant la microscopie à fluorescence, préparez les lames d'agarose afin d'empêcher le déplacement des cellules pendant la visualisation.Pour chaque tampon d'agarose, pipeter 500 microlitres d'agarose fondue sur une lame de microscope et recouvrir immédiatement avec une lamelle avant que l'agarose ne durcisse. Conserver les lames entre des mouchoirs humides à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation. Lorsqu'il est temps d'examiner les cellules, retirer la lamelle du tampon d'agarose et pipeter 10 microlitres de culture bactérienne au centre du tampon.Après environ cinq minutes, lorsque la lame d'agarose est sèche, remettez en place la lamelle. Déposez une goutte d'huile à immersion sur la lamelle et placez la préparation sous l'objectif. Observez les cellules en microscopie de phase avec un grossissement de 100x.Dans la boîte de dialogue Acquérir du logiciel d'imagerie, régler le temps d'exposition sur 100 millisecondes. Sélectionner Acquérir pour capturer l'image. Ne pas déplacer la platine.Dans la boîte de dialogue Acquired, sélectionnez YFP comme illumination pour l'obturateur externe relié à la caméra. Réglez le temps d'exposition à 1 000 millisecondes. Éteignez la lumière de la platine et sélectionnez Acquérir pour capturer l'image de fluorescence.Pour commencer cette procédure, ajouter de l'azoture de sodium à des échantillons de culture préalablement collectés afin d'obtenir une concentration finale de 0,1 %, puis incuber sur glace pendant au moins cinq minutes. Centrifuger les cellules à 5 000 fois g pendant dix minutes. Éliminer le surnageant.Ressuspendre chaque culot cellulaire dans 200 microlitres de tampon PIV et transférer les cellules dans un tube microcentrifuge. Microcentrifuger pour former un culot cellulaire et éliminer le surnageant. Traiter une lame de microscope avec 40 microlitres d'une solution appropriée hydrophobe pour verre ou d'une solution de silicone.Frottez la lame avec un mouchoir jusqu'à ce qu'elle soit sèche. Resuspendez les cellules ayant la densité cellulaire la plus faible dans 50 microlitres de PIV et placez-les à 50 degrés Celsius dans un bloc chauffant. Pour tous les autres échantillons, ajustez les volumes de PIV afin que la densité cellulaire finale soit la même dans chaque tube.Ajouter un volume égal de solution d'agarose fraîchement préparée à 0,8 % dans du PIV aux échantillons. Maintenir les échantillons dans le bloc chauffant afin de garantir une température supérieure à 50 degrés Celsius pour éviter la solidification. Déposer des gouttes de 20 microlitres de la suspension cellulaire dans l'agarose sur la lame traitée afin d'obtenir des bouchons de forme hémisphérique.Une fois les bouchons solidifiés, faites glisser délicatement tous les bouchons provenant d'un même échantillon dans un tube microcentrifugeé et ajoutez un millilitre de tampon de lyse cellulaire. Incubez à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, retirez le tampon de lyse cellulaire et ajoutez 1 millilitre de solution EDTA-Sarkosyl-protéinase K ou solution ESP.Incuber à 50 degrés Celsius toute la nuit ou jusqu'à ce que les plugs deviennent transparents. Une fois les plugs transparents, éliminer le tampon ESP et transférer les plugs dans un tube de 15 millilitres. Ajouter 12 millilitres de tampon TE et laisser reposer pendant 30 minutes.Lavez les plugs un total de cinq fois avec du tampon TE. Conservez les plugs à quatre degrés Celsius dans un millilitre de tampon TE. Pour analyser les intermédiaires de réplication, l'ADN contenu dans les plugs d'agarose est digéré avec une enzyme de restriction appropriée pour la région d'intérêt.Dans cet exemple, EcoRV coupe l'ADN juste avant le tableau, à l'intérieur du tableau et après le tableau, produisant des fragments de 5,5 kb et 6,7 kb dans la région d'intérêt. Pour commencer cette procédure, transférez un bouchon d'agarose dans un nouveau tube microfuge et ajoutez 150 microlitres de tampon pour enzyme de restriction. Ajoutez 25 à 100 unités d'enzyme de restriction et effectuez la digestion à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures.Préparez un gel d'agarose à 0,4 % à quatre degrés Celsius. Versez 300 millilitres d'agarose fondu dans un bac à gel d'environ 25 sur 25 centimètres. Insérez un peigne afin que les puits aient une largeur approximativement équivalente au diamètre du plug.Une fois le gel solidifié, retirez le peigne et déplacez le gel à température ambiante. À l’aide d’une anse d’inoculation, faites glisser l’un des bouchons d’agarose digérés dans un puits, en plaçant le côté plat du bouchon contre la paroi du puits par laquelle l’ADN pénétrera dans le gel. Insérez un bouchon unique de la même manière dans chaque deuxième puits.Introduisez par pipette de l'agarose fondue à 0,4 % dans les puits afin de fixer les bouchons en place. Chargez une échelle d'ADN de 1 kb dans un puit vide, en laissant un espace entre l'échelle et les échantillons. Faites migrer le gel toute la nuit dans du TBE 1x à température ambiante.Le jour suivant, colorer le gel dans un bain d'eau contenant 0,3 microgrammes par millilitre de bromure d'éthidium pendant 20 minutes. Visualiser l'ADN à l'aide d'un transilluminateur UV à onde longue et découper chaque fragment de piste avec une coupe droite et régulière, en minimisant l'inclusion d'excès d'agarose de chaque côté de la piste. Placer la piste de gel excisée dans un bac à gel à 90 degrés par rapport à la direction de migration de l'ADN.L'étape suivante consiste à préparer 300 millilitres d'agarose pour le gel de seconde dimension. Lorsque l'agarose a refroidi à 50 degrés Celsius, pipetez l'agarose fondue autour des tranches de gel pour solidifier leur position. Versez l'agarose restante dans le bac jusqu'à une profondeur au moins égale à celle des tranches de gel.Une fois le gel solidifié, faire une électrophorèse dans du TBE 1x contenant 0,3 microgramme par millilitre de bromure d'éthidium à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que l'ADN ait migré d'environ 10 centimètres. Découper les blocs où l'ADN génomique est présent, y compris le gel au-dessus, afin d'inclure l'ADN non visible. L'ADN contenu dans le gel est ensuite visualisé par hybridation de type Southern, comme décrit dans le protocole écrit.Dans ce système, un blocage de la réplication a été confirmé par la présence, dans la majorité des cellules, d'un seul foyer correspondant à une copie unique de l'arrangement au sein de la cellule. L'ajout d'anhydrotétracycline a inversé ce blocage, et la duplication subséquente de l'arrangement a été visualisée par l'accumulation de cellules présentant plusieurs foyers. Les cellules dont la réplication était bloquée présentaient également une inhibition de croissance, qui était inversée par une croissance ultérieure en présence d'anhydrotétracycline.Pour analyser les intermédiaires de réplication, l'ADN a été électrophorésé en première dimension. L'ADN d'intérêt a ensuite été excisé et une électrophorèse en seconde dimension a donné une diagonale d'ADN linéaire. L'hybridation de Southern de l'ADN du réseau a révélé deux taches dans l'échantillon non bloqué, correspondant aux fragments attendus de 5,5 kb et 6,7 kb du réseau.L'échantillon bloqué a montré une diminution du spot de 5,5 kb et l'apparition d'un signal elliptique indiquant une accumulation d'ADN en forme de Y. L'ajout d'anhydrotétracycline a éliminé le signal d'ADN en forme de Y. Un autre intermédiaire courant est la jonction de Holliday, visualisée comme un signal en forme de cône au sommet de l'arc en Y et un pic provenant de l'ADN linéaire à l'extrémité de l'arc en Y.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit jours si elle est correctement effectuée. Bien qu'il s'agisse d'une procédure en 2D, il est essentiel de se rappeler que la qualité des plugs d'ADN est cruciale pour une visualisation optimale des structures d'ADN.

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