Induire un blocage du site de réplication spécifique dans E. coli Utilisation d'un système fluorescent répresseur opérateur

L’objectif global de cette expérience est de bloquer une fourche de réplication au niveau d’un bloc de nucléoprotéines et d’observer les structures de l’ADN sur le site du bloc dans le but d’étudier les voies de réparation de l’ADN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la réplication et la réparation de l’ADN, telles que la façon dont l’ADN est traité lorsque l’appareil de réplication de la cellule rencontre un barrage protéique. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons bloquer de manière réversible une fourche de réplication à un endroit spécifique du chromosome dans toute une population de cellules vivantes.

Les membres suivants de mon laboratoire, la Dre Karla Mettrick, et les étudiantes diplômées, Georgia Weaver et Tayla-Ann Corocher, feront la démonstration de cette procédure. Une souche d’E. coli portant un réseau d’opérateurs de tétracycline dans le plasmide pKM1 est utilisée pour cette procédure. pKM1 code pour TetR-YFP, une protéine répressrice tétracycline inductible marquée par une protéine fluorescente jaune.

Diluer une culture fraîche de nuit de cette souche d’E. coli à une densité optique de 600 nanomètres de 0,01 dans un milieu complexe dilué avec des antibiotiques au besoin pour la sélection. Cultivez la culture à 30 degrés Celsius avec agitation jusqu’à une densité optique de 600 nanomètres de 0,05 à 0,1. Prélever un échantillon de 10 millilitres pour servir de témoin non induit.

Ajouter 0,01 % d’arabinose à la culture restante pour induire la production de TetR-YFP à partir de pKM1. Continuez à cultiver les cultures non induites et induites à 30 degrés Celsius en secouant. Au bout d’une heure, vérifiez la présence d’un seul point focal dans chaque cellule de la culture induite à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Si les cellules induites sont confirmées bloquées, ce qui est indiqué par plus de 70 % des cellules ayant un seul foyer, enregistrez la densité optique et prélevez 7,5 millilitres de l’échantillon pour analyse par électrophorèse sur gel bidimensionnelle. Prélever un échantillon équivalent de la culture témoin non induite. Avant la microscopie à fluorescence, préparez les coussinets d’agarose pour empêcher le mouvement des cellules pendant la visualisation.

Pour chaque tampon d’agarose, pipetez 500 microlitres d’agarose fondu sur une lame de microscope et superposez la lamelle immédiatement avant que l’agarose ne se solidifie. Rangez les lames entre les tissus humides à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Lorsqu’il est temps de vérifier les cellules, retirez la lamelle du tampon d’agarose et pipetez 10 microlitres de culture bactérienne au centre du tampon.

Après environ cinq minutes, lorsque le tampon d’agarose a séché, remplacez la lamelle. Placez une goutte d’huile d’immersion sur la lamelle et placez la lame sous l’optique. Visualisez les cellules à l’aide de la microscopie de phase à un grossissement de 100x.

Dans la boîte de dialogue Acquérir du logiciel d’imagerie, définissez le temps d’exposition sur 100 millisecondes. Sélectionnez Acquérir pour capturer l’image. Ne déplacez pas la scène.

Dans la boîte de dialogue Acquis, sélectionnez YFP comme éclairage pour l’obturateur externe lié à l’appareil photo. Réglez le temps d’exposition sur 1 000 millisecondes. Éteignez la lumière de la scène et sélectionnez Acquérir pour capturer l’image de fluorescence.

Pour commencer cette procédure, ajoutez de l’azoture de sodium aux échantillons de culture précédemment prélevés jusqu’à une concentration finale de 0,1 % et incubez sur de la glace pendant au moins cinq minutes. Centrifugez les cellules à 5 000 fois g pendant dix minutes. Jetez le surnageant.

Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans 200 microlitres de tampon PIV et transférez les cellules dans un tube à microfuge. Microcentrifugeuse pour granuler les cellules et jeter le surnageant. Traitez une lame de microscope avec 40 microlitres d’un verre approprié, d’un hydrofuge ou d’une solution de silicone.

Frottez la lame avec un mouchoir en papier jusqu’à ce qu’elle soit sèche. Remettez en suspension les cellules avec la densité cellulaire la plus faible dans 50 microlitres de PIV et placez-les à 50 degrés Celsius dans un bloc de chaleur. Pour tous les autres échantillons, ajustez les volumes de PIV de sorte que la densité cellulaire finale soit la même dans chaque tube.

Ajouter aux échantillons un volume égal de solution d’agarose à 0,8 % fraîchement préparée dans le PIV. Conservez les échantillons dans le bloc chauffant pour vous assurer qu’ils sont au-dessus de 50 degrés Celsius afin d’éviter la solidification. Placez 20 gouttes d’un microlitre de suspension d’agarose cellulaire sur la lame traitée pour produire des bouchons hémisphériques.

Lorsque les bouchons se sont solidifiés, glissez doucement tous les bouchons d’un échantillon dans un seul tube de microfuge et ajoutez un millilitre de tampon de lyse cellulaire. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, retirez le tampon de lyse cellulaire et ajoutez 1 millilitre de solution EDTA-Sarkosyl-Proteinase K ou ESP.

Incuber à 50 degrés Celsius pendant la nuit ou jusqu’à ce que les mottes soient transparentes. Une fois que les bouchons sont transparents, retirez le tampon ESP et transférez les bouchons dans un tube de 15 millilitres. Ajouter 12 millilitres de tampon TE et laisser reposer 30 minutes.

Lavez les bouchons au total cinq fois avec le tampon TE. Stockez les bouchons à quatre degrés Celsius dans un millilitre de tampon TE. Pour analyser les intermédiaires de réplication, l’ADN des bouchons d’agarose est digéré à l’aide d’une enzyme de restriction appropriée pour la région d’intérêt.

Dans cet exemple, EcoRV coupe l’ADN immédiatement avant le réseau, à l’intérieur du réseau et après le réseau, pour donner des fragments de 5,5 kb et 6,7 kb dans la région d’intérêt. Pour commencer cette procédure, transférez un bouchon d’agarose dans un nouveau tube de microfuge et ajoutez 150 microlitres de tampon d’enzyme de restriction. Ajoutez 25 à 100 unités d’enzyme de restriction et digérez à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures.

Préparez un gel d’agarose à 0,4 % à quatre degrés Celsius. Versez 300 millilitres d’agarose fondu dans un plateau de gel d’environ 25 par 25 centimètres. Insérez un peigne pour faire en sorte que les puits aient à peu près la même largeur que le diamètre du bouchon.

Lorsque le gel est pris, retirez le peigne et déplacez le gel à température ambiante. À l’aide d’une boucle d’inoculation, glissez l’un des bouchons d’agarose digérée dans un puits, en positionnant le côté plat du bouchon contre le côté du puits où l’ADN entrera dans le gel. Insérez un seul bouchon de la même manière dans un puits sur deux.

Pipette fondue à 0,4 % dans les puits pour sceller les bouchons en position. Chargez une échelle d’ADN d’un kb dans un puits vide, en laissant un espace entre l’échelle et les échantillons. Faites couler le gel toute la nuit dans 1xTBE à température ambiante.

Le lendemain, colorez le gel dans un bain-marie contenant 0,3 microgramme par millilitre de bromure d’éthidium pendant 20 minutes. Visualisez l’ADN à l’aide d’un transilluminateur UV à ondes longues et découpez chaque fragment de voie avec une coupe droite et régulière, minimisant ainsi l’inclusion d’un excès d’agarose de chaque côté de la voie. Placez la voie de gel excisée dans un plateau de gel à 90 degrés dans la direction de la migration de l’ADN.

L’étape suivante consiste à préparer 300 millilitres d’agarose pour le gel de deuxième dimension. Lorsque l’agarose est refroidie à 50 degrés Celsius, pipetez l’agarose fondue autour des tranches de gel pour solidifier leur position. Versez le reste de l’agarose dans le plateau à une profondeur au moins au niveau des tranches de gel.

Une fois le gel solidifié, électrophorèse en 1xTBE contenant 0,3 microgramme par millilitre de bromure d’éthidium à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que l’ADN ait migré d’environ 10 centimètres. Excisez les blocs où l’ADN génomique est présent, y compris le gel au-dessus, pour inclure l’ADN qui n’est pas visible. L’ADN à l’intérieur du gel est ensuite visualisé par hybridation Southern comme décrit dans le protocole textuel.

Dans ce système, un bloc de réplication a été confirmé par une majorité de cellules contenant un foyer correspondant à une copie du réseau à l’intérieur de la cellule. L’ajout d’anhydrotétracycline a inversé le bloc et la duplication ultérieure de la matrice a été visualisée comme l’accumulation de cellules avec plusieurs foyers. Les cellules dont la réplication était bloquée ont également montré une inhibition de la croissance qui a été inversée par la croissance ultérieure en présence d’anhydrotétracycline.

Pour analyser les intermédiaires de réplication, l’ADN a été électrophorisé dans la première dimension. L’ADN d’intérêt a ensuite été excisé et une électrophorèse de deuxième dimension a abouti à une diagonale d’ADN linéaire. L’hybridation sud de l’ADN de la puce a révélé deux points dans l’échantillon non bloqué correspondant aux fragments attendus de 5,5 kb et 6,7 kb de la puce.

L’échantillon bloqué a montré une diminution de la tache de 5,5 kb et l’ajout d’un signal elliptique indiquant une accumulation d’ADN en forme de Y. L’ajout d’anhydrotétracycline a éliminé le signal d’ADN en forme de Y. Un autre intermédiaire commun est la jonction de Holliday visualisée comme un signal conique au sommet de l’arc Y et un pic de l’ADN linéaire à la fin de l’arc Y.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit jours si elle est correctement préformée. Bien qu’il s’agisse d’une procédure 2D, il est important de se rappeler que la qualité des bouchons d’ADN est essentielle pour la visualisation optimale des structures de l’ADN.