Préparation et transformation de bactéries par électroporation à haute tension

Commencez avec un tube contenant des bactéries inoculées dans un milieu nutritif.

Incuber en secouant jusqu’à ce que les cellules atteignent la phase de division active.

Centrifuger pour collecter les cellules et jeter le surnageant.

Lavez à plusieurs reprises les cellules avec du glycérol glacé pour éliminer les sels et remettez-les en suspension dans le glycérol pour maintenir la viabilité cellulaire.

Préparez un plasmide contenant un gène de résistance aux antibiotiques dans de l’eau stérile avec de l’EDTA pour empêcher la dégradation de l’ADN.

Mélangez la solution plasmidique avec les cellules bactériennes.

Appliquez une courte impulsion à haute tension pour créer temporairement des pores dans la membrane bactérienne.

Cela permet à l’ADN plasmidique de pénétrer dans le cytoplasme.

Transférez immédiatement les cellules dans un milieu de récupération et incubez en secouant.

Les composants du milieu favorisent la réparation membranaire et l’expression des gènes de résistance aux antibiotiques codés par plasmide.

Étalez les cellules sur de la gélose nutritive contenant l’antibiotique et incubez jusqu’à ce que des colonies se forment.

Choisissez une seule colonie et étalez-la sur une assiette fraîche pour purifier les transformants.

Pour commencer l’expérience, préparez des cellules électrocompétentes de la souche Top 10 d’E. coli .

Transférez une seule colonie dans un millilitre de milieu LB. Incuber le tube à 37 degrés Celsius tout en le secouant à 180 tr/min. Diluez la pré-culture à 500 dans 25 millilitres de milieu LB frais et incubez la culture à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase logarithmique 0,6 OD. Centrifugez la suspension cellulaire à 5 000 tr/min pendant 20 minutes.

Après la centrifugation, remettez en suspension le granulé dans 25 millilitres de 10 % volume par volume, de l’eau glycérole glacée et stérile, et répétez cette étape quatre fois, en ayant le volume de remise en suspension à chaque fois jusqu’à ce que 1,5 millilitres soit atteint.

Ensuite, remettez en suspension la pastille dans 10 % de glycérol et divisez la suspension cellulaire en aliquotes de 50 microlitres. Conservez les aliquotes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à six mois. Pour poursuivre l’expérience, dissoudre le plasmide souhaité dans de l’eau stérile complétée par 0,5 millimolaire d’EDTA, et décongeler une aliquote de cellules électrocompétentes sur de la glace.

Ajoutez 2,5 à 5 nanogrammes de vecteur et mélangez les cellules décongelées. Distribuez les cellules dans une cuvette de 0,1 centimètre. Appliquez une impulsion de 1,8 kilovolt aux cellules et transférez immédiatement les cellules électroporées dans un millilitre de milieu SOC.

Incuber les cellules en agitant pendant une heure, transférez 100 aliquotes de 100 microlitres dans des boîtes de Pétri contenant de la gélose LB et de l’antibiotique, et incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Purifiez les transformants en striant des colonies uniques sur des boîtes de Pétri.