Visualisation du stress oxydatif induit par un pathogène chez C. elegans à l’aide de SKN-1 marqué GFP

Commencez par deux plaques contenant des vers C. elegans qui expriment du SKN-1 vert fluorescent marqué par une protéine SKN-1, un facteur de transcription localisé dans le cytoplasme intestinal. Ces vers contiennent également des granules intestinaux de lipofuscine qui présentent une autofluorescence.

Une plaque est ensemencée avec des bactéries non pathogènes comme groupe témoin, l’autre avec des bactéries pathogènes comme groupe test.

Dans le groupe test, le peroxyde d’hydrogène produit par le pathogène induit un stress oxydatif, déclenchant la translocation de SKN-1 vers les noyaux intestinaux.

Dans le groupe témoin, la majorité de SKN-1 reste diffusement répartie dans le cytoplasme.

Lavez chaque plaque avec un tampon et transférez les vers dans des tubes.

Centrifugeuse pour séparer les vers et retirer le tampon.

Ajoutez un milieu contenant de l’azide de sodium pour les anesthésier.

Montez les vers sur des coussinets d’agarose, placez des couvercles et observez au microscope à fluorescence. Utilisez l’autofluorescence pour visualiser les frontières nucléaires.

Un signal nucléaire fort de SKN-1 lors du test, par rapport au signal cytoplasmique diffus dans les témoins, indique une relocalisation nucléaire et confirme le stress oxydatif induit par le pathogène.

À l’aide d’une pipette, ajoutez environ 100 larves de L4 à chaque plaque THY à graines de streptococcus et à celles de NGM à graines d’E. coli. Utilisez trois plaques par souche de bactérie.

Incubez les plaques pendant 2 à 3 heures à 25 degrés Celsius. Ensuite, retirez les plaques de l’incubateur. Lavez-les avec du M9W et collectez les vers dans des tubes coniques de 15 millilitres.

Lavez les vers trois fois comme auparavant lors de l’étape centrifuge. Retirez la majeure partie du M9W par aspiration. Et ajouter 500 microlitres de M9W contenant 2 millimolaires d’azide de sodium ou d’hydrochlorure de tétramisole au granule de vers pour l’anesthésie.

Incubez le tube avec des granulés de vers à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, déposez 15 microlitres de la suspension à vis sur un tampon d’agarose préparé. Au microscope fluorescent, visualisez la localisation du SKN-1 en utilisant des filtres FITC et DAPI.

Vers d’image à 10 fois et 20 fois les grossissements. Évaluer les vers selon trois niveaux de localisation ; faible localisation, où aucune localisation nucléaire n’est observée, localisation moyenne, avec SKN-1 BCGFP à l’antérieur ou à l’arrière du ver, et haute localisation, où la localisation nucléaire de SKN-1 BCGFP est observée dans toutes les cellules intestinales.