Name: Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de lapoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Découvrez la surveillance des flux de calcium mitochondrial en temps réel à l'aide de l'indicateur génétiquement encodé pericam-mt. Cette technique d'imagerie par fluorescence permet d'étudier la fonction mitochondriale dans les cellules vivantes.

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Nous tenons à remercier Atsushi Miyawaki de nous avoir fourni la construction d&#39;expression ratiométrique-pericam-mt. Ce travail a été soutenu par des subventions GM081685 des National Institutes of Health (DB).

1. Pericam-mt transfection et préparation cellulaire. <ol><li> Plate cellules HeLa la nuit avant la transfection sur des lamelles de verre stériles placées dans une plaque de culture de 6 puits standard. </li><li> Préparer l'ADN / Lipofectamine 2000 complexes comme suggéré par le fabricant (Invitrogen). Nous utilisons 4 ug de vecteur d'expression ratiométrique-pericam-mt et 10 pi de Lipofectamine 2000 dilué dans 0,5 ml d'Opti-MEM pour chaque puits. Les cellules doivent être confluentes ~ 70% avant la transfection. </li><li> Remplacer HeLa milieux de culture (Dulbecco Modified Eagles moyenne, 10% de FBS, pénicilline / streptomycine) dans chaque puits avec 1,5 mL de la même support sans antibiotiques. </li><li> Ajouter les complexes ADN / Lipofectamine dans chaque puits à transfecter. Mélanger délicatement avec bascule et incuber pendant 4 heures dans un incubateur de culture cellulaire à 37 o C, 5% de CO 2. </li><li> Remplacez sans antibiotique médias avec les milieux de culture avec des antibiotiques. Laisser les cellules d'exprimer pericam ratiométrique pendant 1-2 jours avant l'imagerie. </li></ol> 2. Installation du microscope et de l'acquisition d'images <ol><li> Placer une lamelle avec des cellules HeLa dans une chambre d'imagerie appropriés avec une solution d'imagerie: 107mm NaCl, KCl 7,2 mm, 1,2 mm de MgCl2, 1 mM CaCl 2, 11.5mm de glucose, 0,1% d'albumine sérique bovine, et 20 mM HEPES 7,2. Notre laboratoire utilise la chambre cellulaire Attofluor chez Invitrogen. Montez la chambre de l'imagerie dans un stade microscope inversé. </li><li> Trouver une zone d'intérêt contenant une ou plusieurs cellules exprimant pericam ratiométrique utilisant un 40x (ou supérieur) objectif à immersion d'huile. Nous avons constaté que pericam ratiométrique est moins résistant au photoblanchiment à 380 nm, et donc nous utilisons cette longueur d'onde pour identifier les cellules appropriées. Pour les images acquises dans la figure 1, un objectif Nikon Superfluor 40X avec une ouverture numérique 1,3 a été utilisé. Objectifs de grossissement supérieur serait aussi approprié (60-100x). Filtres d'excitation utilisées étaient Chroma Technology filtres D380/30x (380 + / - 30 nm) et D495/10 (495 + / - 5 nm), a été 505DCXR séparatrice (505nm longpass) et filtre d'émission a été HQ535/50m (535 + / - 25nm). Notre microscope utilisé pour acquérir les images de la figure 1 se compose d'un Nikon TE2000 microscope inversé équipé d'un Roper Scientific Coolsnap HQ caméra CCD refroidie, Ludl MAC6000 rapide du filtre roue et changeur, et une acquisition de données et MetaFluor logiciel d'analyse. Ce protocole peut être adapté à toute norme à large champ de microscope avec des filtres appropriés et un logiciel capable de capturer et de traitement des images ratiométrique. </li><li> Configurez le logiciel pour l'excitation double en utilisant les filtres 495 et 380 nm. Le calcium se liant à pericam ratiométrique augmente l'absorbance à 495 nm, donc le ratio devrait être mis en place à 495 nm/380 nm. Ratiométrique pericam a sans calcium pic d'excitation à 415 nm 4. Dans ce protocole, nous suggérons d'utiliser un filtre à 380 nm seulement parce qu'elle est omniprésente dans la plupart des laboratoires d'imagerie calcique. Si un filtre 410 nm, est disponible, il est préférable de le filtre 380 nm. </li><li> Acquérir les images séquentiellement par alternativement passionnante à 495 et 380 nm. Acquérir des images de niveaux de calcium de base pour au moins 30 s avant l'application d'un agoniste via un appareil de perfusion. Marquer le temps d'addition pour chaque agoniste. Les temps d'exposition et les intervalles d'acquisition devrait être optimisé pour éviter photoblanchiment tout en permettant par exemple suffisamment resolution.For temporelle, pour la dynamique de calcium semi-rapides suivis en réponse à une stimulation agoniste, les images ont été acquises toutes les deux secondes dans les figures 1b et les taux d'acquisition C. Bien plus efficace Il est également possible 6. À long terme après l'administration d'imagerie staurosporine a été acquis avec un intervalle plus long (30s) entre les acquisitions (figures 1 D et E). </li></ol> 3. Traitement et analyse des images <ol><li> Une fois l'expérience terminée, les images obtenues peuvent être analysées hors ligne. Définir des régions d'intérêt (ROI) dans laquelle vous voulez suivre les changements dans les niveaux de calcium. Utilisez un ROI sélectionnée dans une zone vide du champ de soustraire de fond si nécessaire. Il est à noter que les mitochondries sont très mobiles et dynamiques, et les événements dans une extrapolation mitochondrie unique sur de longues périodes n'est pas toujours possible. Ainsi, compte tenu de la grande mobilité de cet organite dans certains types de cellules, la sélection de ROI doivent être surveillés attentivement. Par ailleurs, comme en témoigne la figure 1, la réponse mitochondries hétérogène à divers stimuli. Il est donc important d'analyser les données hors ligne et de surveiller le placement RO1 sur une base trame par trame. Une description détaillée de la mesure du calcium mitochondrial dans très mobiles des mitochondries a été décrit ailleurs 7. </li><li> Mesure du rapport Obtenu à partir du ROI peut être importé dans Excel ou similaire graphingsoftware. Les données peuvent être présentées comme une trace représentative de l'évolution des taux de calcium mitochondrial dans une seule cellule ou mitochondrie unique, ou en moyenne flsignaux uorescence du ROI plusieurs années. Nous avons également utilisé cette technique pour mesurer la moyenne des niveaux de calcium mitochondrial dans une population de lymphocytes en apoptose induite par Fas ligand 8. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. (A) la localisation subcellulaire de ratiométrique-pericam-mt. Cette première image montre des cellules HeLa exprimant direct ratiométrique-pericam-mt. La deuxième image montre coloration fluorescente avec mitochondrie sélectif CMXRos colorant rouge Mitotracker. La fluorescence jaune dans l'image fusionnée démontre la co-localisation des ratiométrique-pericam-mt et la fluorescence Mitotracker. (B) Une série de ratio de pseudo (495:380 nm) des images de cellules HeLa exprimant 4 mt-ratiométrique pericam traitées avec 10 mM d'ATP . (C) Quantification des changements dans les niveaux de calcium mitochondrial dans la région d'intérêt (ROI) a indiqué en (B) traités par 10 mM d'ATP. (D) Série de rapport de pseudo (495:380 nm) des images d'une cellule HeLa exprimant mt -ratiométrique pericam traités avec 0,5 uM de staurosporine. Hétérogénéité de la réponse de calcium dans les mitochondries individuels est évident, ainsi que la fragmentation importante des mitochondries de 60 minutes. Certains ont mitochondries augmente oscillatoires en calcium (tête de flèche blanche), alors que d'autres ne montrent pas d'importants changements dans le niveau de calcium (tête de flèche jaune). (E) de quantification de l'augmentation des niveaux mondiaux de calcium mitochondrial dans une seule cellule HeLa après l'induction de l'apoptose par 0,5 uM de staurosporine.

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death%3A+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2%2B+uptake+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li>
<li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2%2B+concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li>
<li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li>
<li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binds+to+inositol+%281%2C4%2C5%29+trisphosphate+receptors%2C+amplifying+calcium-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li>
<li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li>
<li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH%3A+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
</ol>

Nous présentons ici une méthode très simple pour mesurer le calcium mitochondrial mitochondrial aide ciblée pericam ratiométrique. Comme le montre la figure 1A, en utilisant la norme optiques grand champ sans déconvolution, il est possible de visualiser facilement des mitochondries dans les cellules HeLa individuels avec acceptables signal-bruit. C&#39;est parce que les cellules HeLa, comme la plupart des cellules en culture, s&#39;aplatissent de façon significative lorsque adhérente évitant la nécessité pour la microscopie confocale ou d&#39;autres équipements spécialisés. Nous avons trouvé des résultats similaires dans les cellules Jurkat respectées poly-lysine lamelles revêtement 8. Contrairement aux méthodes d&#39;utilisation de colorants, il est également possible de façon non invasive de surveiller les niveaux de calcium mitochondrial pendant des heures en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés tels que ratiométrique pericam (figure 1E). Ceci est particulièrement important lors de l&#39;analyse du calcium mitochondrial lors de la mort cellulaire. Par ailleurs, il est également possible de visualiser la fission / fragmentation des mitochondries au cours du processus apoptotique. Comme indiqué dans les figures 1D et E, le traitement des causes staurosporine une lente augmentation de calcium dans les sous-populations de sélectionner des mitochondries qui culmine à 20 minutes. Les taux de calcium redescendre concomitante avec la fragmentation mitochondriale avant de monter à nouveau deux heures après le traitement. Ceci est cohérent avec les ondes lentes en calcium cytosolique induite par le traitement staurosporine mesurée en utilisant Fura-2 9. Ainsi, d&#39;importantes informations cinétiques peuvent être obtenus qui n&#39;est pas possible avec les méthodes employant des mesures statiques. Bien que nous ayons présenté les rapports et les concentrations de calcium n&#39;est pas dans la figure 1, il est possible d&#39;étalonner le capteur in situ afin de calculer les niveaux de calcium absolue 4, 10. Une mise en garde importante à considérer est que pericam ratiométrique est sensible au pH 4, 10. Comme les deux niveaux de pH cytosolique et mitochondrial peut changer de façon spectaculaire lors de l&#39;apoptose 11, c&#39;est une considération importante. Le titrage de pH dans des régions isolées pericam exprimer mitochondries montrent que l&#39;augmentation de [H +] d&#39;émission des augmentations de pericam lorsqu&#39;il est excité à 495 nm, avec peu d&#39;effet sur ​​l&#39;émission stimulée par excitation à 410 nm, une propriété qui a été exploitée pour mesurer simultanément le calcium mitochondrial et pH 12. Ainsi, de façon sélective le contrôle des émissions à 410 nm d&#39;excitation fournit un moyen de surveiller le calcium non ratiometrically mitochondriale avec inquiétude réduite pour le pH. Enfin, le protocole présenté ici ne requiert que l&#39;accès à un microscope standard avec des filtres à épifluorescence largement disponibles, ce qui rend cette technique accessible à la plupart des laboratoires.

<table><tbody><tr><td>Microscope à fluorescence en champ large inversé pour l'imagerie calcique</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53310</td><td>Tout microscope inversé en champ large équipé de filtres d'excitation à 380 nm/495 nm et de filtres longue passe et d'émission appropriés peut être facilement adapté pour utiliser ce protocole.</td></tr><tr><td>Logiciel d'imagerie</td><td>Molecular Devices</td><td>Metafluor</td><td></td></tr><tr><td>Chambre cellulaire Attofluor</td><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td>Toute chambre d'imagerie pour microscope inversé permettant la perfusion conviendrait.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>La plupart des réactifs ou protocoles de transfection seraient adaptés à ces études</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr></tbody></table>

surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Changements dynamiques de la concentration de calcium intracellulaire en réponse à divers stimuli régule de nombreux processus cellulaires comme la prolifération, la différenciation et l&#39;apoptose 1. Pendant l&#39;accumulation de calcium apoptose, dans les mitochondries favorise la libération de facteurs pro-apoptotiques de la mitochondrie dans le cytosol 2. Il est donc intéressant de mesurer directement le calcium mitochondrial dans les cellules vivantes in situ lors de l&#39;apoptose. Imagerie à haute résolution fluorescent de cellules chargées avec double excitation ratiométrique et non-ratiométrique colorants synthétiques indicateur de calcium a été prouvé être un outil fiable et polyvalent pour étudier divers aspects de la signalisation du calcium intracellulaire. Mesurer les flux de calcium cytosolique utilisant ces techniques est relativement simple. Toutefois, la mesure des niveaux de calcium dans les cellules intactes intramitochondriales en utilisant des indicateurs tels que le calcium synthétique Rhod-2 et Rhod-FF est plus difficile. Des indicateurs synthétiques destinés aux mitochondries ont émoussé les réponses aux augmentations répétitives en calcium mitochondrial, et perturber la morphologie mitochondriale 3. En outre, les indicateurs synthétiques ont tendance à s&#39;échapper des mitochondries pendant plusieurs heures ce qui les rend impropres à long terme des expériences. Ainsi, les indicateurs de calcium codées génétiquement basé sur la protéine fluorescente verte (GFP) 4 ou 5 aequorine ciblée vers les mitochondries ont grandement facilité la mesure de la dynamique du calcium mitochondrial. Ici, nous décrivons une méthode simple pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial en réponse à différents stimuli. La méthode est basée sur la microscopie par fluorescence de «ratiométrique-pericam &#39;qui est sélectivement ciblé à la mitochondrie. Ratiométrique pericam est un indicateur de calcium repose sur une fusion de circulairement permuté protéine fluorescente jaune et calmoduline 4. Liaison du calcium à pericam ratiométrique provoque un décalage de son pic d&#39;excitation de 415 nm à 494 nm, tandis que le spectre d&#39;émission, qui culmine autour de 515 nm, reste inchangé. Ratiométrique pericam lie un ion calcium unique avec une constante de dissociation in vitro de ~ 1,7 uM 4. Ces propriétés permettent d&#39;pericam ratiométrique la quantification des changements rapides et à long terme de la concentration de calcium mitochondrial. Par ailleurs, nous décrivons l&#39;adaptation de cette méthodologie à un niveau large champ de microscope d&#39;imagerie calcique avec des jeux de filtres couramment disponibles. L&#39;utilisation de deux agonistes distincts, l&#39;agoniste purinergiques ATP et la drogue staurosporine inducteur d&#39;apoptose, nous démontrons que cette méthode est appropriée pour la surveillance des changements dans la concentration de calcium mitochondrial avec une résolution temporelle de secondes à plusieurs heures. Par ailleurs, nous montrent aussi que pericam ratiométrique est également utile pour mesurer la fission mitochondriale / fragmentation lors de l&#39;apoptose. Ainsi, pericam ratiométrique est particulièrement bien adapté pour continu à long terme de mesure de la dynamique mitochondriale de calcium pendant l&#39;apoptose.

Ce protocole décrit une méthode pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial par imagerie de fluorescence. La méthode tire parti d&#39;une circulaire permuté YFP à base de capteurs de calcium à double excitation ratiométrique (ratiométrique pericam-mt) sélectivement exprimé dans les mitochondries.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Les variations dynamiques de la concentration intracellulaire en calcium en réponse à divers stimuli régulent de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, ...

L'objectif général de cette procédure est de surveiller les variations de la concentration calcique mitochondriale dans des cellules vivantes. Cela est réalisé en transfectant d'abord les cellules avec la protéine indicatrice calcique rapport métrique peram, ciblée vers la matrice mitochondriale, un ou deux jours après le transfection. Le microscope à fluorescence et le logiciel sont configurés pour l'imagerie de cellules vivantes.Des images de cellules exprimant un indicateur rapport métrique sont ensuite acquises après l'ajout d'un agoniste mobilisant le calcium. La dernière étape de la procédure consiste en une analyse quantitative des images acquises. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les changements dynamiques de la concentration en calcium mitochondrial par microscopie de fluorescence de cellules vivantes exprimant une protéine indicatrice du calcium à rapport métrique.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la mesure des niveaux de calcium à l’aide d’indicateurs synthétiques de calcium, est que le rapport métrique de peram est codé génétiquement et peut donc être ciblé vers les mitochondries ou tout autre organite d’intérêt. Bonjour, je suis le Dr. Ascar, postdoctorant dans le laboratoire du Dr. Benning, et je vais démontrer la procédure aujourd’hui. Pour commencer le protocole, plaquez les cellules HeLa la veille de la transfection sur des lamelles de verre stériles placées dans une plaque de culture standard à six puits, à une densité permettant d’obtenir environ 70 % de confluence le jour de la transfection. Le jour suivant, préparez des complexes ADN-Lipofectamine 2000 selon les instructions du fabricant, en utilisant quatre microgrammes de vecteur d’expression mitochondrial du rapport métrique de peram et 10 microlitres de Lipofectamine 2000 dilués dans 0,5 millilitre d’Opti-MEM pour chaque puits à transfecter.Ensuite, remplacez le milieu de culture D-M-E-M-F-B-S HELOC dans chaque puits par 1,5 millilitre du même milieu sans antibiotiques. Ajoutez la solution LIPECTOMY à la solution d'ADN et mélangez délicatement une fois les complexes formés. Ajoutez la solution d'ADN Lipectomy goutte à goutte dans chaque puits à transfecter en agitant doucement la plaque, puis incubez pendant quatre heures dans une étuve à culture cellulaire à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, après l'incubation.Remplacez le milieu par du D-M-E-M-F-B-S contenant des antibiotiques. Laissez les cellules exprimer la métrique peram pendant un à deux jours avant l'imagerie en utilisant une pince. Placez délicatement une lame couvre-objet avec des cellules HELOC dans une chambre d'imagerie appropriée contenant la solution d'imagerie.Montez la chambre d'imagerie sur la platine d'un microscope inversé. Ensuite, utilisez un objectif à immersion huile de 40 x ou supérieur et une longueur d'onde de 380 nanomètres. Pour localiser une zone d'intérêt contenant une ou plusieurs cellules exprimant la protéine rapporteur, une longueur d'onde de 380 nanomètres est utilisée ici afin d'identifier les cellules comme étant rapportrices.La peram est moins résistante au photoblanchiment à cette longueur d'onde. Une fois qu'une zone d'intérêt a été identifiée, configurez le logiciel pour une double excitation à 495 et 380 nanomètres. Ensuite, acquérez les images séquentiellement en excitant alternativement à 495 et 380 nanomètres.Acquérir des images des niveaux de calcium de base pendant au moins 30 secondes avant l'application de l'agoniste. Appliquer ensuite l'agoniste mobilisant le calcium à l'aide d'un appareil de perfusion, en notant le moment de l'ajout ; les durées d'exposition à l'agoniste et les intervalles d'acquisition doivent être optimisés afin de prévenir le photoblanchiment tout en permettant une résolution temporelle suffisante. Une fois l'expérience terminée, les images peuvent être analysées hors ligne.Pour commencer l'analyse, sélectionnez une région d'intérêt dans une zone vide du champ afin de soustraire la fluorescence de fond si nécessaire. Ensuite, exportez les mesures de rapport 4 95 3 80 provenant de la région d'intérêt vers Excel ou un logiciel graphique similaire. Ce panneau d'images montre la localisation subcellulaire du rapport métrique de peram et des mitochondries.À gauche, on voit une image de cellules vivantes de cellules HeLa exprimant Peram à rapport métrique. Au centre, la coloration fluorescente des mitochondries avec le colorant sélectif MitoTracker Red CMXRos. Enfin, à droite, l'image fusionnée présentée ici correspond à une série d'images en pseudocouleurs obtenues par un rapport d'excitation à 495 et 380 nanomètres, montrant quatre cellules HeLa exprimant Peram à rapport métrique dans les mitochondries, traitées avec 10 micromolaire de ATP ; la quantification des variations des concentrations de calcium mitochondrial de ces quatre cellules précédentes est illustrée ici sur une image d'une cellule HeLa exprimant Peram à rapport métrique dans les mitochondries.Hétérogénéité de la réponse calcique au niveau des mitochondries individuelles ainsi qu'une fragmentation mitochondriale importante sont observées après 60 minutes de traitement par 0,5 micromolaire de stor sporine. Certaines mitochondries présentent des augmentations oscillatoires du calcium, indiquées par la flèche blanche, tandis que d'autres ne montrent pas de changements significatifs du taux de calcium, indiqués par une flèche jaune. Ce graphique met en évidence la variation des niveaux globaux de calcium mitochondrial dans une cellule helo unique après induction de l'apoptose pendant 120 minutes avec 0,5 micromolaire de stor sporine.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer les changements dynamiques des concentrations de calcium mitochondrial en réponse à divers tli à l’aide de la protéine indicatrice de calcium R geometric peram, qui est ciblée de manière sélective vers la matrice mitochondriale.

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L’homéostasie calcique du réticulum endoplasmique est perturbée dans diverses pathologies.  Un rapporteur de protéine de surveillance calcique du RE (SERCaMP) peut être utilisé pour détecter les perturbations dans le stockage du calcium du RE.   Ce protocole décrit l’utilisation d’une SERCaMP de la gaussia luciférase pour examiner l’homéostasie calcique du RE in vitro et in vivo.

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Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

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Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’application de la rhodamine 123 pour identifier le potentiel de membrane mitochondrial (MMP) et étudier CLIC4 induite par le knockdown HN4 cellulaire, l’apoptose in vitro. Sous le microscope à fluorescence commun et microscope à fluorescence laser confocale, le changement en temps réel de la MMP a été enregistré.

Détection de potentiel de Membrane des mitochondries pour étudier CLIC4 HN4 induite par le Knockdown cellule Apoptosis In Vitro

Nous présentons ici deux protocoles pour mesurer des influx mitochondriale de Ca2 + dans les mitochondries isolées et des cellules. Pour les mitochondries isolées, nous détaillons une plaque base lecteur Ca2 + importation de dosage à l’aide du Ca2 + sensibles teindre calcium vert-5N. Pour les cellules cultivées, on décrit une méthode de microscopie confocale en utilisant le Ca2 + colorant Rhod-2/AM.

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Ce protocole décrit une approche pour effectuer l’imagerie calcique dans les organoïdes intestinaux humains infectés par le virus et propose une approche d’analyse.

Imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement

Découvrez la surveillance des flux de calcium mitochondrial en temps réel à l'aide de l'indicateur génétiquement encodé pericam-mt. Cette technique d'imagerie par fluorescence permet d'étudier la fonction mitochondriale dans les cellules vivantes.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de lapoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement (Vidéo) | JoVE Journal

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l'apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

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