Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l'apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

L’objectif global de cette procédure est de surveiller les changements dans la concentration de calcium mitochondrial dans les cellules vivantes. Ceci est accompli en transectant d’abord les cellules avec le rapport protéique indicateur de calcium métrique peram, qui est ciblé sur la matrice mitochondriale, un ou deux jours après la transfection. Le microscope à fluorescence et le logiciel sont configurés pour l’imagerie de cellules vivantes.

Des images de cellules exprimant le péram métrique sont ensuite acquises lors de l’ajout d’un agoniste mobilisateur du calcium. La dernière étape de la procédure est l’analyse quantitative des images acquises. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des changements dynamiques dans la concentration de calcium mitochondrial grâce à la microscopie à fluorescence de cellules vivantes exprimant une protéine indicatrice de calcium métrique de rapport.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la mesure des niveaux de calcium à l’aide d’indicateurs de calcium synthétiques est que le rapport métrique peram est codé génétiquement et peut donc être ciblé sur les mitochondries ou tout autre organe d’intérêt. Bonjour, je suis le Dr Ascar, post-doctorant dans le laboratoire du Dr Benning, et je vais faire une démonstration de la procédure aujourd’hui Pour commencer le protocole des cellules hélicocellulaires la nuit précédente, la transfection sur des lamelles de verre stérile placées dans une plaque de culture standard à six puits à une densité qui sera d’environ 70 % con fluent pour la transfection le lendemain. Le lendemain, préparez des complexes d’ADN Lipectomy 2000 selon les instructions du fabricant avec quatre microgrammes de vecteur d’expression mitochondrial péram métrique et 10 microlitres de lipectomie 2000 dilués dans 0,5 millilitre d’optimum pour chaque puits à transfecter.

Ensuite, remplacez le milieu de culture D-M-E-M-F-B-S HELOC dans chaque puits par 1,5 millilitre du même milieu sans antibiotiques. Ajoutez la solution de LIPECTOMIE à la solution d’ADN et mélangez doucement une fois que les complexes se sont formés. Ajoutez la solution de lipectomie d’ADN goutte à goutte dans chaque puits à transfecter mélangé en secouant doucement la plaque et incubez pendant quatre heures dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone après l’incubation.

Remplacez le milieu par D-M-E-M-F-B-S contenant des antibiotiques. Laissez les cellules exprimer la péram métrique pendant un à deux jours avant d’obtenir une imagerie à l’aide d’une pince. Placez délicatement une lamelle avec des cellules HELOC dans une chambre d’imagerie appropriée avec une solution d’imagerie.

Montez la chambre d’imagerie dans une platine de microscope inversé. Ensuite, utilisez un objectif d’immersion dans l’huile de 40 x ou plus et une longueur d’onde de 380 nanomètres. Pour trouver une zone d’intérêt contenant une ou plusieurs cellules exprimant la métrique de rapport, peram 380 nanomètres est utilisé ici pour identifier les cellules comme métrique de rapport.

Le péram est moins résistant au photoblanchiment à cette longueur d’onde. Une fois qu’une zone d’intérêt a été identifiée, configurez le logiciel pour une double excitation à 495 et 380 nanomètres. Ensuite, acquérez des images séquentiellement en les excitant alternativement à 495 et 380 nanomètres.

Obtenir des images des taux de calcium de base pendant au moins 30 secondes avant l’application de l’agoniste. Appliquez ensuite l’agoniste mobilisateur du calcium à l’aide d’un appareil à profusion, en notant que le temps supplémentaire pour chaque agoniste : les temps d’exposition et les intervalles d’acquisition doivent être optimisés pour éviter le photoblanchiment tout en permettant une résolution temporelle suffisante. Une fois l’expérience terminée, les images peuvent être analysées hors ligne.

Pour commencer l’analyse, sélectionnez une région d’intérêt dans une zone vide du champ afin de soustraire la fluorescence de fond si nécessaire. Ensuite, exportez les mesures de rapport 4 95 3 80 de la région d’intérêt vers Excel ou un logiciel graphique similaire. Ce panel d’images montre la localisation subcellulaire du rapport métrique péram et mitochondries.

Sur la gauche, une image de cellule en direct de cellules hélicoïdales exprimant le rapport métrique peram. Au milieu se trouve la coloration fluorescente des mitochondries et le colorant sélectif MIT tracker rouge CMX Ross. Et enfin à droite, l’image fusionnée montrée ici est une série d’images pseudocolores de rapport de 4 95, 3 80 nanomètres de quatre cellules hélicoïdales exprimant le rapport métrique péram dans les mitochondries traitées avec 10 micromolaires A TP, et la quantification des changements dans les niveaux de calcium mitochondrial de ces quatre cellules précédentes est montrée ici dans cette image d’une cellule hélicoïdale exprimant le rapport métrique péram dans les mitochondries.

L’hétérogénéité de la réponse calcique dans les mitochondries individuelles ainsi qu’une fragmentation significative des mitochondries sont évidentes après 60 minutes de traitement par sporine stor sporaire de 0,5 micromolaire. Certaines mitochondries ont des augmentations oscillatoires du calcium indiquées par la flèche blanche, tandis que d’autres ne montrent pas de changements significatifs du taux de calcium indiqués par une flèche jaune. Ce graphique révèle la variation des taux globaux de calcium mitochondrial dans une seule cellule hélicoïdale après induction de l’apoptose pendant 120 minutes avec 0,5 sporine stor micromolaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les changements dynamiques des niveaux de calcium mitochondrial en réponse à divers tli à l’aide de la protéine de calcium médicamenteuse R péram géométrique, qui est sélectivement ciblée sur la matrice mitochondriale.