Surveillance clivées activité caspase-3 et l'apoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de Cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par

Cette procédure permet de surveiller en temps réel la mort des cellules gliales oligo DDR. Ceci est accompli en cultivant d’abord les cellules, puis les cellules sont préparées pour l’imagerie de cellules vivantes. L’étape suivante consiste à fournir un traitement aux cellules et à surveiller les effets à l’aide de la microscopie à fluorescence.

La dernière étape consiste à effectuer l’analyse des données. En fin de compte, les résultats montrent des taux de mort cellulaire dans une population cellulaire à la suite d’un traitement ou d’un stimulus en surveillant la fluorescence nucléaire d’un colorant fluro activé par la caspase. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immuno-coloration est la possibilité de recueillir plusieurs points temporels simultanément.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que les réponses aux traitements pharmacologiques, réactifs et divers. Aujourd’hui, cette méthode peut donner un aperçu de la mort dans les cultures cellulaires. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les tissus organotypiques ex vivo, y compris les tranches de cerveau.

En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal à s’adapter au travail avec des tissus vivants plutôt qu’avec des tissus fixes. La démonstration visuelle de cette technique est importante car il y a beaucoup d’étapes pour préparer des échantillons de cellules vivantes par rapport à des tissus fixés. D’abord, congelées et congelées, des cellules gliales oligo nuancées de 19 cellules gliales tombantes dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant que les cellules dégèlent.

Ajoutez sept millilitres de DMEM à haute teneur en glucose complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine dans une boîte de culture de 10 centimètres. Ajoutez ensuite la suspension cellulaire goutte à goutte à la plaque et agitez doucement la boîte de Pétri pour disperser les cellules uniformément. Cultivez les cellules à 34 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 cents pendant quatre heures après quatre heures.

Aspirez le support des plaques pour éliminer tout DMSO restant. Cryoprotecteur. Remplacer par sept millilitres de substrat frais après quatre à sept jours de croissance. Lorsque les cellules ont atteint 70 à 80 % de confluence, aspirez le milieu et pipetez un millilitre de gouttes sur la feuille cellulaire, incubée à température ambiante pendant cinq minutes.

Récoltez ensuite les cellules suivantes : graines, une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres avec les cellules récoltées à une densité de 0,1 fois 10 à six cellules par millilitre, et placez cette boîte dans l’incubateur de culture tissulaire. Après un autre massage, les cellules peuvent être plaquées pour des expériences d’imagerie de cellules vivantes. Pour ce faire, récoltez les cellules comme précédemment, puis retirez 30 microlitres de suspension cellulaire et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensuite, utilisez une pince stérile pour placer les lamelles de couverture en verre non revêtues. Dans les puits d’une plaque à six puits, ajoutez des cellules au puits à une densité de 0,1 fois 10 à six cellules par millilitre. Dans deux millilitres de DMEM sans phénol, les milieux à haute teneur en glucose complétés par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine permettent aux cellules de se développer pendant la nuit à 34 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avant la transfection.

Le lendemain, combinez 100 microlitres de milieu sérique libre de 0,5 à quatre microgrammes de plasmide purifié, d’ADN et de quatre microlitres de gène FU hd. Agitez doucement le mélange deux fois, puis laissez l’ADN se complexer à température ambiante pendant cinq minutes. Une fois le temps d’incubation écoulé, ajoutez le mélange d’ADN HD du gène FU directement aux cellules cultivées.

Inclinez doucement la plaque pour mélanger. Ensuite, cultivez les cellules pendant 48 heures supplémentaires à 34 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avant le traitement ou l’expérimentation. Allumez d’abord le boîtier de commande de l’instrument LCI Cham light Live Cell.

Cela doit être fait trois heures avant le début de l’expérience pour assurer un réchauffement complet de la scène. Au minimum, le boîtier de commande doit être allumé une heure avant le début de l’expérience. Ensuite, en travaillant dans une hotte à flux, vaporisez la chambre de culture de type magnétique LCI Cham light et la pince avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher pendant cinq minutes.

Retirez les cellules de l’incubateur et examinez-les au microscope pour confirmer qu’elles sont saines. Les cellules doivent apparaître comme une dure et bien réparties sur la lamelle de verre avec de nombreux processus membranaires. Les cellules avec un nombre réduit d’extensions de processus ou un noyau de forme irrégulière sont probablement stressées par la transfection et ne conviennent pas à d’autres expériences de travail dans la hotte d’écoulement.

Inclinez la plaque à six puits et retirez la lamelle à l’aide d’une pince. Placez rapidement le couvercle côté cellule vers le haut dans la plaque inférieure de la chambre. Ne laissez pas la lamelle sécher.

Ensuite, fixez le corps principal magnétique de la chambre de culture et ajoutez 500 microlitres de milieu de la plaque à six puits d’origine sur le dessus de la lamelle. La réutilisation du milieu diminue la quantité de stress exercée sur les cellules par les changements environnementaux et peut également être utile pour évaluer les facteurs sécrétés par des extracellulaires. Une fois le support ajouté, placez le couvercle en verre sur la chambre de culture et utilisez une tresse de lingettes Kim à 70 % pour éliminer toute matière résiduelle qui pourrait interférer avec la microscopie du bas de la lamelle.

Placez la chambre de culture dans l’incubateur à 34 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Cette étape garantira que la chambre elle-même se réchauffe à 34 degrés pour réduire le déplacement de la lamelle. Au fur et à mesure que le métal se réchauffe, il est nécessaire de travailler avec l’éclairage ambiant de la pièce aussi bas que possible au cours des étapes suivantes.

Tout d’abord, Thora a préalablement préparé elequa de nuke view à température ambiante. Ensuite, récupérez la chambre de culture de l’incubateur et placez-la rapidement dans la chambre environnementale du microscope. Allumez le réservoir de dioxyde de carbone prémélangé à 5 % avec double régulateur.

Ensuite, utilisez l’objectif 10 fois avec la lampe du microscope réglée sur environ 2,5 volts et le temps d’exposition sur 240 millisecondes. Faites la mise au point à l’aide de la microscopie à fond clair pour visualiser les cellules sur l’écran de l’ordinateur. Ajoutez ensuite une concentration de 80 millimolaires d’ion potassium ou d’un autre inducteur d’apoptose aux cellules par échange de milieu avec perfusion lente et locale à l’aide d’une pompe péristaltique.

Le substrat Nuke View 4 88 est stable en culture cellulaire pour des expériences pouvant durer jusqu’à 36 heures. Par conséquent, il est possible de mener des expériences sur cette période. Installez d’abord le microscope pour visualiser la fluorescence des protéines fluorescentes rouges et vertes.

Cliquez ensuite sur le canal rouge pour afficher les cellules transfectées. Sélectionnez et enregistrez environ 12 images où il y a plusieurs cellules transfectées et enregistrez ces points d’étape XY. Demandez au microscope de capturer des images dans le canal rouge en fond clair et le canal vert à ces points de scène enregistrés toutes les six minutes.

Après avoir collecté plusieurs points XY à partir d’expériences en double ou en triples, compilez les données d’expériences distinctes réalisées à des jours différents et effectuez une analyse des données et des tests statistiques comme décrit dans le protocole écrit pour comparer le rapport entre les cellules négatives de la baie CASP et les cellules positives de la baie CASP. Le substrat Nuke view 4 88 peut indiquer une augmentation du taux d’apoptose des cultures de cellules gliales N 19 oligo DDR. Suite à un traitement avec une forte concentration extracellulaire en potassium, ces images de base ont été acquises à l’aide d’un objectif 10 fois.

Les cellules N 19 ont été transfectées avec RFP et ont été traitées soit avec trois microlitres de nuke view, 4 substrats 88 pour les cellules de contrôle, soit trois microlitres nuke view, 4 substrats 88 et 80 millimolaires de potassium. Ces images illustrent que le nombre de cellules apoptotiques augmente avec le temps, trois, six et neuf heures après le traitement avec 80 millimolaires de potassium dans des conditions de contrôle, des quantités significatives d’apoptose n’ont pas été observées par rapport aux cultures traitées à 80 millimolaires de potassium. Le signal vert de fond observé dans les conditions de contrôle indique les cellules qui subissent l’apoptose sans ajout de potassium extracellulaire.

Après 12 heures, les cultures traitées au potassium ont démontré environ 45 % de mort cellulaire. Pratiquement aucune des cellules de l’expérience de contrôle ne présente d’apoptose au bout de 12 heures. Bien que dans d’autres situations, les expériences peuvent devoir durer plus longtemps.

Ce graphique montre l’augmentation des cellules positives à la caspase trois au cours de l’expérience de 12 heures. Une fois harcelée, cette technique peut être réalisée en une heure et les données peuvent être collectées pendant la nuit si elle est correctement faite. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’être cohérent entre les traitements Après cette procédure.

D’autres méthodes, telles que l’immunomarquage, peuvent être utilisées pour examiner d’autres protéines en aval impliquées dans les voies étudiées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons pour l’imagerie. Acquérez un ensemble de données et analysez vos données.