Name: Surveillance clivées activité caspase-3 et lapoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de Cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie en cellules vivantes pour surveiller l'apoptose médiée par la caspase-3 dans les cultures de cellules N19-oligodendrocytes. Cette technique permet d'observer en temps réel la mort cellulaire programmée.

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Ce laboratoire a été financée par les Instituts canadiens de recherche en santé, en sciences naturelles et en génie du Canada et la Société canadienne de la sclérose plaques (SCSP). GSTS a été le récipiendaire du doctorat une bourse d&#39;études de la SCSP. Nous sommes reconnaissants envers le Dr Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) pour de nombreuses discussions utiles et des commentaires sur ce manuscrit. Nous sommes reconnaissants à Biotium pour leur généreux don de 488 supplémentaires NucView caspase-3.

1. La décongélation et la culture de cellules <ol><li> Obtenir des stocks de produits congelés immortalisé N19-oligodendrogliales cellules de long terme stocke l'azote liquide. </li><li> Plongez flacon contenant des cellules à 37 ° C l'eau de bain jusqu'à la suspension cellulaire est complètement dégelée. </li><li> Ajouter 7 ml de DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) avec du glucose à haute complété 10% de FBS (sérum de veau fœtal) et 1% de pénicilline / streptomycine à une plaque de 10 cm de la culture. </li><li> Ajouter la cellule en suspension goutte à goutte à la plaque, et agiter doucement et rock de la boîte de Pétri pour disperser les cellules uniformément. </li><li> Cellules en culture à 34 ° C / 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Après 4 heures, les médias aspirer à partir de plaques de supprimer tout reste du DMSO (diméthylsulfoxyde) qui avait été utilisé comme un cryoprotecteur, et remplacer par du milieu frais (7 ml de DMEM haute-glucose milieux supplémentés avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine) . </li></ol> 2. Cellules repiquage <ol><li> A 70-80%confluent (4-7 jours de croissance), aspirer les médias à partir des cellules. </li><li> Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25% à l'assiette. Pipeter trypsine pour détacher les cellules (environ 5 minutes). </li><li> Faire des dilutions appropriées aux conditions expérimentales et le passage une plaque à 10 cm supplémentaires pour de futures expériences à une densité cellulaire pas moins que les 0,1 x 10 6 cellules / ml. </li></ol> Note: Vous devriez le passage de vos cellules au moins deux fois après la décongélation avant de les utiliser pour des expériences. 3. Comptage et Placage Cellules <ol><li> Pour cellules de la plaque d'imagerie des cellules vivantes, trypsiniser comme décrit précédemment. </li><li> Retirez environ 30 ul de cellules et de compter en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Placer une lamelle de verre non couché dans une plaque à 6 puits. Ajouter des cellules à la même à une densité de 0,1 x 10 6 cellules / ml dans 2 ml de phénol DMEM sans grande glucose médias, supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine, à 34 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Autorisercellules à croître durant la nuit (16-20 h) à 34 ° C / 5% de CO 2 avant la transfection. </li></ol> 4. La transfection <ol><li> Combinez 100 uL du milieu sans sérum, de 0,5-4 mg ADN plasmidique purifié, et 4 pl FuGENE HD (Roche). Vortex doucement pour mélanger. </li><li> Vortex à nouveau brièvement et permettre à l'ADN de complexes pendant 5 min à température ambiante, puis ajouter le mélange de l'ADN FuGENE HD directement sur les cellules cultivées. Inclinez la plaque délicatement au mélange. </li><li> Culture des cellules pour une période supplémentaire de 48 heures à 34 ° C / 5% de CO 2 avant le traitement ou l'expérimentation. </li></ol> 5. Cellules Préparation imagerie des cellules vivantes (LCI) <ol><li> Allumez le LCI Chamlide cellules vivantes boîte de contrôle d'instruments au moins 1 h avant de vous voulez commencer votre expérience. La boîte de contrôle régule également la température et l'humidité dans l'Chamlide LCI, et régule le débit de la pré-mélangé à 5% de CO 2. </li></ol> Remarque: Il est conseillé deAllumez le boîtier de commande jusqu'à 3 h avant les expériences commencent à s'assurer que toute la scène atteint 34 ° C. Cette étape permettra de réduire la dérive focale, qui est causée par la dilatation thermique et de fluxulation de la scène métal comme il se réchauffe, lors de l'imagerie. <ol start="2"><li> Travailler dans un flux hotte, vaporiser la chambre de culture Chamlide magnétiques de type, et une pince à épiler, avec 70% d'éthanol et de les laisser sécher pendant 5 minutes. </li><li> Retirer les cellules de l'incubateur et de confirmer qu'ils sont sains. Ils devraient apparaître adhérente et bien réparties sur la lamelle de verre avec de nombreux procédés membranaires. Les cellules qui sont stressés par la transfection sont pas adaptés à l'expérimentation, et aura un nombre réduit d'extensions processus, et ont souvent un noyau de forme irrégulière. </li><li> Inclinez la plaque à 6 puits et enlever la lamelle avec des pincettes. Placer rapidement le côté pile lamelle jusqu'à dans la plaque de fond de la chambre de culture. Ne pas laisser la lamelle de sécher. </li><li> Fixez le magnétique principalcorps de la chambre de culture et d'ajouter 500 ul des médias de l'original 6-même la plaque sur le dessus de la lamelle. Re-utilisation de ce média va diminuer la quantité de stress placé sur les cellules causés par les changements environnementaux, et peut également être utile pour évaluer les facteurs sécrétés extracellulaire. </li><li> Placez le couvercle de verre sur la chambre de culture. </li><li> Utilisez un Kimwipe pulvérisé avec de l'éthanol à 70% pour enlever toute matière résiduelle à partir du bas de la lamelle, qui nuirait à la microscopie. </li><li> Placer la chambre de culture dans les 34 ° C / 5% de CO 2 incubateur pendant 30 min. Cette étape fera en sorte que la chambre se réchauffe à 34 ° C pour réduire le déplacement de la lamelle que le métal se réchauffe. </li></ol> 6. Réglages du microscope Les images ont été acquises ici en utilisant un microscope inversé Leica DMIRE2 avec une lentille de relais personnalisés et des logements de roue filtre d'émission pour le chargement de la cartouche de roues multiples (Technologies Inc Quorum, Guelph, ON). <ol><li> Brightfield - Lampe fixé à 2,5 V et le temps d'exposition à 240 ms. </li><li> Red Fluorescent Protein (RFP) - Gain fixé à 140 pour 200 ms. </li><li> Green Fluorescent Protein (GFP) - Gain fixé à 140 pour 500 ms. </li><li> Notre microscope est une lampe gradable plutôt que d'un disque rotatif pour contrôler la quantité de lumière disponible pour les cellules. Nous courons nos expériences avec la lumière à 90% de l'intensité maximale de la lampe. </li></ol> 7. Traitement des cellules avec inducteurs d'apoptose et de NucView 488 Caspase-3 substrat <ol><li> Il est important de préparer d'importants stocks d'inducteurs d'apoptose à l'avance et les congeler dans des aliquotes, de sorte que les concentrations seront compatibles entre les expériences. </li><li> Le substrat est NucView 488 sensible à la lumière. Préparer des aliquotes de 15 uL de réduire les tubes de gel / dégel, et conserver à -20 ° C couvert de papier d'aluminium. Travailler avec l'éclairage ambiant de la pièce aussi bas que possible pour réduire l'exposition de la NucVIEW 488 substrat à la lumière, avant son utilisation. </li><li> Récupérez la chambre de culture rapide de l'incubateur afin que les cellules ne sont pas exposés à une réduction de la température. Placer la chambre de culture sur la chambre de l'environnement du microscope, et utiliser des colliers pour maintenir la chambre de culture de se déplacer. A ce stade, vous devriez également tamiser les lumières ambiante. </li><li> Allumez le 5% prémélangé CO 2 en cuve avec régulateur double. </li><li> Utilisation de l'objectif 10x, mise au point de trouver des cellules sur le moniteur de l'ordinateur en utilisant la microscopie à champ lumineux. Remarque: vous voulez utiliser la plus grande ouverture numérique de l'objectif avec le grossissement désiré de réduire le temps d'exposition. </li><li> Livrer des inducteurs de l'apoptose dans les cellules (dans notre cas, le potassium mM 80 ou 100 mM glutamate), l'une des méthodes suivantes peuvent être utilisées. Nous allons utiliser la livraison de 80 mM de potassium comme un exemple, en utilisant du KCl dissous sous forme de concentré 10x dans nos milieux de culture typique. <ol><li> Media Exchange bperfusion lente et locales y: - Utiliser une pompe péristaltique pour échanger des médias dans la chambre de culture avec les nouveaux médias contenant 80 mM de potassium. - Une extrémité du tube se livrer 10 mL d'un stock de 80 mM de potassium dissous dans du phénol DMEM sans, et l'autre extrémité du tuyau va supprimer les médias de la chambre. - Tu veux au moins un échange de 10x des médias pour assurer que les médias restent dans la chambre a la bonne concentration de potassium. - Après les médias sont échangées, ajouter 3 488 ​​ul de substrat NucView aux médias dans la chambre. Pipette pour mélanger. </li><li> Outre directe de 80 mM de K + et 488 NucView substrat aux médias en chambre de culture: - Préparer une solution mère 10x de 80 mM de potassium dissous dans du phénol DMEM sans. - Ajouter 3 ul de substrat à 488 NucView 50 uL de 10x 80 de potassium mM. Pipette pour mélanger. Ajouter à 500 ul de phénol DMEM sans en chambre de culture. Remarque: cette méthode estpréférée si vous êtes intéressé à maintenir ou à évaluer la croissance ou d'autres facteurs sécrétés qui peuvent être présents dans le support d'origine. Nous avons constaté que les 488 NucView substrat est stable en culture de cellules pour des expériences durables aussi longtemps que 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Imagerie des cellules vivantes <ol><li> Cliquez sur le canal rouge pour afficher les cellules transfectées. </li><li> Sélectionnez et enregistrez autour d'une douzaine de cadres où il ya plusieurs cellules transfectées, et sauver ces «points XY". Selon la quantité de mémoire d'ordinateur, vous pouvez être limité au nombre de points d'étape que vous pourrez acquérir. </li><li> Demandez aux capturer des images de microscope (en champ lumineux, le canal rouge, et le canal vert) lors de ces étapes enregistré des points de toutes les 6 minutes. </li><li> Toute coloration verte qui est visible durant les premiers stades de l'expérimentation indique probablement les cellules qui sont déjà en cours de l'apoptose, en raison souvent à la transfection et / ou un stress environnemental. ApoptTSO dues aux traitements expérimentaux seront détectés à une date jalon plus tard dans l'expérience. </li></ol> 9. Analyse statistique <ol><li> Pour chaque expérience, nous programmons le microscope pour acquérir des points XY multiples de rassembler un vaste ensemble de données de manière efficace. Chaque expérience est réalisée en double ou en triple, et les données sont compilées à partir des expériences distinctes effectuées à des jours différents. A partir de chaque ensemble de données, nous analysons jusqu'à 15 champs de vue et de comparer le ratio de la caspase-cellules négatives à la caspase-cellules positives (nombre total de cellules dans le champ de vue / nombre total de cellules positives pour la caspase-). </li><li> Les mesures enregistrées par chaque ensemble de données sont regroupées dans un ensemble plus large échantillon, et sont ensuite comparés les uns aux autres en utilisant un tableau ANOVA (p = 0,05). Nous montrons l'erreur-type de la moyenne (SEM) de chaque expérience, puis de comparer la différence de moyens en effectuant un test de Tukey moyens de comparaison (p = 0,05) pour déterminer WHich traitements sont significativement différents les uns des autres. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs Nous avons décrit une expérience visant à illustrer comment le NucView 488 substrat peut indiquer une augmentation du taux d'apoptose des N19-OLG cultures de cellules suivant un traitement avec une concentration en potassium extracellulaire élevé. Le N19-cellules ont été transfectées avec DP, et ont été soit traités avec 3 pi NucView 488 substrat (contrôle), ou 3 488 ​​uL NucView substrat et 80 mM de [K +] (le traitement). Les cellules ont été surveillés et les images ont été acquises sur un cours de 12 h de temps, ce qui est suffisant pour des études impliquant des insultes neurologiques (figure 1A). Dans des conditions de contrôle, nous n'avons pas observé d'importantes quantités de l'apoptose par rapport au 80 mm [K +] cultures traitées (boîte hachés), qui a montré environ 45% de mort cellulaire après 12 h (figure 1B). Le signal de fond vert d'observerD dans les conditions de contrôle indique les cellules qui sont en apoptose, sans l'ajout de potassium extracellulaire. Pratiquement aucune des cellules de l'apoptose présentent contrôle d'expérience par le point 12 de temps h, bien que dans d'autres situations les expériences peuvent être nécessaires pour fonctionner plus longtemps. Les images ont été acquises en utilisant un objectif 10x. Barre = 100 um. <img alt="Figure 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg"> <img alt="Figure 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg"> Figure 1. (A) A 12 h expérimentation bien sûr le temps des cultures N19 OLG 48 h post-transfection exprimant RFP-MBP (canal rouge), avec 3 488 ​​ul de substrat NucView (canal vert). Les cultures ont été traitées soit avec une concentration finale de 80 mM de [K +] (panneaux de gauche), ou aucun traitement comme une commande (panneaux de droite). Les images ont été acquises à intervalles de 6 minutes, et l'activation significative de clivage caspase-3 (signal vert) peuvent être d'observerD dans les cultures traitées avec 80 mM de [K +] dans les noyaux des cellules (boîte hachés) par rapport à l'expérience de contrôle. (B) Pourcentage de la caspase-3 clivée cellules (calculé en divisant le nombre total de cellules dans le champ de vision en le nombre total de cellules positives pour la caspase-). En comparaison avec le contrôle des conditions, nous avons observé autour de la mort cellulaire de 45% suivants K +-traitement par 12 h. SVidéo 1. Une expérience de 12 h cours du temps de N19-OLG cultures 48 h post-transfection exprimant RFP-MBP (canal rouge) avec 3 488 ​​ul de substrat NucView (canal vert), avec champ lumineux des images et un moyen de trois image fusionnée, après un traitement avec 80 mM de [K +]. SVidéo 2. Une expérience de 12 h cours du temps de N19-OLG cultures 48 h post-transfection exprimant RFP-MBP (canal rouge) avec 3 488 ​​ul de substrat NucView (canal vert), avec champ lumineux IMAGes et une image à trois voies ont fusionné. Aucun traitement n'a été appliqué à des cultures et N19-OLGs peut être vu migrer à travers le champ de microscope en contraste avec les cultures de cellules traitées avec 80 mM de [K +] (à comparer avec SVidéo 1).

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Même si ce n&#39;est pas le seul produit disponible pour la détection fluorogénique apoptose, il ya plusieurs avantages significatifs à l&#39;utilisation du substrat NucView 488. Un des principaux avantages est la possibilité de suivre l&#39;apoptose dans les cellules vivantes en temps réel, alors que la plupart des produits de remplacement, soit exiger une lyse cellulaire ou la perméabilité des cellules pauvres. Les autres avantages comprennent une grande sensibilité pour la caspase-3 de reconnaissance, de la perméabilité cellulaire élevée, une faible cytotoxicité, et aucune interférence avec la progression de l&#39;apoptose. Le substrat a également fluorescence de fond doux jusqu&#39;à ce qu&#39;il est clivé et pénètre dans le noyau, ce qui élimine la fluorescence de fond. La séquence de reconnaissance de caspase-3 contient trois charges négatives et le colorant de liaison d&#39;ADN a une charge positive 2. Le DEVD-488 NucView molécule a donc une charge nette négative, ce qui empêche l&#39;activation et la fixation de la teinture à l&#39;ADN dans les cellules où la caspase n&#39;est pas actif. Mala cohérence entre les expériences intaining est nécessaire pour être en mesure d&#39;établir des comparaisons significatives entre les répétitions. Un des principaux paramètres de garder constant est la densité cellulaire, car il influe sur le taux de transfection. Obtenir des taux de transfection élevé dans immortalisé N19-OLG cultures cellulaires est plus difficile que d&#39;autres lignées cellulaires courantes telles que HeLa ou HEK 293, et est fortement dépendante de la densité, dans notre expérience de 12, 13. Nos meilleures efficacités de transfection de ces cellules ont été obtenus avec Fugene HD (Roche) et sont normalement d&#39;environ 15%, mais peut atteindre plus de 30%, selon le construire. Le comptage des cellules permet de suivre l&#39;aide à obtenir des taux de transfection cohérente. Il est également important d&#39;exposer les cellules à partir des traitements différents pour le même degré de stress de l&#39;environnement, en particulier lorsque l&#39;on mesure les taux d&#39;apoptose. Plus précisément, la longueur du temps pendant lequel les cellules sont exposées à des réactifs de transfection, ou le montant de l&#39;exposition lumineuse, sont importantes sur l&#39;environnement variablevariables à considérer, et devrait rester constante à travers des expériences. Pour nos applications, nous avons constaté que la collecte d&#39;un grand nombre de champs de vue offre un échantillon de taille suffisamment grande pour faire des comparaisons statistiquement significative [ibid].

Table des réactifs spécifiques et des équipements <table border="1"><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> NucView 488 Kit Caspase-3 Assay pour les cellules vivantes </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> Réactifs de transfection FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagle Médium </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Trypsine à 0,25% </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1.5 à 25 mm en verre lamelle </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnétiques chambre de culture de 25 mm lamelle </td&gt; <td> Quorum Technologies </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Culture de tissus Cellstart boîtes de 10 cm </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon de 6 puits boîtes de culture tissulaire </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

surveillance clivées activité caspase-3 et l&#39;apoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Le système nerveux central peuvent éprouver un certain nombre de contraintes et les insultes neurologiques, qui peuvent avoir de nombreux effets indésirables qui aboutira à une réduction de la population neuronale et la fonction. Axones endommagés peuvent libérer des molécules excitatrices comme le potassium ou le glutamate dans la matrice extracellulaire, qui à son tour, peut produire d&#39;autres insultes et les blessures aux cellules gliales de soutien, y compris astrocytes et oligodendrocytes 8, 16. Si l&#39;insulte persiste, les cellules seront soumis à la mort cellulaire programmée (apoptose), qui est réglementée et activée par un certain nombre de bien établie cascades de transduction du signal 14. L&#39;apoptose et une nécrose tissulaire peut survenir après une lésion cérébrale traumatique, ischémie cérébrale, et des convulsions. Un exemple classique de la régulation apoptotique est la famille de cystéine dépendante aspartate-dirigé protéases ou caspases. Protéases activées incluant les caspases ont également été impliqués dans la mort cellulaire en réponse à la neuro chroniquesmaladies dégénératives, y compris la maladie d&#39;Alzheimer, de Huntington et la sclérose en plaques 4, 14, 3, 11, 7. Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;utilisation de la NucView 488 caspase-3 substrat pour mesurer le taux d&#39;apoptose caspase-3 dans la médiation immortalisé N19-oligodendrocytes cultures cellulaires (OLG) 15, 5, suite à une exposition à différents stress extracellulaires tels que des concentrations élevées de de potassium ou le glutamate. La lignée cellulaire immortalisée conditionnellement-N19-OLG (représentant l&#39;ancêtre O2A) a été obtenu auprès du Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, et a déjà été utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires de l&#39;expression du gène de la myéline et transduction du signal conduisant OLG différenciation (par exemple, 6, 10). Nous avons trouvé cette lignée cellulaire pour être robuste à l&#39;égard de transfection avec exogènes basique de la myéline des protéines (MBP) construit fusionnée à la GFP soit DP ou (rouge ou vert fluorescent protein) 13,12. Ici, les cultures de cellules N19-OLG ont été traités soit avec du chlorure de potassium 80 mM ou 100 mM glutamate de sodium pour imiter les fuites axonale dans la matrice extracellulaire pour induire l&#39;apoptose 9. Nous avons utilisé un bi-fonctionnelle de la caspase-3 contenant un substrat DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 sous-unités de reconnaissance et d&#39;un colorant liaison à l&#39;ADN 2. Le substrat pénètre rapidement dans le cytoplasme où elle est clivée par la caspase-3 intracellulaires. Le colorant, NucView 488 est libéré et entre dans le noyau de la cellule où il se lie d&#39;ADN et une fluorescence verte à 488 nm, de signalisation apoptose. L&#39;utilisation du NucView 488 caspase-3 substrat permet imagerie des cellules vivantes en temps réel 1, 10. Dans cette vidéo, nous avons également décrire la culture et la transfection de cellules immortalisées N19-OLG, ainsi que des techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes.

Imagerie des cellules vivantes de l&#39;apoptose médiée caspase-3 dans les cultures cellulaires immortalisée N19-oligodendrocyte utilisant le<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspase-3 du substrat. Cette technique est applicable pour les essais de la mort cellulaire programmée en temps réel dans une variété de types de cellules et de tissus.

Surveillance clivées activité caspase-3 et l&#39;apoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de Cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par

Le système nerveux central peut être soumis à un certain nombre de stress et d'insultes neurologiques, susceptibles de produire de nombreux effets néfastes conduisant à terme à un...

Cette procédure permet de surveiller en temps réel la mort cellulaire des cellules gliales induite par l'oligo DDR. Cela est réalisé en premier lieu par la culture des cellules, puis par la préparation des cellules pour l'imagerie de cellules vivantes. L'étape suivante consiste à appliquer un traitement aux cellules et à en observer les effets par microscopie de fluorescence.La dernière étape consiste à effectuer l'analyse des données. En définitive, les résultats montrent les taux de mort cellulaire dans une population cellulaire après un traitement ou un stimulus, en surveillant la fluorescence nucléaire provenant d'un colorant fluoré activé par la caspase. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la coloration immunohistochimique réside dans la capacité à recueillir simultanément plusieurs points temporels.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que les réponses aux traitements pharmacologiques, aux réactifs et à diverses interventions. Désormais, cette méthode permet d'obtenir des informations sur la mort cellulaire dans les cultures cellulaires. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les tissus ex vivo et organotypiques, notamment les tranches de cerveau.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés lorsqu'elles s'adapteront à la manipulation de tissus vivants plutôt que de tissus fixés. Une démonstration visuelle de cette technique est importante, car de nombreuses étapes sont nécessaires pour préparer des échantillons de cellules vivantes, contrairement aux tissus fixés. Commencez par décongeler les cellules gliales oligodendrocytaires immortelles N 19 dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant que les cellules décongèlent.Ajoutez sept millilitres de DMEM à forte concentration en glucose supplémenté avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine dans une boîte de culture de 10 centimètres. Ensuite, ajoutez la suspension cellulaire goutte à goutte dans la plaque et agitez doucement la boîte de Pétri pour répartir les cellules uniformément. Incubez les cellules à 34 degrés Celsius dans un incubateur à 5 cent de dioxyde de carbone pendant quatre heures après quatre heures.Aspirez le milieu des plaques pour éliminer tout DMSO. Cryoprotectant résiduel. Remplacez par sept millilitres de milieu frais après quatre à sept jours de croissance. Lorsque les cellules ont atteint une confluence de 70 à 80 %, aspirez le milieu et ajoutez un millilitre de goutte à goutte sur la couche cellulaire à l’aide d’une pipette, puis incubez à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, récoltez les cellules pour les semer dans une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres avec les cellules récoltées à une densité de 0,1 fois 10 puissance 6 cellules par millilitre, puis placez cette plaque dans l'incubateur de culture tissulaire. Après un autre passage, les cellules peuvent être mises en culture pour des expériences d'imagerie de cellules vivantes. Pour ce faire, récoltez les cellules comme précédemment, puis prélèvez 30 microlitres de la suspension cellulaire et comptez les cellules à l'aide d'un hémo-cytomètre.Ensuite, utilisez des pinces stériles pour placer des lamelles en verre non revêtues. Dans les puits d'une plaque de six puits, ajoutez les cellules dans chaque puits à une densité de 0,1 × 10⁶ cellules par millilitre. Dans deux millilitres de milieu DMEM à haute teneur en glucose, sans phénol, supplémenté avec 10 % FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine, laissez les cellules croître toute la nuit à 34 °C et 5 % CO₂ avant la transfection.Le lendemain, mélanger 100 microlitres de milieu sans sérum avec 0,5 à quatre microgrammes d'ADN plasmidique purifié et quatre microlitres de FU gene hd. Vortexer doucement le mélange deux fois, puis laisser le complexe d'ADN s'associer à température ambiante pendant cinq minutes. Une fois le temps d'incubation écoulé, ajouter directement le mélange d'ADN FU gene HD aux cellules en culture.Inclinez délicatement la plaque pour mélanger. Incubez ensuite les cellules pendant 48 heures supplémentaires à 34 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avant le traitement ou l'expérimentation. Allumez d'abord la boîte de commande de l'instrument de culture cellulaire en temps réel LCI Cham.Cela doit être fait trois heures avant le début de l'expérience afin de garantir un réchauffement complet de la platine. Au minimum, la boîte de commande doit être allumée une heure avant le début de l'expérience. Ensuite, en travaillant dans une hotte à flux laminaire, vaporisez la chambre de culture magnétique de type LCI Cham light et la pince avec de l'éthanol à 70 % et laissez-les sécher pendant cinq minutes.Retirer les cellules de l'incubateur et les examiner au microscope pour confirmer qu'elles sont en bonne santé. Les cellules doivent apparaître durantes et bien étalées sur le lamelle de verre, avec de nombreux prolongements membranaires. Les cellules présentant un nombre réduit de prolongements ou un noyau de forme irrégulière sont probablement stressées suite à la transfection et ne conviennent pas pour des expériences ultérieures réalisées sous hotte à flux laminaire.Inclinez la plaque à six puits et retirez le lamelle avec des pinces. Placez rapidement le lamelle, côté cellules vers le haut, dans le fond de la chambre. Veillez à ce que le lamelle ne sèche pas.Ensuite, fixez le corps principal magnétique de la chambre de culture et ajoutez 500 microlitres de milieu provenant de la plaque de 6 puits d'origine sur la partie supérieure du coverslip. Le réemploi du milieu diminue le niveau de stress subi par les cellules en raison des changements environnementaux et peut également s'avérer utile pour évaluer les facteurs sécrétés extracellulaires. Une fois le milieu ajouté, placez le couvercle en verre sur la chambre de culture et utilisez une mèche en papier Kim imprégnée à 70 % pour éliminer tout matériau résiduel susceptible d'interférer avec la microscopie, situé sur la face inférieure du coverslip.Placer la chambre de culture dans l’incubateur à 34 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Cette étape permettra de s'assurer que la chambre elle-même atteint 34 degrés, réduisant ainsi les déplacements du coverslip. À mesure que le métal s'échauffe, il est nécessaire d'effectuer les étapes suivantes avec un éclairage ambiant aussi faible que possible.Tout d'abord, Thora avait précédemment préparé une éléqua de vue nucléaire à température ambiante. Ensuite, retirez la chambre de culture de l'incubateur et placez-la rapidement dans la chambre environnementale du microscope. Allumez le réservoir de dioxyde de carbone pré-mélangé à 5 % équipé d'un double régulateur.Ensuite, utilisez l'objectif 10 fois avec la lampe du microscope réglée à environ 2,5 volts et un temps d'exposition de 240 millisecondes. Focalisez à l'aide de la microscopie en champ clair pour visualiser les cellules sur l'écran de l'ordinateur. Puis ajoutez une concentration de 80 millimolaire d'ions potassium ou d'un autre inducteur de l'apoptose aux cellules par un échange de milieu, en utilisant une perfusion lente et locale à l'aide d'une pompe péristaltique.Le substrat nuke view 4 88 est stable en culture cellulaire pour des expériences d'une durée allant jusqu'à 36 heures. Il est donc possible de réaliser des expériences sur cette période. Commencez par configurer le microscope afin de visualiser la fluorescence des protéines fluorescentes rouge et verte.Ensuite, cliquez sur le canal rouge pour afficher les cellules transfectées. Sélectionnez et enregistrez environ 12 images contenant plusieurs cellules transfectées, et sauvegardez ces points de la platine XY. Configurez le microscope pour acquérir des images en champ clair, canal rouge et canal vert, à ces positions enregistrées de la platine toutes les six minutes.Après avoir collecté plusieurs points XY à partir d'expériences réalisées en double ou en triple, compilez les données provenant d'expériences distinctes effectuées à différents jours et procédez à l'analyse des données et aux tests statistiques comme décrit dans le protocole écrit, afin de comparer le ratio de cellules négatives pour CASP bay à celui des cellules positives pour CASP bay. Le substrat Nuke view 4 88 peut indiquer un taux accru d'apoptose dans des cultures cellulaires gliales oligo DDR N 19. Suite à un traitement avec une concentration élevée de potassium extracellulaire, ces images de base ont été acquises à l’aide d’un objectif 10 fois.Les cellules N 19 ont été transfectées avec RFP et ont été soit traitées avec trois microlitres de nuke view, substrat 4 88 pour les cellules témoins, soit avec trois microlitres de nuke view, substrat 4 88 et 80 millimolaire de potassium. Ces images illustrent que le nombre de cellules apoptotiques augmente au fil du temps, trois, six et neuf heures après le traitement avec 80 millimolaire de potassium. Dans les conditions témoins, aucune quantité significative d'apoptose n'a été observée par rapport aux cultures traitées avec 80 millimolaire de potassium. Le signal vert de fond observé dans les conditions témoins indique les cellules qui entrent en apoptose sans l'ajout de potassium extracellulaire.Un cours temporel de 12 heures est suffisant pour des études impliquant des lésions neurologiques. Après 12 heures, les cultures traitées au potassium montrent environ 45 % de mort cellulaire. Pratiquement aucune des cellules dans l'expérience témoin n'exhibe d'apoptose au point temporel de 12 heures. Bien que dans d'autres situations, les expériences puissent devoir être prolongées.Ce graphique montre l'augmentation du nombre de cellules positives pour la caspase trois au cours des 12 heures de l'expérience. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure, et les données peuvent être collectées pendant la nuit si elle est correctement exécutée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de rester constant entre les traitements en suivant cette méthode.D'autres méthodes, telles que la coloration immunohistochimique, peuvent être utilisées pour examiner d'autres protéines en aval impliquées dans les voies étudiées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons pour l'imagerie. Acquérir un jeu de données et analyser vos résultats.

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Cette vidéo décrit un test luminescent in vitro de caspase-3/7 pour quantifier la mort cellulaire ou l’apoptose. Le dosage mesure la luminescence produite suite au clivage de la caspase-3/7 d’un substrat DEVD proluminescent. La luminescence générée est proportionnelle à l’activité de la caspase-3/7.

Caspase-3/7 Assay : Un test basé sur la luminescence pour quantifier l’apoptose en mesurant les activités de la caspase-3/7 dans les explants de peau de grenouille

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Visualisation de l’activation de la caspase dans des macrophages dérivés de monocytes humains

Les essais multiplex peuvent fournir des informations utiles pour les mécanismes cellulaires de base et d'éliminer les déchets de réactifs et d'expériences répétitives inutiles. Nous décrivons ici une caspase-3/7 dosage de l'activité de multiplexage, en utilisant des procédés fluorescents, luminescents et située, pour déterminer la viabilité cellulaire dans un modèle in vitro de l'hypothalamus après provocation par oxydation avec de l'acide palmitique.

Utilisation d&#39;un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l&#39;apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

Le terme anastase fait référence au phénomène dans lequel les cellules mourantes inversent un processus de suicide cellulaire à un stade avancé, se réparent elles-mêmes et finissent par survivre. Nous démontrons ici des protocoles de détection et de suivi des cellules qui subissent une anastase.

Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

Pour aborder les mécanismes de démyélinisation et d’apoptose neuronale dans les lésions corticales des troubles inflammatoires démyélinisants, différents modèles animaux sont utilisés. Nous décrivons ici une approche ex vivo en utilisant des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes sur des coupes de cerveau, entraînant la mort oligodendrogliale et neuronale. Les applications potentielles et les limites du modèle sont discutées.

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Anastasis est techniquement difficile à détecter en vivo , parce que les cellules qui ont inversé le processus de mort cellulaire peuvent être morphologiquement impossibles à distinguer des cellules saines normales. Nous décrivons ici les protocoles pour détecter et suivre des cellules subissant anastasis animaux vivants à l’aide de notre système de biocapteur nouvellement mis au point en vivo CaspaseTracker.

Détection de Anastasis In Vivo par CaspaseTracker biocapteur

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Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

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Le présent protocole décrit deux méthodes pour mesurer l’activité des caspases à travers un substrat fluorogénique à l’aide de la cytométrie en flux ou d’un spectrofluoromètre.

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Surveillance clivées activité caspase-3 et lapoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de Cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par (Vidéo) | JoVE Journal

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