Name: Détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes Intact par ELISA (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Découvrez la méthode NU-ELISA pour détecter les modifications post-traductionnelles sur les nucléosomes intacts. Cette technique sensible permet d'évaluer les états globaux de modification de la chromatine dans divers types cellulaires.

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Développement de la méthode ELISA-NU a été soutenue par NIH RO1AG023687.

1. Culture de cellules mammaliennes NU-ELISA peut être effectuée sur n'importe quel type de cellules de mammifères qui peuvent être mises en culture. Nous préférons pour préparer modéré à d'importants lots de cellules de sorte que les nucléosomes peuvent être isolés en quantité suffisante pour préparer plusieurs identique chargés plaques ELISA, permettant ainsi des tests avec plusieurs anticorps différents (Abs). Les échelles de culture suivants fournissent un abondant matériel: Pour les cellules de souris tige embyronic, pousser un ou deux plaques 15 cm de cellules sans cellules nourricières. Pour les fibroblastes, croissance de 5 à 10 15 cm à plaques confluent. 2. Isolement des noyaux Remarque: Toutes les étapes sont sur la glace avec pré-réfrigérée tampons, sauf comme indiqué. <ol><li> Trypsiniser cellules avec 3 ml de trypsine par assiette, mélanger, et ajouter 20 ml de PBS glacé / butyrate. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules dans 10 ml de PBS / butyrate et centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension dans 4 ml avec un tampon de lyse inhibiteurs de la protéase (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogénéiser les 20 coups de pilon de type B sur la glace. </li><li> Centrifuger à 2000g pendant 10 min à 4 ° C. (Le surnageant contient cytoplasme, ce qui n'est pas nécessaire pour ce protocole, mais il peut être sauvegardé pour d'autres usages si désiré). </li><li> Reprendre le culot dans 2 ml de glace froide tampon de lavage C (avec des inhibiteurs de la protéase). </li><li> Couche le matériel remis en suspension de plus de 5 ml coussin de saccharose à 30%, puis centrifuger à 2400g pendant 5 min dans un rotor swing. Les noyaux vont migrer à travers coussin, et les débris restent à l'interface. </li><li> Retirez tout le volume de liquide soigneusement et remettre en suspension les noyaux de glace de 250 tampons de lavage à froid ul C + inhibiteurs de protéase. </li></ol> 3. Isolement des nucléosomes in situ par des Micrococcal nucléase (MNase) Digestion Nous utilisons une procédure dans laquelle la chromatine est digérée in situ au sein des noyaux en leur insufflant MNase, suivie d'un traitement hypotonique à conduire sans nucléosomes intacte dans le surnageant. <ol><li> Ajouter 3 pi à 0,1 M CaCl 2 à l'échantillon. Mettre en bloc de 37 ° C chaleur. Permettez à assumer 37 ° C de température. </li><li> Ajouter 2 unités MNase (Micrococcal nucléase, Sigma-Aldrich, dissous à 2 dans un tampon de units/10μl MNase), puis incuber pendant à 37 ° C pendant 12 minutes, en mélangeant souvent avec une pointe de pipette. </li><li> Ajouter 6 ul de 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 pour arrêter la réaction. Mis sur la glace. </li><li> Centrifuger à 2000g pendant 4 min, éliminer le surnageant. Reprendre le culot dans 300 pl 0,2 mM Na-EDTA. Store sur la glace pendant 1 h avec pipetage doux occasionnels. (Ces conditions hypotoniques libérer nucléosomes libres de noyaux). </li><li> Centrifuger à 3000 g pendant 4 min à 4 ° C. Enregistrer le surnageant, qui contient des nucléosomes libres, sur la glace. </li><li> Reprendre le culot à nouveau avec 300 pl 0,2 mM Na-EDTA. Store sur la glace pendant 1 h avec pipetage doux occasionnels. </li><li> Centrifuger à 3000g pour 4min à 4 ° C. Conservez le surnageant et de combiner avec le premier surnageant de l'étape 5. Les préparatifs résultant mononucleosome peut être aliquotés et conservés à -80 ° C. </li></ol> Remarque: Le montant de la chromatine peuvent être grossièrement quantifiée en mesurant l'absorbance à 260 nm d'un échantillon de 10 ul ajouté à 990 pl d'eau. A 260 = 10 (après ajustement pour la dilution 1 / 100) correspond à environ 1mg/ml de la chromatine. En outre, durant la procédure ci-dessus, de petits échantillons peuvent être conservés et, plus tard analysés pour leur contenu en ADN pour contrôler la qualité et l'étendue des digestions MNase, qui devrait surtout contenir de l'ADN de 146 pb de longueur. L'échelonnement est indicatif de la digestion MNase incomplète. Remarque: Fig.1 contient un résumé schématisés d'isolement nucléaire et les digestions MNase étapes. 4. Nucléosome-ELISA (NU-ELISA) Nous détectons PTM sur les fractions contenant des espèces autochtones nuclesosomes intacts qui ont été immobilisés sur des plaques de microtitration de 96 puits ELISA. Pour chaque échantillon, nous faisons une série de deux dilutions, et elles sont appliquées sur des puits en triple exemplaire. <ol><li> Déposer sur des plaques MaxiSorp nuit à 4 ° C avec 50 ul / puits de nucléosomes dilués dans un tampon de revêtement. Suggestions de dilutions en série de nucléosomes sont préparés à partir de rangée du haut de la rangée du bas en ajoutant 0,1 mg, 0,05 mg, 0,025 mg, 0,0125 g, 0,00625 mg, 0,00313 mg, 0,00156 mg, avec le tampon seul revêtement (0 chromatine mg) dans le fond rangée. (Note: couvre la plaque sont nécessaires pour cette étape.) </li><li> Dans la matinée, se laver les plaques 4 fois avec 200 pl / puits PBS/0.5% Tween-20 à température ambiante (TA) pour un total combiné de 10 min avec un laveur de plaques. </li><li> Bloc 1 h à température ambiante avec 100 ul / puits PBS/0.05% de Tween-20 / 5% de BSA. </li><li> Retirez le tampon de blocage en secouant la plaque inversée brusquementdessus d'un évier. Couvrez et conservez les plaques à -20 ° C, ou aller directement à l'étape suivante. </li><li> Ajouter 1 ° Abs dans un volume de 50 pl / puits dilué 1:1000 (ou au besoin) dans PBS/0.05% de Tween-20 / 5% de BSA, incuber à température ambiante pendant 1 heure sur un agitateur. </li><li> Laver les plaques 4 fois avec 200 pl / puits PBS/0.5% Tween-20 à température ambiante et pour un total combiné de 10 min dans un laveur de plaques. </li><li> Ajouter la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à 2 ° Abs, dilué 1:5000 (ou au besoin) dans PBS/0.05% de Tween-20 / 5% de BSA à température ambiante pendant une heure sur un agitateur. </li><li> Laver les plaques 4 fois avec 200 pl / puits PBS/0.5% de Tween-20. Chaque lavage est à température ambiante et pour un total de 10 minutes avec un laveur de plaques. </li><li> Développer les plaques en ajoutant 50 pl de substrat TMB dans chaque puits pendant 10 min à température ambiante. Arrêter la réaction en ajoutant 50 pl / puits de 2N H 2 SO 4 et de lire les plaques de 450 nm. (Astuce: Centrifuger à 1500 rpm pendant 2 min à l'aide d'un rotor plaque à dissiper les bulles d'air dans le puits avant la lecture absorbances). </li><li> Exporter les lectures de fichiers tableur pour des analyses quantitatives et statistiques. </li></ol> Réactifs <table border="1"><tbody><tr><td> PBS / butyrate </td></tr><tr><td> 135 mM de NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 mM de KCl </td></tr><tr><td> 8 mM Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,5 mM KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 10 mM de Na-butyrate </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Lysis Buffer </td></tr><tr><td> 250 mM de saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM de Na-butyrate </td></tr><tr><td> 4 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> 0,1% de Triton X-100 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Laver le tampon C </td></tr><tr><td> 250 mM de saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM de Na-butyrate </td></tr><tr><td> 4 mM de MgCl2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Coussin de saccharose </td></tr><tr><td> 30% (p / v) de saccharose dans le tampon de lavage C </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Microccocal nucléase Tampon </td></tr><tr><td> 5 mM NaPO 4 tampon, pH 7,0 </td></tr><tr><td> 0,025 mM CaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Tampon de revêtement </td></tr><tr><td> Solution 80ml 170ml Solution A + B + 250ml dH 2 O </td></tr><tr><td> Solution A: 0,2 M Na 2 CO 3 </td></tr><tr><td> Solution B: 0,2 M de NaHCO 3 </td></tr></tbody></table> 5. Les résultats représentatifs En utilisant la méthode ELISA-NU, une série de plusieurs plaques identiques sont préparés qui peuvent être chargés avec la chromatine préparées sous la forme d'mononucleosomes. Nous préparent habituellement série de plaques à l'identique-chargés afin que chacun peut être sondé avec différents anti-PTM anticorps spécifiques (Abs). Nous avons également toujours préparer une plaque qui peut être sondé avec un Ab qui détecte les histones, sans égard à leur état de modification de chargement chromatine contrôle total. Ce contrôle est indispensable pour pouvoir ensuite comparer quantitativement le contenu du PTM nucléosomes préparés à partir d'échantillons différents. Pour quantifier les niveaux de PTM dans un échantillon donné, nous chromatine corriger les valeurs d'absorbance brutes en utilisant cette approche: d'abord, nous soustrayons tout signal de fond en utilisant les valeurs obtenues à partir de puits de contrôle ne contenant pas de chromatine (fond est généralement négligeable). Nous avons ensuite normaliser PTM signaux spécifiques aux NU-ELISA résultats obtenus à partir d'une plaque identique chargé qui a été dosé avec un Ab qui détecte nucléosomes indépendamment de leur état de modification. (Nous avons utilisé des anticorps polyclonaux dirigés spécifiques des histones H2A ou H2B à cet effet). Nous avons ensuite déterminer les moyens et les écarts pour chaque dilution de la chromatine, et utiliser les données obtenues à partir de la portion linéaire du test ELISA. Des exemples détaillés de NU-ELISA analyses mathématiques et statistiques ont été rapportés précédemment 4 <img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma Diagam des NU-ELISA étapes. A. Cellules mammifères sont récoltés; Noyaux B. sont séparés de cellules par Dounce homogenization, C. Perturbation cellules sont chargées sur le dessus d'un coussin de saccharose p / v 30%, D. Après centrifugation, les noyaux sont déposés dans le culot; E, F. chromatine sont digérées in situ à prédominance mononucleomes par MNase; G, H , je. mononucleosomes solubles sont extraites par un traitement hypotonique et centrifugation répétée de matières nucléaires résiduelles. Mononucleosomes juge à partir d'échantillons différents (SAMP étiquetés. 1 et 2 dans ce cas) sont enduits sur des puits de microtitration en série de manière identique-chargé avec des plaques et interrogé Le PTM-spécifiques Abs et PTM-Abs indépendante pour déterminer le chargement chromatine totale. Représentation des niveaux K. signal différentiel de détection dans deux échantillons qui diffèrent dans leur contenu PTM, mais ont les mêmes contenus chromatine globale, à en juger par les anti-H2B immunoréactivité.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

NU-ELISA fournit une méthode pour déterminer l&#39;état mondial des PTM nucléosome présents dans un type cellulaire particulier. NU-ELISA études ont montré que mondiale états de modification du nucléosome diffèrent dans les comparaisons de types de cellules divergentes 4. En outre, les NU-ELISA profils PTM changer lorsque les cellules sont exposées à des agents modulateurs épigénétiques comme trichostatine-A ou lorsque les cellules de souris tige embyronic sont différenciées 4. La méthode a également été appliquée avec succès pour étudier la chromatine des cellules ES humaines 5. Il est important de noter la NU-ELISA, dans sa forme actuelle, ne peuvent détecter la signature composite de PTM présents dans la somme totale de l&#39;épigénome cellulaire. Cela diffère nettement de l&#39;ensemble du génome immunoprécipitation de la chromatine, qui peut déterminer la distribution d&#39;un PTM spécifiques à travers des loci génétiques spécifiques. Les étapes initiales de la procédure NU-ELISA sont adaptés à partir des méthodes précédentes pour isoler mononucleosomes à partir des noyaux de mammifères 6,7. Ces méthodes adaptées fournissent un moyen rapide d&#39;obtenir de haute qualité mononucleosomes intacts de cellules de mammifères, et les fractions obtenues sont complètes dans leur contenu de la chromatine, mais contiennent beaucoup de matières nucléaires supplémentaires. Depuis Abs spécifiques sont utilisées, contaminent non nucléosomiques matériel est bien toléré dans le test ELISA-NU, à la différence de masse-spec approches qui nécessitent une plus grande pureté. Toutefois, NU-ELISA est plus sensible et plus quantitative que western blot 4, offrant ainsi de bonnes alternatives à des westerns et spectrométrie de masse pour la détection de PTM nucléosomes.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Micrococcal Nucleae </td><td> Sigma </td><td> N3755 </td><td> Faire des aliquotes de 2 tampons U/10μl, conservés à -20 ° C </td></tr><tr><td> Nunc MaxiSorp microplaques </td><td> Fisher </td><td> 12-565-135 </td><td> Couvre la plaque adhésive peut également être commandé auprès de Fisher </td></tr><tr><td> Laveuse automatique des plaques </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1-Step TMB-substrat ELISA </td><td> Pierce </td><td> 34028 </td><td> Conserver à 4 ° C préchauffer à température ambiante avant l&#39;utilisation ou tel qu&#39;indiqué sur la fiche technique </td></tr><tr><td> Microtitration lecteur de plaque </td><td> Bio-Rad lecteur de microplaques (modèle: 680) </td><td></td><td> La plupart des modèles colorimétriques lecteur de plaque sont adaptés </td></tr></tbody></table>

détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes intact par elisa

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Le génome des eucaryotes existe comme la chromatine, qui contient à la fois l&#39;ADN et des protéines. L&#39;unité fondamentale de la chromatine est le nucléosome, qui contient 146 paires de bases d&#39;ADN associé à deux chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4 1. Les queues N-terminale des histones sont riches en lysine et l&#39;arginine et sont modifiés après-transcriptionnellement par acétylation, la méthylation, et d&#39;autres modifications post-traductionnelles (PTM). La configuration du PTM nucléosomes peuvent affecter l&#39;activité transcriptionnelle de l&#39;ADN associées, fournissant ainsi un mode de régulation des gènes qui sont de nature épigénétique 2,3. Nous avons développé une méthode appelée nucléosome ELISA (NU-ELISA) pour déterminer quantitativement les signatures PTM mondial de nucléosomes extrait des cellules. NU-ELISA est plus sensible et plus quantitative que western blot, et il est utile d&#39;interroger l&#39;état epiproteomic de types cellulaires spécifiques. Cet article de journal vidéo montre des procédures détaillées pour effectuer les NU-ELISA analyse.

Nucléosomes ELISA (NU-ELISA) est une méthode sensible et quantitative pour détecter les tendances mondiales de l&#39;modifications post-traductionnelles dans les préparations de maternelle, nucléosomes intacte. Ces modifications incluent méthylations, acétylations, et des phosphorylations au histones spécifiques résidus d&#39;acides aminés, et donc NU-ELISA fournit une analyse globale de protéomique de l&#39;ensemble, les États modification de la chromatine des types cellulaires spécifiques.

Détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes Intact par ELISA

Le génome des eucaryotes existe sous forme de chromatine, laquelle contient à la fois de l'ADN et des protéines. L'unité fondamentale de la chromatine est le nucléosome, qui contient 146 ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer avec précision les niveaux relatifs des modifications post-traductionnelles au sein de préparations de nucléosomes cellulaires totaux obtenus à partir d'un million de cellules. Cela est réalisé en préparant d'abord des cultures homogènes de haute qualité de cellules de mammifères. Ensuite, les noyaux sont isolés des cellules par disruption mécanique à l'aide d'un homogénéisateur Dounce et par centrifugation.L'étape suivante consiste à obtenir des nucléosomes intacts en digérant la chromatine présente dans les noyaux et en effectuant une série d'extractions hypotoniques. Enfin, les nucléosomes sont analysés à l'aide d'un test ELIZA avec les contrôles appropriés afin d'identifier des modifications post-traductionnelles spécifiques. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant les niveaux relatifs de modifications spécifiques présentes dans les échantillons de nucléosomes.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le western blot et l'immunoprécipitation de chromatine est qu'une vue d'ensemble de plusieurs états de modification des nucléosomes peut être facilement déterminée. La méthode est nettement plus sensible et plus précise que le western blot et peut être réalisée dans la plupart des laboratoires équipés pour des expériences de biologie moléculaire générale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des cellules souches et de l'épigénétique, comme par exemple ce qui se produit lors d'événements majeurs de différenciation et de reprogrammation.Pour commencer la procédure, commencez par trypsiner les cellules avec trois millilitres de trypsine par plaque de 15 centimètres afin d'obtenir des cellules fraîchement trypsinisées. Ajoutez 20 millilitres de PBS froid additionné de butyrate. Transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez le tube pour recueillir les cellules à 1000 tr/min pendant cinq minutes, aspirez le surnageant et ajoutez 10 millilitres de PBS froid additionné de butyrate pour laver les cellules ; centrifugez à nouveau la suspension cellulaire à 1000 tr/min pendant cinq minutes.Éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans quatre millilitres de tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéases, comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, prélever les cellules à la pipette et les transférer dans un homogénéisateur à piston de type B, puis homogénéiser sur glace à l’aide de 20 allers-retours. Transférer ensuite l’homogénat dans un tube à centrifuger placé sur glace.Centrifuger l'échantillon à 2000 G pendant 10 minutes, à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant, qui contient le matériel cytoplasmique et les resus.Suspendez le culot dans deux millilitres de tampon de lavage C froid avec des inhibiteurs de protéases, puis déposez délicatement le matériau resuspendu sur un coussin de cinq millilitres de saccharose à 30 % dans un tube de centrifugeuse froid. Pour isoler les noyaux, effectuez une centrifugation à 2 400 ×g pendant cinq minutes dans un rotor à godets oscillants ; les noyaux migrent à travers le coussin tandis que les débris cellulaires restent à l'interface. Après la centrifugation, retirez soigneusement tout le volume liquide et resuspendez les noyaux dans 250 microlitres de tampon de lavage C froid contenant des inhibiteurs de protéases, puis transférez les noyaux dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Pour commencer l'isolement des nucléosomes, ajoutez trois microlitres de chlorure de calcium 0,1 molaire aux noyaux et placez-les dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que la température soit équilibrée. Ajoutez ensuite deux unités de micrococcal nuclease dans 10 microlitres de tampon micrococcal nuclease, et incubez pendant 12 minutes à 37 degrés Celsius. Mélangez fréquemment à l’aide d’une pointe de pipette.Après l'incubation, arrêter la réaction avec six microlitres de E-D-T-A de sodium 0,5 molaire à pH 8 et placer sur de la glace pour refroidir. Ensuite, centrifuger l'échantillon à 2000 ×g pendant quatre minutes ; après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 300 microlitres de E-D-T-A de sodium 0,2 millimolaire. Incuber l'échantillon sur glace pendant une heure, en mélangeant par pipetage doux et occasionnel.Après une centrifugation à 3000 G pendant quatre minutes, à quatre degrés Celsius, recueillir le surnageant, qui contient les nucléosomes libres, dans un nouveau tube Eppendorf et le conserver sur de la glace pour une réutilisation ultérieure des nucléosomes supplémentaires. Suspendre le culot dans 300 microlitres de 0,2 millimole d'EDTA au sodium comme précédemment et incuber sur de la glace pendant une heure avec un mélange doux occasionnel.Après l'incubation, centrifuger l'échantillon. Ensuite, combiner le surnageant obtenu avec le reste de l'échantillon dans le tube de microcentrifugeuse placé sur de la glace. Pour commencer le test Eliza des nucléosomes, charger une plaque Eliza de 96 puits avec une série descendante de cinq dilutions sérielles deux fois consécutives de nucléosomes et de tampon de revêtement, en commençant par 0,1 microgramme par 50 microlitres dans le puits supérieur ; chaque série de dilutions doit être chargée en triple exemplaire.N'oubliez pas d'inclure des puits contenant uniquement le tampon de revêtement comme témoins. Incubez la plaque toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Utilisez un laveur de plaques pour laver les puits avec 200 microlitres par puits de PBS contenant 0,5 % de Tween 20 à température ambiante, quatre fois au total, pour une durée cumulée de 10 minutes.Ajoutez maintenant 100 microlitres par puits de solution de blocage et incubez pendant une heure à température ambiante sur un agitateur rotatif. Après l'incubation, éliminez le tampon de blocage en secouant énergiquement la plaque retournée au-dessus d'un évier. Ensuite, ajoutez l'anticorps primaire dilué dans un volume de 50 microlitres par puits dans une solution de 5 % de PSA dans 0,05 % de Tween 20 dans du PBS, et incubez la solution pendant une heure sur un agitateur rotatif à température ambiante.Après l'incubation avec l'anticorps primaire, laver les plaques comme précédemment à l'aide du laveur de plaques. Une fois le cycle de lavage terminé, ajouter 50 microlitres par puits d'anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort, dilué dans du PBS contenant 5 % de BSA et 0,5 % de Tween 20, puis incuber une heure à température ambiante sur un agitateur rotatif après l'incubation avec l'anticorps secondaire. Laver ensuite les plaques comme précédemment.Utilisation du laveur de plaques pour développer la plaque. Ajouter 50 microlitres de substrat TMB Eliza dans chaque puits et incuber pendant 10 minutes. À température ambiante, les puits de la plaque ELIZA deviennent bleus et l'intensité est proportionnelle à la quantité de modifications des nucléosomes présentes dans chacun d'eux.Arrêtez alors la réaction en ajoutant 50 microlitres par puits d'acide sulfurique deux normal. La couleur vire au brun ; centrifugez la plaque à 1500 tr/min pendant deux minutes afin d'éliminer les bulles d'air éventuelles.La plaque est désormais prête à être quantifiée à l'aide d'un lecteur de plaques en mode colorimétrique. Enfin, lire la plaque à 450 nanomètres et exporter les résultats pour analyse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement après son développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les cellules souches pour explorer les réponses épigénétiques aux événements de différenciation et de reprogrammation au niveau de tout l'épiprotoome.

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Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Enquêtes multiples, des modifications post-traductionnelles endogènes pour une protéine cible peuvent être extrêmement difficiles. Utilisent les techniques décrites ici un système tampon et de filtre de lyse optimisé développé avec PTM-ciblage spécifique, des matrices d’affinité afin de détecter les modifications de la phosphorylation acétylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 et de la tyrosine pour une cible protéine à l’aide d’un système unique et simplifié.

Utilisant un système d’enrichissement immunoprécipitation complète afin d’identifier un profil endogène Modification post-traductionnelle des protéines cibles

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d'ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro

Le présent protocole met en évidence une méthode modifiée pour détecter et quantifier les réticulations ADN-protéines (DPC) et leurs modifications post-traductionnelles (PTM), y compris l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation induites par les inhibiteurs de la topoisomérase et par le formaldéhyde, permettant ainsi l’étude de la formation et de la réparation des DPC et de leurs PTM.

Détection quantitative des réticulations ADN-protéines et de leurs modifications post-traductionnelles

Un flux de travail analytique basé sur la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) pour une analyse ascendante hautement fiable et hautement reproductible des modifications et de l’identification des histones en fonction des principaux paramètres (temps de rétention [RT], section efficace de collision [CCS] et rapport masse/charge précis [m/z]).

Criblage de modification des histones par chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité des ions piégés et spectrométrie de masse à temps de vol

Des variantes génétiques chez le membre humain de la famille Spindline 4 (SPIN4) ont récemment été identifiées chez des patients atteints de prolifération osseuse, un trouble du développement nouveau. Un protocole et de nouveaux résultats décrivant l’identification biochimique des histones modifiés dans le contexte des nucléosomes en tant que substrats de liaison au SPIN4 sont présentés.

Identification des histones modifiées comme substrats de liaison du membre 4 de la famille des spindlines humaines (SPIN4) par des réseaux peptidiques et un pulldown des nucléosomes natifs

Découvrez la méthode NU-ELISA pour détecter les modifications post-traductionnelles sur les nucléosomes intacts. Cette technique sensible permet d'évaluer les états globaux de modification de la chromatine dans divers types cellulaires.

Détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes Intact par ELISA

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