Détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes Intact par ELISA

L’objectif global de cette procédure est de déterminer avec précision les niveaux relatifs de modifications post-traductionnelles dans les préparations de nucléosomes cellulaires totaux obtenus à partir d’un million de cellules. Ceci est accompli en préparant d’abord des cultures homogènes de cellules de mammifères de haute qualité. Ensuite, les noyaux sont isolés des cellules par rupture mécanique avec un abaissement, un homogénéisateur et une centrifugation.

L’étape suivante consiste à obtenir des nucléosomes intacts en digérant la chromatine présente dans les noyaux et en effectuant une série d’extractions hypotoniques. Enfin, les nucléosomes sont interrogés à l’aide d’un test ELIZA avec les contrôles appropriés pour identifier des modifications post-traductionnelles spécifiques. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent les niveaux relatifs de modifications spécifiques présentes dans les échantillons de nucléosomes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le western blot et l’immunoprécipitation de la chromatine est qu’il est facile de dresser un tableau global d’un certain nombre d’états de modification des nucléosomes. La méthode est beaucoup plus sensible et précise que le western blot et peut être réalisée dans la plupart des laboratoires équipés pour l’expérimentation générale en biologie moléculaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches et de l’épigénétique, telles que ce qui se passe lorsque des événements majeurs de différenciation et de reprogrammation se produisent.

Pour commencer la procédure, essayez d’abord d’aniser les cellules avec trois millilitres de trypsine par plaque de 15 centimètres pour essayer des cellules fraîchement inisées. Ajouter 20 millilitres de butyrate de PBS glacé. Transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez le tube pour collecter les cellules à 1000 tr/min pendant cinq minutes, aspirez le surnageant et ajoutez 10 millilitres de butyrate de PBS glacé pour laver la suspension cellulaire à 1000 tr/min pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant et mettez en suspension la pastille cellulaire dans quatre millilitres de tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, pipetez les cellules vers un pilon de type B homogénéisateur sur de la glace homogénéiser avec 20 coups. Transférez ensuite l’homogénat dans un tube à centrifuger sur de la glace.

Centrifuger l’échantillon à 2000 G pendant 10 minutes. À quatre degrés Celsius. Retirez le super nommé, qui contient le matériel cytoplasmique et le réus.

Mettez la pastille en suspension dans deux millilitres de tampon de lavage à froid glacé C Avec des inhibiteurs de protéase, superposez doucement le matériau remis en suspension sur un coussin de cinq millilitres à 30 % de saccharose dans un tube de centrifugation froid. Pour isoler les noyaux centrifuges à 2,400 G pendant cinq minutes dans un godet oscillant, les noyaux du rotor migreront à travers le coussin et les débris cellulaires resteront à l’interface. Après la centrifugation, retirez soigneusement tout le volume de liquide et remettez les noyaux en suspension dans 250 microlitres de tampon de lavage à froid glacé C avec des inhibiteurs de protéase, transférez les noyaux dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Pour commencer l’isolement des nucléosomes, ajoutez trois microlitres de chlorure de calcium de 0,1 molaire dans les noyaux et placez-les dans un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la température soit équilibrée. Ajoutez ensuite deux unités de micro nucléase cocale dans 10 microlitres de micro nucléase cocale, tamponnez et incubez pendant 12 minutes à 37 degrés Celsius. Mélangez fréquemment avec une pointe de pipette.

Après l’incubation, arrêtez la réaction avec six microlitres de sodium 0,5 molaire E-D-T-A-P-H huit, et placez sur de la glace pour refroidir. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 2000 G pendant quatre minutes après la centrifugation, jetez le silet et remettez la pastille en suspension. Dans 300 microlitres d’EDTA de 0,2 millimole ou de sodium, incubez l’échantillon sur de la glace pendant une heure avec un pipetage doux occasionnel pour mélanger.

Suite à une centrifugation à 3000 G pendant quatre minutes. À quatre degrés Celsius, recueillir le surnageant, qui contient les nucléosomes libres dans un nouveau tube de Fuge, et stocker sur la glace les nucléosomes supplémentaires délibérés. Suspendez la pastille dans 300 microlitres de 0,2 millimole ou de sodium EDT comme précédemment et incubez sur de la glace pendant une heure avec un mélange doux occasionnel.

Après l’incubation, centrifugez l’échantillon. Encore une fois, combinez le SNAT obtenu avec l’échantillon restant dans le tube de la micro-fuge sur de la glace. Pour commencer le test Eliza du nucléosome, chargez une plaque Eliza de 96 puits avec une série descendante de cinq, une dilution en série deux fois des nucléosomes et un tampon d’enrobage, en commençant par 0,1 microgramme par 50 microlitres dans le puits supérieur, toutes les séries de dilution doivent être chargées en trois exemplaires.

N’oubliez pas d’inclure les puits avec tampon de revêtement uniquement comme témoins. Incuber l’assiette toute la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Utilisez un laveur de plaques pour laver les plaques avec 200 microlitres par puits de 0,5 %entre 20 en PBS à température ambiante quatre fois pour un total combiné de 10 minutes.

Ajoutez maintenant 100 microlitres par puits de solution de blocage et incubez pendant une heure à température ambiante sur un rotateur. Après l’incubation, retirez le tampon de blocage en secouant vivement la plaque inversée au-dessus d’un évier. Ensuite, ajoutez l’anticorps primaire dilué dans un volume de 50 microlitres par puits dans une solution de 5 % de PSA dans 0,05 % entre 20 dans PBS incubez la solution pendant une heure sur un rotateur à température ambiante.

Après l’incubation primaire de l’anticorps, lavez les plaques comme avant d’utiliser le laveur de plaques. Une fois la procédure de lavage terminée, ajoutez 50 microlitres par puits d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort dilués dans du PBS avec 5 % BS, A et 0,5 % 20 incuber à température ambiante pendant une heure sur un rotateur après l’incubation secondaire des anticorps. Lavez les assiettes comme précédemment.

Utilisation de la rondelle de plaque pour développer la plaque. Ajoutez 50 microlitres de substrat TMB Eliza dans chaque puits et incubez pendant 10 minutes. À température ambiante, les puits de la plaque ELIZA deviendront bleus et l’intensité est proportionnelle à la quantité de modifications nucléosologiques présentes dans chacun.

Eh bien, arrêtez la réaction. En ajoutant 50 microlitres par puits de deux acides sulfuriques normaux. La couleur changera en brun, centrifugez la plaque à 1500 tr/min pendant deux minutes pour dissiper les bulles d’air.

La plaque est maintenant prête pour la quantification sur un lecteur de plaques métriques couleur. Enfin, lisez la plaque à 450 nanomètres et exportez les résultats pour analyse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée après son développement.

Cette technique a ouvert la porte aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les cellules souches pour explorer les réponses épigénétiques aux événements de différenciation et de reprogrammation au niveau de l’ensemble de l’épiprotéome.