Mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée Assay pour quantifier l'efficacité d'induction cardiogénique

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier la régulation temporelle cruciale nécessaire à la différenciation des cardiomyocytes dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cela est réalisé en formant d'abord des corps embryonnaires dans une plaque de 96 puits à fond rond afin de standardiser la formation des EB comme deuxième étape. Des modulateurs protéiques ou chimiques sont ajoutés aux EB selon un cours temporel prédéterminé, ce qui permettra un contrôle temporel des voies étudiées.

Ensuite, les EBS battants sont quantifiés manuellement afin de déterminer l'efficacité d'induction de divers schémas de modulation de signal. Les résultats obtenus révèlent les exigences temporelles des voies de signalisation essentielles à la différenciation des cardiomyocytes, en se basant sur le pourcentage d'EBS battants formés et sur une confirmation effectuée à l'aide de la méthode de la goutte suspendue. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la méthode de la goutte suspendue, est qu'elle normalise et simplifie une procédure laborieuse, tout en permettant une lecture directe facilitant la quantification.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules souches, comme l'identification de la coagulation de signaux essentiels qui oriente la différenciation vers le type cellulaire souhaité. Pour commencer cette procédure, cultivez des cellules souches embryonnaires de souris Gro dans des plaques de culture cellulaire de 10 centimètres avec un milieu pour cellules souches embryonnaires de souris enrichi en facteur inhibiteur de la leucémie. Lorsque les cellules ES présentent une confluence de 50 à 70 %, elles sont prêtes à être utilisées.

Retirer le milieu ES et rincer les cellules une fois avec cinq millilitres de PBS stérile. Ajouter deux millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 % dans chaque plaque, puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, arrêter l'action de la trypsine par l'EDTA en ajoutant trois millilitres de milieu ES par plaque et transférer les cellules dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.

Faire tourner à 1 000 tours par minute pendant trois minutes. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire avec la quantité souhaitée de milieu EB. Compter le nombre de cellules, puis diluer les cellules à cinq fois 10 puissance trois cellules par millilitre.

Dans le milieu EB, à l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 100 microlitres de milieu EB contenant des cellules dans chaque puits d’une plaque microtitration de 96 puits à fond rond. Le nombre de plaques de 96 puits nécessaire dépendra du nombre de conditions et de points temporels de l’expérience. Placez les plaques microtitration de 96 puits à fond rond dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin d’identifier les fenêtres temporelles critiques des principales voies de signalisation pour la cardiogenèse.

Des modulateurs de voies de signalisation spécifiques sont ajoutés aux cellules ES. Dans les plaques de 96 puits à fond rond, ajoutez le modulateur de signalisation, dilué dans le milieu, dans chaque puits à différents moments. La moitié des puits de chaque plaque de 96 puits est utilisée pour chaque point de départ du traitement.

Un témoin véhicule est ajouté aux 48 autres puits pour chaque point temporel. À différents moments d'arrêt, nous allons éliminer les modulateurs de signalisation de chaque puits en changeant le milieu, et une grande précaution doit être prise lors de cette opération afin d'éviter de perturber les corps embryonnaires. À différents moments d'arrêt, éliminer les modulateurs en renouvelant le milieu des corps embryonnaires pour les puits. Incliner la plaque de 96 puits d'environ 10 degrés et retirer délicatement le milieu du puits à l’aide d’une pipette multicanal.

Ensuite, ajouter à nouveau le milieu EB sans modulateur dans chaque puits pour tout traitement de plus de 48 heures. Changer le milieu EB supplémenté avec des modulateurs frais tous les deux jours jusqu'au moment d'arrêt souhaité. Sept jours après l'induction des EBS par transfert des cellules ES dans des plaques de 96 puits, examiner la contraction des EB au microscope.

Noter les puits contenant des EBS en contraction comme positifs afin d'obtenir les pourcentages d'EBS en contraction pour chaque durée de traitement différente. Les fenêtres temporelles de signalisation pour la cardiogenèse identifiées par les expériences en plaque de 96 puits peuvent être vérifiées dans des EBS formés à partir de gouttelettes suspendues, appelées gouttelettes EB suspendues. Préparez d'abord des boîtes de Pétri en ajoutant trois à quatre millilitres de PBS afin de prévenir ultérieurement toute aberration des gouttelettes.

Ensuite, une suspension de cellules ES préparée à une densité finale de 2,5 × 10⁴ cellules par millilitre est versée dans une boîte bactériologique pour un accès facile. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez des gouttes de 20 µL de cellules ES sur les couvercles inversés des boîtes de Pétri. Veillez à ce que les gouttelettes individuelles ne se touchent pas.

En général, un couvercle peut contenir jusqu'à 80 gouttes. Retournez ensuite le couvercle au-dessus de la boîte de Pétri contenant du PBS et incubez pendant 48 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre la formation des embryocorps. Après 48 heures, rincez les embryocorps formés à partir des gouttes suspendues de chaque couvercle avec trois millilitres de milieu pour embryocorps.

Prélevez deux couvercles d'EBS et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri. Incubez la boîte de Pétri pendant quatre jours dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Au quatrième jour, transférez les EBS en suspension sur des plaques de six puits revêtues de gélatine à 0,2 % en général. Transférez 30 EBS dans chaque puits et incubez avec des modulateurs de signalisation à la période déterminée à partir des expériences réalisées en plaque de 96 puits, sept jours après la formation des gouttes suspendues.

Observer les EBS au microscope pour la contraction des cellules ES. Les cellules ES cultivées dans les puits arrondis d'une plaque de 96 puits formeront des EBS, comme le montre cette image représentative d'un EB formé au jour 4. Les points temporels critiques pour la cardiogenèse des cellules ES correspondent aux fenêtres temporelles contenant le pourcentage le plus élevé d'EBS contractiles traités par des modulateurs de signalisation, comparé au témoin véhicule. On observe ici un foyer de contraction spontanée de cardiomyocytes formé à partir de cellules ES traitées à la morphine dorsale, au jour 10 de différenciation sur une plaque de microtitration de 96 puits.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'identifier efficacement la régulation temporelle critique et les fenêtres temporelles des voies de signalisation clés dans la cardiogenèse des cellules souches embryonnaires.