Mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée Assay pour quantifier l'efficacité d'induction cardiogénique

L’objectif général de l’expérience suivante est d’identifier la régulation temporelle cruciale nécessaire à la différenciation des cardiomyocytes dans les cellules souches embryonnaires de souris. Ceci est réalisé en formant d’abord des corps embryonnaires dans une plaque inférieure ronde à 96 puits pour standardiser la formation d’EB dans un deuxième temps. Des modulateurs protéiques ou chimiques sont ajoutés à l’EBS sur une durée prédéterminée, ce qui permettra un contrôle temporel des voies examinées.

Ensuite, les EBS de battement sont quantifiés manuellement pour déterminer l’efficacité d’induction de divers schémas de modulation de signal. On obtient des résultats qui montrent les besoins temporels des voies de signalisation essentielles pour la différenciation des cardiomyocytes en fonction du pourcentage de battements EBS formés et de la confirmation par la méthode de la goutte suspendue. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les gouttes suspendues est qu’elle normalise et simplifie une procédure à forte intensité de main-d’œuvre et permet une lecture simple pour la quantification.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules souches, telles que l’identification de la coagulation de signalisation essentielle qui oriente la différenciation vers le type de cellule souhaité pour commencer cette procédure. Cellules souches embryonnaires de souris Gro dans des plaques de culture cellulaire de 10 centimètres avec un milieu cellulaire ES de souris complété par un facteur inhibiteur de leucémie. Lorsque les cellules ES sont à 50 à 70 % de confluence, elles sont prêtes à l’emploi.

Retirez le milieu ES et rincez les cellules une fois avec cinq millilitres de PBS stérile. Ajoutez deux millilitres de 0,05 % de trip d’EDTA dans chaque assiette et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, éteignez les déclenchements dans l’EDTA avec trois millilitres de média ES par plaque et transférez les cellules dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.

Tournez à 1000 rotations par minute pendant trois minutes. Après la centrifugation, retirez le supinate et remettez en suspension la pastille cellulaire avec la quantité souhaitée de milieu EB. Comptez le nombre de cellules, puis diluez les cellules à cinq fois 10 à trois cellules par millilitre.

Dans un milieu EB à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de milieu EB contenant des cellules dans chaque puits d’une plaque de microtitration à fond rond de 96 puits. Le nombre de plaques de 96 puits nécessaires dépendra du nombre de conditions et de points temporels de l’expérience. Placez les 96 plaques de microtitration à fond rond dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pour identifier les fenêtres temporelles critiques des principales voies de signalisation de la genèse cardiaque.

Des modulateurs de voies de signalisation spécifiques sont ajoutés aux cellules ES. Dans les 96 plaques de puits à fond rond, ajoutez le modulateur de signalisation, qui est dilué dans un média dans chaque puits à différents points temporels. La moitié des puits de chaque plaque de 96 puits est utilisée pour chaque point de départ du traitement.

Une commande de véhicule est ajoutée aux 48 autres puits pour chaque point temporel À différents points d’arrêt, nous allons laver les modulateurs de signalisation de chaque puits en changeant le média et il faut faire très attention à ne pas perturber les corps embryonnaires à différents points d’arrêt. Lavez les modulateurs en changeant le média EB pour les puits. Inclinez la plaque à 96 puits d’un angle d’environ 10 degrés et retirez délicatement le fluide du puits à l’aide d’une pipette multicanaux.

Ensuite, rajoutez du milieu EB sans modulateur à chaque puits pour tout traitement de plus de 48 heures. Changez le média EB complété par de nouveaux modulateurs tous les deux jours jusqu’à l’heure d’arrêt souhaitée. Sept jours après l’EBS, les cellules ES ont été induites par le transfert de cellules ES sur des plaques de 96 puits pour examiner la contraction de l’EB au microscope.

Évaluez les puits avec des EBS contractants comme positifs pour obtenir les pourcentages de contractants EBS pour chaque cycle de traitement différent. Les fenêtres temporelles de signalisation pour la genèse cardio identifiées par les expériences sur plaque de 96 puits peuvent être vérifiées dans l’EBS fabriqué à partir de gouttelettes suspendues pour fabriquer des gouttelettes EB suspendues. Préparez d’abord des boîtes de Pétri en ajoutant trois à quatre millilitres de PBS pour éviter l’aberration des gouttelettes plus tard.

Ensuite, une suspension de cellules ES préparée à une densité finale de 2,5 fois 10 pour les quatre cellules par millilitre est versée dans une boîte bactérienne pour un accès facile. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez des gouttes de 20 microlitres de cellules ES sur les couvercles inversés des boîtes de Pétri. Ne laissez pas les gouttelettes individuelles se toucher.

Généralement, un couvercle peut contenir jusqu’à 80 gouttes. Ensuite, retournez le couvercle sur la boîte de Pétri contenant du PBS et incubez pendant 48 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour permettre la formation d’EB. Après 48 heures, lavez l’EBS formé de gouttelettes suspendues à chaque couvercle avec trois millilitres de média EB.

Tirez deux couvercles d’EBS dans une nouvelle boîte de Pétri. Incuber la boîte de Pétri pendant quatre jours dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone le quatrième jour, transférer EBS en suspension sur des plaques à six puits recouvertes de gélatine à 0,2 % en général. 30 EBS sont transférés à chaque modulateur de signalisation d’incubation de puits à la période de temps identifiée à partir des expériences sur 96 plaques de puits, sept jours après la formation des gouttelettes suspendues.

Observez l’EBS au microscope pour la contraction de l’EB Les cellules ES cultivées dans les puits à fond rond d’une plaque de 96 puits formeront l’EBS comme le montre cette image représentative d’un EB formé au quatrième jour. Les points temporels critiques pour la cardiogenèse de l’ES sont les fenêtres de temps qui contiennent le pourcentage le plus élevé de contraction de l’EBS traitée par des modulateurs de signalisation par rapport à la commande du véhicule. On voit ici un foyer de cardiomyocytes se contractant spontanément formé à partir de cellules ES traitées à la morphine dorsale au 10e jour de différenciation sur une plaque de microtitration de 96 puits.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier efficacement la régulation temporelle critique, les fenêtres des principales voies de signalisation dans la genèse cardio ES.