Name: Mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée Assay pour quantifier lefficacité dinduction cardiogénique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Découvrez un protocole d'induction cardiogénique basé sur des cellules souches embryonnaires de souris pour identifier les fenêtres temporelles critiques des voies Wnt/β-caténine et BMP. Cette méthode standardisée permet de quantifier efficacement la différenciation en cardiomyocytes.

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1. Corps embryonnaire (EB) en utilisant la formation de base 96-rondes et des plaques de microtitration <ol><li> Cultiver des cellules ES de souris dans des assiettes de 10 cm de culture de cellules de souris avec des moyennes de cellules ES complétée par FRV. </li><li> Lorsque les cellules ES sont prêts à l&#39;emploi (généralement à 50-70% de confluence), retirer le support ES et rincer les cellules une fois avec 5ml de PBS stérile. </li><li> Ajouter 2ml 0,05% de trypsine / EDTA à chaque plaque et incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 ~ 5 minutes, la trypsine EDTA Quench avec 3 supports ES ml. </li><li> Transfert aux cellules de tubes Falcon 50 ml et centrifuger à 1000 rpm pendant 3 minutes. </li><li> Retirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire avec la quantité désirée de EB médias. </li><li> Comptez le nombre de cellules et de diluer les cellules à 5 x10 3 cellules / ml dans EB médias. </li><li> Utilisez pipette multicanaux d&#39;ajouter 100 pi d&#39;EB milieux contenant des cellules dans chaque puits de 96 - rondes microplaques bien. </li><li> Placer 96 - rondes microplaques bien dans un incubateur. </li></ol> 2. Identification des fenêtres de temps critique de la voie de signalisation clés (s) pour cardiogenèse <ol><li> Ajouter modulateurs spécifiques des voies de signalisation et de contrôle du véhicule dans chaque puits de plaques de microtitration à 96 puits contenant des cellules ES à des moments différents comme le jour 0, jour 1, jour 2, jour 3 et jour 4, Half etc de puits dans chaque 96 bien-plaque (48 puits) sont utilisés pour chaque point de temps de démarrage du traitement. </li><li> Laver les modulateurs en changeant des médias EB pour chaque 48 puits à différents points de temps d&#39;arrêt. Par exemple, pour obtenir deux jours de traitement pour les cellules ES à partir de 0 jour, laver modulateurs au jour 2. Pour tout traitement de plus de 48 heures, le changement des médias EB complété avec des modulateurs frais tous les deux jours jusqu&#39;à les points souhaités temps d&#39;arrêt. </li><li> Examiner la contraction EB sous un microscope après jour 7. Score des puits avec traitance EBS positives pour obtenir des pourcentages de contracter EBS pour chaque cours différents temps de traitement. </li><li> Les points moment critique pour cardiogenèse ES sont les délais dans lesquels contenaient le plus haut pourcentage de contracter EB traitées par les modulateurs de signalisation par rapport à la maîtrise du véhicule. </li></ol> 3. Vérification des fenêtres temporelles de signalisation pour cardiogenèse dans EBS fabriqués à partir de gouttelettes suspendues <ol><li> Préparer des boîtes de Petri en ajoutant avec 3-4 ml de PBS pour empêcher l&#39;évaporation. </li><li> Suivez les étapes 1,1 ~ 1,5 pour préparer les cellules ES à 2.5x10 4 cellules / ml densité cellulaire finale. </li><li> Verser le mélange dans un plat de cellules bactériennes pour un accès facile. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 20 gouttes ul (contenant environ 500 cellules) sur les couvercles inversé. Ne pas laisser les gouttelettes individuelles au toucher. En général, un couvercle peut accueillir jusqu&#39;à 80 gouttes. Retournez le couvercle sur le plat contenant du PBS. Incuber pendant 24 heures ou 48 heures pour permettre la formation EB dans un incubateur. </li><li> Laver EB formé à partir de gouttelettes suspendues de chaque couvercle avec 3 ml de milieu EB et piscine 2 couvercles d&#39;EBS pour un nouveau plat de Pétri. Ajouter le média EB à un volume total de 10ml. </li><li> Transfert EB en suspension sur 0,2% de gélatine revêtement des plaques 6 puits à 4 jours. En général 30 EBS sont transférés à chaque puits. Ajouter le média EB pour obtenir le volume de 2 ml finale pour chaque bien. </li><li> Incuber de signalisation modulateurs à la période identifiée à partir de 96 puits expériences assiette. </li><li> Observez la contraction EB sous microscope après jour 7 et cardiogenèse peut encore être caractérisé par RT-PCR, immunomarquage et d&#39;autres, si nécessaire. </li></ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

La méthode de la goutte suspendue a été la méthode conventionnelle utilisée pour la formation EB et la différenciation in vitro. Cependant, il est laborieux et les limites de flexibilité expérimentale en raison de problèmes logistiques. De la même façon, les résultats sont également plus difficiles à valider les compétences de l&#39;expérimentateur est cruciale pour la formation EB succès et la manipulation de gouttes suspendues. Une méthode plus simple est de former EBS dans une plaque à fond rond de 96 puits comme un processus en une seule étape. Ce format permet la différenciation in vitro d&#39;être standardisées et peut accueillir plus de conditions expérimentales en raison de la facilité de formation EB et la manipulation en aval (par exemple ajout ou le retrait de modulateur). Par ailleurs, le format 96 puits de plaque peut être optimisé pour être un outil de dépistage efficace dans les cellules ES de souris.

<ul><li> Souris CGR8 cellules sont principalement utilisés. </li><li> Moyennes ES: les médias GMEM supplémenté avec 10% de FBS inactivé à la chaleur, 2 mM L-glutamine, 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol, et 200 U / ml murin FRV. </li><li> Moyennes EB: Préparer les médias IMDM avec 20% de la chaleur de FBS inactivé, 1,6 mM de L-glutamine, 0,08 mM de 2-mercaptoéthanol, et 1X MEM non essentiels solution d&#39;acides aminés. </li></ul>

mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée assay pour quantifier l&#39;efficacité d&#39;induction cardiogénique

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

La différenciation des cellules souches pluripotentes est étroitement contrôlée par la régulation temporelle et spatiale des multiples voies de signalisation clés. Un des obstacles à sa compréhension a été la diversité des méthodes de corrélation des modifications des principaux événements de signalisation à l&#39;efficacité de différenciation. Nous décrivons ici l&#39;utilisation d&#39;un test de la souris les cellules souches embryonnaires (ES) en fonction d&#39;identifier les fenêtres de temps critique pour Wnt / β-caténine et l&#39;activation du signal BMP lors de l&#39;induction cardiogénique. Par notation de contracter des organes embryonnaires (EB) dans un format de plaque de 96 puits, nous pouvons rapidement quantifier l&#39;efficacité cardiogénique et d&#39;identifier les fenêtres moment crucial pour Wnt / β-caténine et l&#39;activation du signal BMP dans un cours à temps suite à des traitements spécifiques modulateur. Les principaux décrits ici ne se limite pas à l&#39;induction cardiaques seul, et peut être appliquée à l&#39;étude de plusieurs lignées cellulaires d&#39;autres. En outre, le format de 96 puits a le potentiel d&#39;être développé comme un débit élevé, un dosage automatisé pour permettre de tester les hypothèses expérimentales plus sophistiquées.

Nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;un test sur des cellules de souris ES base pour identifier les fenêtres de temps critique pour Wnt / β-caténine et l&#39;activation du signal BMP lors de l&#39;induction cardiogénique. La méthode fournit une plate-forme standardisée qui quantifie l&#39;efficacité fiable cardiogénique, et elle est applicable à l&#39;étude de lignées cellulaires d&#39;autres.

Mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée Assay pour quantifier l&#39;efficacité d&#39;induction cardiogénique

La différenciation des cellules souches pluripotentes est étroitement contrôlée par la régulation temporelle et spatiale de multiples voies de signalisation clés. L'un des obstacles...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier la régulation temporelle cruciale nécessaire à la différenciation des cardiomyocytes dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cela est réalisé en formant d'abord des corps embryonnaires dans une plaque de 96 puits à fond rond afin de standardiser la formation des EB comme deuxième étape. Des modulateurs protéiques ou chimiques sont ajoutés aux EB selon un cours temporel prédéterminé, ce qui permettra un contrôle temporel des voies étudiées.Ensuite, les EBS battants sont quantifiés manuellement afin de déterminer l'efficacité d'induction de divers schémas de modulation de signal. Les résultats obtenus révèlent les exigences temporelles des voies de signalisation essentielles à la différenciation des cardiomyocytes, en se basant sur le pourcentage d'EBS battants formés et sur une confirmation effectuée à l'aide de la méthode de la goutte suspendue. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la méthode de la goutte suspendue, est qu'elle normalise et simplifie une procédure laborieuse, tout en permettant une lecture directe facilitant la quantification.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules souches, comme l'identification de la coagulation de signaux essentiels qui oriente la différenciation vers le type cellulaire souhaité. Pour commencer cette procédure, cultivez des cellules souches embryonnaires de souris Gro dans des plaques de culture cellulaire de 10 centimètres avec un milieu pour cellules souches embryonnaires de souris enrichi en facteur inhibiteur de la leucémie. Lorsque les cellules ES présentent une confluence de 50 à 70 %, elles sont prêtes à être utilisées.Retirer le milieu ES et rincer les cellules une fois avec cinq millilitres de PBS stérile. Ajouter deux millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 % dans chaque plaque, puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, arrêter l'action de la trypsine par l'EDTA en ajoutant trois millilitres de milieu ES par plaque et transférer les cellules dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.Faire tourner à 1 000 tours par minute pendant trois minutes. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire avec la quantité souhaitée de milieu EB. Compter le nombre de cellules, puis diluer les cellules à cinq fois 10 puissance trois cellules par millilitre.Dans le milieu EB, à l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 100 microlitres de milieu EB contenant des cellules dans chaque puits d’une plaque microtitration de 96 puits à fond rond. Le nombre de plaques de 96 puits nécessaire dépendra du nombre de conditions et de points temporels de l’expérience. Placez les plaques microtitration de 96 puits à fond rond dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin d’identifier les fenêtres temporelles critiques des principales voies de signalisation pour la cardiogenèse.Des modulateurs de voies de signalisation spécifiques sont ajoutés aux cellules ES. Dans les plaques de 96 puits à fond rond, ajoutez le modulateur de signalisation, dilué dans le milieu, dans chaque puits à différents moments. La moitié des puits de chaque plaque de 96 puits est utilisée pour chaque point de départ du traitement.Un témoin véhicule est ajouté aux 48 autres puits pour chaque point temporel. À différents moments d'arrêt, nous allons éliminer les modulateurs de signalisation de chaque puits en changeant le milieu, et une grande précaution doit être prise lors de cette opération afin d'éviter de perturber les corps embryonnaires. À différents moments d'arrêt, éliminer les modulateurs en renouvelant le milieu des corps embryonnaires pour les puits. Incliner la plaque de 96 puits d'environ 10 degrés et retirer délicatement le milieu du puits à l’aide d’une pipette multicanal.Ensuite, ajouter à nouveau le milieu EB sans modulateur dans chaque puits pour tout traitement de plus de 48 heures. Changer le milieu EB supplémenté avec des modulateurs frais tous les deux jours jusqu'au moment d'arrêt souhaité. Sept jours après l'induction des EBS par transfert des cellules ES dans des plaques de 96 puits, examiner la contraction des EB au microscope.Noter les puits contenant des EBS en contraction comme positifs afin d'obtenir les pourcentages d'EBS en contraction pour chaque durée de traitement différente. Les fenêtres temporelles de signalisation pour la cardiogenèse identifiées par les expériences en plaque de 96 puits peuvent être vérifiées dans des EBS formés à partir de gouttelettes suspendues, appelées gouttelettes EB suspendues. Préparez d'abord des boîtes de Pétri en ajoutant trois à quatre millilitres de PBS afin de prévenir ultérieurement toute aberration des gouttelettes.Ensuite, une suspension de cellules ES préparée à une densité finale de 2,5 × 10⁴ cellules par millilitre est versée dans une boîte bactériologique pour un accès facile. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez des gouttes de 20 µL de cellules ES sur les couvercles inversés des boîtes de Pétri. Veillez à ce que les gouttelettes individuelles ne se touchent pas.En général, un couvercle peut contenir jusqu'à 80 gouttes. Retournez ensuite le couvercle au-dessus de la boîte de Pétri contenant du PBS et incubez pendant 48 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre la formation des embryocorps. Après 48 heures, rincez les embryocorps formés à partir des gouttes suspendues de chaque couvercle avec trois millilitres de milieu pour embryocorps.Prélevez deux couvercles d'EBS et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri. Incubez la boîte de Pétri pendant quatre jours dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Au quatrième jour, transférez les EBS en suspension sur des plaques de six puits revêtues de gélatine à 0,2 % en général. Transférez 30 EBS dans chaque puits et incubez avec des modulateurs de signalisation à la période déterminée à partir des expériences réalisées en plaque de 96 puits, sept jours après la formation des gouttes suspendues.Observer les EBS au microscope pour la contraction des cellules ES. Les cellules ES cultivées dans les puits arrondis d'une plaque de 96 puits formeront des EBS, comme le montre cette image représentative d'un EB formé au jour 4. Les points temporels critiques pour la cardiogenèse des cellules ES correspondent aux fenêtres temporelles contenant le pourcentage le plus élevé d'EBS contractiles traités par des modulateurs de signalisation, comparé au témoin véhicule. On observe ici un foyer de contraction spontanée de cardiomyocytes formé à partir de cellules ES traitées à la morphine dorsale, au jour 10 de différenciation sur une plaque de microtitration de 96 puits.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'identifier efficacement la régulation temporelle critique et les fenêtres temporelles des voies de signalisation clés dans la cardiogenèse des cellules souches embryonnaires.

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