Imagerie cellulaire en direct d'extrusion de l'épiderme du poisson zèbre développement

L’entretien des tissus épithéliaux nécessite l’élimination continue des cellules endommagées et mourantes sans perturber la fonction barrière. Pour ce faire, l’épithélium extrude les cellules mourantes en formant et en contractant un anneau d’actine et de myosine dans la cellule entourant la cellule mourante pour l’éjecter tout en fermant les espaces qui auraient pu résulter de sa sortie. Dans cet article vidéo, une méthode pour induire et imager l’extrusion de cellules apoptotiques à partir de l’épiderme de larves de poisson zèbre en temps réel.

Ceci est réalisé par l’injection d’une protéine fluorescente rouge marquée sonde d’actine F dans des embryons de poisson-zèbre transgénique à un stade cellulaire exprimant une protéine fluorescente verte dans l’épiderme pour visualiser les filaments agissant dans les tissus épithéliaux. Le quatrième jour, les larves post-personnalisation qui expriment à la fois la GFP et la RFP sont ensuite traitées avec G 4 18 pour induire l’apoptose dans l’épiderme. La dynamique de l’actine et les changements de forme des cellules épithéliales qui se produisent pendant l’extrusion sont visualisés par imagerie en accéléré sur un microscope confocal à disque rotatif.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immunoforce et les analyses, est que nous pouvons observer des changements rapides et une dynamique d’actine qui se produisent pendant le processus d’extrusion dans un tissu épithélial vivant. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer une procédure d’extrusion d’imagerie des cellules apoptotiques de l’épiderme du poisson zèbre en développement en temps réel. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour comprendre comment les cellules réorganisent de manière coordonnée leur cytosquelette d’acton pour éliminer les cellules apoptotiques tout en maintenant la fonction barrière et comment la perturbation du processus d’extrusion peut conduire à certains états pathologiques.

Pour visualiser la dynamique d’action pendant l’extrusion cellulaire dans l’épiderme du poisson-zèbre en développement, commencez par décongeler l’ARN précédemment transcrit sur de la glace. Nous transcrivons Mr.mRNA codant pour la protéine fluorescente rouge fusionnée au calp dans le domaine d’homologie de l’utrophine et agissons dans la protéine de liaison. Ajoutez du rouge de phénol à l’ARN dans un rapport de un à un pour une concentration finale d’ARN d’environ 30 nanogrammes par microlitre et chargez un microlitre de solution dans une aiguille capillaire tirée par remplissage arrière.

Collecter environ 75 embryons de 1 stade cellulaire C-K-G-F-P dans un tampon E3. Pipetez les embryons collectés dans le moule de micro-injection à l’aide d’une pipette à pâtes cinq et trois quarts et orientez doucement les embryons dans l’auge avec le FST Dumont. Cinquièmement, les forceps agissent rapidement pour éviter d’avoir à injecter l’ARN dans des embryons à plusieurs stades sous un stéréomicroscope de dissection de laboratoire standard.

Utilisez un micro-injecteur à pression contrôlée pour injecter l’ARN dans l’empiècement des embryons sous forme de fossile de phénol. Le rouge doit être visible dans l’embryon après l’injection. Assurez-vous d’injecter au moins 50 embryons pour chaque expérience.

Triez les embryons pour enlever les ovules non fécondés ou endommagés et incubez tous les embryons restants à 28 degrés Celsius. Après 24 heures, utilisez un microscope de dissection fluorescent pour sélectionner les embryons de poisson-zèbre qui ont un niveau élevé de fluorescence GFP dans l’épiderme et de fluorescence d’action marquée RFP. Incuber les embryons sélectionnés à 28 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à procéder au traitement médicamenteux pour induire l’exposition par apoptose à l’aminoglycoside.

L’antibiotique G 4 18 ou médicament provoque l’extrusion de cellules apoptotiques de l’épiderme des larves de poisson-zèbre en développement. Il est important de noter que ce traitement ne fonctionne que sur les larves qui sont quatre jours après la fécondation et plus pour induire l’extrusion cellulaire. Recueillir jusqu’à 25 larves de poisson-zèbre 4 jours après la fécondation exprimant à la fois la GFP et la RFP dans une boîte de culture de 35 x 10 millimètres contenant trois millilitres de milieu E.

Remplacez soigneusement le milieu par trois millilitres de E trois contenant un milligramme par millilitre de G quatre 18 et incubez la larve dans le médicament pendant quatre heures dans l’obscurité à 28 degrés Celsius. Retirez ensuite le support et remplacez-le par du préchauffage E trois milieux contenant 0,02 % de trica et procédez au montage des larves pour monter les larves pour l’imagerie. Transférez jusqu’à trois larves dans un tube d’aile de 1,5 millilitre et retirez la majeure partie du milieu E 3.

À l’aide d’une pipette coupée, une pipette de 120 microlitres à faible point de fusion s’applique au mélange du tube. Ensuite, pipetez doucement les larves et le mélange aro sur le verre de couverture au fond d’une boîte de culture matech. À l’aide d’un porte-goupille FST avec une goupille d’insertion ou une aiguille de tungstène attachée, orientez rapidement les larves de manière à ce qu’elles soient droites et plates contre le verre de protection.

Laissez l’aose se solidifier. Remplissez ensuite délicatement le plat avec du milieu E trois contenant 0,02 % de trica. Nous avons constaté que l’ensemble du processus d’extrusion des cellules apoptotiques à partir de l’épiderme des larves de poisson-zèbre en développement prend environ 20 minutes.

Ici, nous montrons comment mettre en place une expérience d’imagerie en accéléré à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif et du logiciel and ou IQ pour collecter une série de plans Z à travers une seule couche de l’épiderme du poisson-zèbre. Tout d’abord, allumez les lasers au néon à l’argon et à l’hélium, la caméra de microscope et la lampe fluorescente EPI dans le logiciel et ou IQ. Créez un protocole de série chronologique contenant les longueurs d’onde à imager.

La fréquence des intervalles entre les captures d’images et le nombre de fois que la capture doit être répétée Placez délicatement la boîte mattec contenant l’échantillon sur la platine du microscope, puis utilisez un objectif 20 fois avec lumière transmise pour vous concentrer sur les larves. Déplacez l’objectif d’immersion dans l’eau 40 fois dans la bonne position. En utilisant cet objectif, nous pouvons filmer environ 20 à 25 cellules par champ, ce qui nous permet de suivre les comportements cellulaires pendant l’extrusion, tout en résolvant la dynamique d’action subcellulaire.

Placez délicatement une goutte d’eau sur le dessus de l’objectif 40 fois et placez rapidement le plat mattec sur le dessus. Identifiez l’échantillon à l’aide d’un éclairage en fond clair, puis utilisez l’épifluorescence de 488 nanomètres pour vous concentrer spécifiquement sur l’épiderme positif à la GFP. Passez en mode de balayage confocal.

Ajustez l’intensité du laser et le temps d’exposition pour chacun des canaux en conséquence. Prenez soin d’équilibrer la puissance laser et le temps d’exposition pour une détection optimale de votre signal et pour éviter toute phototoxicité. Pour identifier les cellules extrudées, utilisez l’épifluorescence pour visualiser l’épiderme marqué à la GFP et identifiez un groupe de cellules dans un motif de rosette classique composé d’une collection de cellules entourant une petite cellule ronde au milieu.

De plus, il devrait y avoir une accumulation de l’actine marquée RFP visible sous la forme d’un anneau autour de la petite cellule ronde au milieu, une caractéristique de l’extrusion cellulaire. Une fois qu’une cellule d’extrusion a été identifiée, définissez rapidement les limites supérieure et inférieure de la série Z et la taille du pas. Ensuite, commencez à acquérir quatre ensembles de données confocales D pour visualiser les données et visualiser la contraction de l’anneau d’actine et les comportements épithéliaux qui se produisent autour de la cellule mourante.

Au fil du temps, faites des projections 3D de la série Z et enregistrez les données sous forme de fichier vidéo. Cette étape peut être effectuée à l’aide de divers progiciels. Cette figure montre l’expression de RFP UTR CH dans l’épiderme d’une larve de poisson-zèbre CK GFP quatre jours après la fécondation.

Ici, des projections Z d’un film en accéléré suivent la dynamique du jeu en direct. Au cours du processus d’extrusion des cellules épithéliales, les flèches désignent l’anneau d’actine formé par les cellules voisines, qui se contracte et se ferme en deux minutes. Suite à cette procédure, nous pouvons utiliser d’autres méthodes en combinaison avec cette technique, telles que l’utilisation d’inhibiteurs chimiques ou de mutations génétiques pour mieux comprendre comment la modification de l’extrusion peut conduire à certains états pathologiques.

Suite à l’échec de l’élimination des cellules apoptotiques, nous venons de vous montrer comment mettre en place une expérience d’imagerie en accéléré pour visualiser le processus d’extrusion à partir de l’épiderme du poisson-zèbre en développement. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de ne pas oublier de limiter la quantité de lumière exposée à votre échantillon afin d’éviter tout blanchiment photographique ou toxicité. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.