Quantifier la fréquence des tumeurs se propageant Cellules utilisant Limiter la greffe de cellules syngéniques de dilution dans Zebrafish

Le test de transplantation de cellules à dilution limite est la référence pour évaluer le potentiel d’auto-renouvellement dans des modèles animaux expérimentaux. Dans cette démonstration, des embryons de poisson-zèbre syngénique à un stade cellulaire sont injectés avec rag deux MIC et RAG deux GFP pour créer un poisson-zèbre transgénique qui développera une leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T marquée par fluorescence. À 60 jours de vie, les cellules primaires de la leucémie sont isolées du poisson-zèbre, puis purifiées à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence.

Ensuite, les cellules sont transplantées à la dilution limite dans la cavité péritonéale du poisson-zèbre adulte, et les poissons sont surveillés pour la croissance tumorale jusqu’à 90 jours. Enfin, le logiciel statistique d’analyse de dilution limite extrême est utilisé pour quantifier la fréquence de propagation des cellules leucémiques dans la tumeur d’origine. L’analyse de la transplantation de cellules à dilution limitée permet aux chercheurs d’évaluer avec précision le nombre de cellules auto-renouvelées contenues dans la majeure partie de la masse tumorale.

Ce sont ces cellules qui s’auto-renouvellent qui sont à l’origine de la formation du cancer et qui sont finalement responsables de la rechute. Le principal avantage de faire des tests de transplantation à dilution limitée dans le modèle de poisson zèbre est que de nombreux poissons peuvent être transplantés pour chaque expérience, ce qui permet une meilleure précision lors de la détermination de la fréquence des cellules tumorales qui se renouvellent automatiquement. Cette méthode permet de mieux comprendre les cellules tumorales qui se propagent dans les lymphocytes T, une leucémie lymphoblastique aiguë.

Il peut également être appliqué pour comprendre d’autres modèles de cancer du poisson-zèbre. Jessica Blackburn, une collègue du laboratoire et Sally Liu, une technicienne talentueuse, feront une démonstration de la procédure pour vous aujourd’hui Pour linéariser Rag deux CM et RAG deux G-F-P-D-N-A Constructs digérer 10 microgrammes de chaque plasmide avec l’enzyme de restriction, pas un à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’extraction au phényl chloroforme et la précipitation de l’éthanol, nous suspendons chaque plasmide dans 20 microlitres d’eau.

Déterminez les concentrations d’ADN sur un gel agro à 1 % en effectuant une dilution un à un, un à cinq et un à 10 de chaque plasmide digéré avec 20 microlitres, 10 microlitres et cinq microlitres d’une échelle d’ADN à haute gamme. Diluez maintenant l’ADN à une concentration finale de 60 nanogrammes par microlitre pour l’injection dans le syngen d’une souche CG. Un embryon de poisson-zèbre injecte 250 nanolitres de 30 nanogrammes par chiffon de microlitre deux CM et 30 nanogrammes par microlitre.

Combinez deux GFP en un seul stade cellulaire : des embryons de poisson-zèbre en ciblant soigneusement l’ADN directement dans la cellule et non dans le jaune. Conservez les embryons injectés à 28,5 degrés Celsius et retirez les embryons morts après 24 heures à cinq jours de vie, transférez les animaux dans de grands réservoirs environ 28 jours après l’injection. Anesthésie larvaire de poisson-zèbre en ajoutant 200 microlitres de quatre nanogrammes par millilitre de trica S à 25 millilitres d’eau du système de poisson dans une boîte de Pétri

Examiner les larves à la recherche du développement de TALL marqué par fluorescence à l’aide d’un microscope à épifluorescence pour détecter la fluorescence GFP. Séparez les larves tumorales positives de celles qui sont négatives pour s’assurer qu’aucun poisson leucémique n’est oublié dans l’analyse. Les larves négatives peuvent être examinées ultérieurement une fois que les tumeurs peuvent avoir grossi. Surveillez les poissons leucémiques marqués par fluorescence au moins une fois par semaine à l’aide du microscope à fluorescence épi pour suivre la croissance tumorale.

Lorsque les cellules leucémiques positives à la GFP ont dépassé plus de 50 % de l’animal, ajoutez un millilitre de quatre nanogrammes par millilitre. Trica S dans une boîte de Pétri contenant neuf millilitres d’eau du système de poisson pour sacrifier le poisson, placez le poisson dans une nouvelle boîte de Pétri contenant un millilitre de sérum de veau fœtal à 5 % dans 0,9 XPBS, faites macérer le poisson avec une lame de rasoir, pipetez le mélange pour dissocier les amas de grandes cellules. Passez ensuite les cellules à travers une passoire à mailles de 40 micromètres dans un tube de 50 millilitres.

Pipette 500 microlitres des cellules dans un tube en polystyrène de quatre millilitres. Ajoutez un microlitre d’un milligramme par millilitre, de l’iodure de péridium pour marquer le vortex de cellules mortes, puis gardez les cellules sur de la glace. Préparez également un poisson CG de type sauvage pour collecter des cellules sanguines normales, qui servent de support pour les cellules tumorales lors de la greffe à quatre millilitres de 5 % FPS dans 0,9 X PB S dans le tube de 50 millilitres pour un volume total de cinq millilitres.

Comptez les cellules sanguines normales diluées à trois fois 10 à la cinquième cellules par millilitre dans 5 % FBS dans 0,9 x pbs, puis pipetez 100 microlitres par puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’un trieur de cellules activé par fluorescence triez les cellules tumorales GFP positives PI négatives dans la plaque de 96 puits contenant les cellules sanguines aux doses indiquées. De plus, triez 10 000 cellules dans un puits sans cellules sanguines normales et réanalysez à l’aide de faits pour évaluer la pureté et la viabilité de la centrifugeuse de cellules triées. La plaque de 96 puits à 2000 GS pendant 10 minutes pour granuler les cellules.

Retirez 95 microlitres de snat et remettez en suspension les cellules dans les cinq microlitres restants. Injectez la suspension cellulaire dans la cavité péritonéale d’un poisson-zèbre syngénique adulte de plus de 60 jours à l’aide d’une micro-seringue de calibre 26 et demi. Les poissons-zèbres n’ont pas besoin d’être anesthésiés avant la transplantation.

Transplantez 45 poissons avec 10 cellules de leucémie, 20 poissons avec 100 cellules, sept poissons avec 1000 cellules et cinq poissons avec 10 000 cellules TALL environ 28 jours après la transplantation. Examen du poisson zèbre récepteur à l’aide d’un microscope à épifluorescence à l’aide d’un filtre d’émission de 4 85 20 de longueur d’onde d’excitation et de 5 30 25. Pour détecter la fluorescence GFP.

Noter le nombre de poissons positifs par rapport au nombre total de poissons injectés. Réexaminez le poisson tous les 14 jours pour un maximum de 90 et notez le nombre de poissons positifs. Lorsqu’un poisson positif à une tumeur devient plus abondant.

Sacrifiez l’animal par surdosage de trica US, entrez les résultats dans un tableau et téléchargez les données dans le logiciel d’analyse de dilution limite extrême basé sur le Web pour déterminer la fréquence des cellules leucémiques auto-renouvelées dans le TALL primaire CG les embryons de la souche ont été injectés avec RAG deux cmic et RAG deux larves GFP ont été dépistées pour le TALL primaire Après 28 jours conformément aux travaux précédents, environ 5 % des poissons injectés ont des lymphocytes T positifs à la GFP dans leur thymus, et 100 % de ces poissons développeront une leucémie. Ici, des cellules TALL marquées par fluorescence ont été triées à partir d’animaux malades âgés de 65 jours et utilisées dans l’essai de transplantation de cellules à dilution limite. Tout d’abord, une démarche a été dessinée pour sélectionner des cellules uniques.

Ensuite, des cellules négatives à l’iodure de propidium ont été sélectionnées. Et enfin, une démarche a été dessinée pour sélectionner uniquement les cellules leucémiques positives à la GFP pour le tri. Dans cet exemple de poisson transplanté TALL au jour 28, les tumeurs à un stade précoce ont été observées comme une zone de cellules positives à la GFP près du site d’injection.

Bien que certains TLS aient été plus avancés, s’étant élargis pour remplir la cavité péritonéale pour ces expériences, plus de 220 animaux ont été transplantés, ce qui peut être facilement accompli par une seule personne en quelques heures. L’analyse des données à l’aide du logiciel elda a montré qu’en moyenne, une cellule T sur 135 était composée de cellules leucémiques se propageant d’elles-mêmes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transplanter des cellules tumorales à limiter la dilution dans la cavité péritonéale du poisson-zèbre syngénétique, et comment utiliser les données résultantes pour déterminer la fréquence de propagation des cellules tumorales au sein d’une tumeur donnée.

D’autres études utilisant des animaux génétiquement modifiés pourraient aider à identifier les mécanismes régissant l’auto-renouvellement de ces cellules propagatrices de tumeurs.