Transplantation de tumeurs cérébrales pédiatriques de poisson zèbre dans des hôtes immunisés pour une étude à long terme du comportement des cellules tumorales et de la réponse aux médicaments

L’objectif global de cette procédure est de permettre une évaluation à long terme du comportement des cellules tumorales, telles que l’invasion et la dissémination, et de tester des thérapies potentielles chez un hôte animal immunocompétent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer du cerveau pédiatrique, y compris la longévité d’une réponse médicamenteuse et les mécanismes à l’origine de l’invasion et de la dissémination. Le principal avantage de cette technique est qu’elle minimise la toxicité pour l’hôte, ce qui permet une greffe durable de cellules tumorales et donc des études à long terme de la biologie du cancer du cerveau.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement du cancer du cerveau, car la charge tumorale peut être évaluée directement in vivo après un traitement médicamenteux. En général, les personnes novices dans cette méthode auront du mal si la suspension de cellules tumorales est trop concentrée ou trop diluée, ce qui rend difficile l’injection de quantités constantes dans le quatrième ventricule. Pour commencer, préparez une solution de 50 millilitres d’agarose à 1,2 % dissous dans de l’eau d’œuf.

Faites bouillir la solution jusqu’à ce que l’agarose se dissolve, puis complétez-la en ajoutant 05 milligrammes par litre de bleu de méthylène. Versez 25 millilitres de la solution finale dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et laissez-la se solidifier. Placez les 25 millilitres restants de solution d’agarose dans un bain-marie à 42 degrés Celsius.

Ensuite, placez un bécher de deux pouces de diamètre au centre de la surface solidifiée et versez les 25 millilitres restants d’agarose à 1,2 % sur la couche précédente. Maintenez la plaque d’injection à 28 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes avant l’injection ou à quatre degrés Celsius pour un stockage à long terme. Fabriquez les aiguilles à l’aide d’un extracteur d’aiguille pour tirer des capillaires de 10 centimètres d’une dimension extérieure de 1,2 millimètre et d’une dimension intérieure de 0,9 millimètre.

Placez délicatement l’aiguille sur une lame de microscope enveloppée d’un film plastique de paraffine. Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour couper l’extrémité de l’aiguille à un angle de 45 degrés pour créer une aiguille avec une ouverture à la pointe. Après avoir euthanasié un poisson porteur d’une tumeur cérébrale et disséqué la tumeur selon le protocole textuel, utilisez manuellement un P1000 pour perturber la masse tumorale jusqu’à ce qu’une solution uniforme et trouble se développe.

Utilisez une pipette ou une crépine de 40 microns pour éliminer les grosses particules. Ensuite, centrifugez la suspension à 290 fois g à température ambiante pendant cinq minutes et retirez le surnageant. Remettez en suspension la pastille de cellules tumorales dans 100 microlitres de PBS stérile et transférez-la dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Utilisez 250 microlitres de PBS pour diluer cinq microlitres de suspension cellulaire. Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules. Centrifuger la suspension à 290 fois g pendant trois minutes.

Après avoir retiré le surnageant, utilisez du PBS stérile pour remettre la pastille en suspension afin d’obtenir la concentration cellulaire souhaitée. Conservez la suspension tumorale sur un bloc de chaleur à 28 degrés Celsius pendant la procédure de transplantation. À l’aide d’une pipette de transfert, transférez 10 à 20 embryons anesthésiés vers la périphérie de la plaque d’injection.

Les embryons doivent tomber latéralement, avec les ventricules clairement visibles et accessibles. À l’aide d’une sonde inclinée, ajustez les embryons au besoin et éloignez-les du bord extérieur de la plaque d’injection. Ensuite, à l’aide d’un embout de chargement de gel, chargez un à deux microlitres de suspension de cellules tumorales dans l’aiguille d’injection, et insérez l’aiguille dans le manipulateur.

Ensuite, abaissez manuellement le manipulateur en tenant l’aiguille à un angle de 45 degrés. Ajustez les boutons du micromanipulateur dans les directions x, y et z jusqu’à ce que l’aiguille soit juste au-dessus et à environ cinq millimètres à droite de la tête de l’embryon. À l’aide d’un stéréomicroscope, ajustez lentement le micromanipulateur dans la direction x jusqu’à ce que l’aiguille perce le quatrième ventricule de l’embryon.

Ne laissez pas l’aiguille percer le cœur ou le jaune. Pour des injections cohérentes, les embryons doivent être anesthésiés, la tumeur doit être correctement dissociée en une suspension cellulaire et l’aiguille doit percer le quatrième ventricule mais ne pas s’étendre au-delà dans le cœur. Appuyez sur la pédale du micro-injecteur pour injecter la suspension des cellules tumorales.

Une fois l’injection terminée, utilisez de l’eau d’œuf fraîche pour rincer doucement les embryons injectés de la plaque d’injection et dans une boîte de Pétri. Maintenant, inspectez les embryons injectés sous un stéréomicroscope fluorescent dans une pièce sombre. Confirmez que la pression d’injection, l’angle, la taille de l’aiguille et la viscosité de la suspension cellulaire font que les cellules tumorales remplissent 25 à 50 % de l’espace ventricule.

Remettez les embryons dans l’incubateur à 28 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, évaluez la survie de l’embryon en examinant les caractéristiques morphologiques et physiologiques, telles que le développement normal du cœur et du cerveau, comme décrit précédemment. À l’aide d’une pipette de transfert, ajoutez 4 % de méthylcellulose au milieu d’une boîte de Pétri et ajoutez des embryons anesthésiés à la goutte de méthylcellulose.

Utilisez une sonde inclinée pour orienter les embryons et, sous le microscope à fluorescence, dépister une taille de greffe constante. Pour le maintien des tumeurs, une fois que les embryons atteignent huit jours après la fécondation, placez les embryons transplantés dans des réservoirs pour qu’ils se développent. Image et réalisation d’études complémentaires selon le protocole de texte.

Dans cette expérience, les cellules tumorales ectodermiques neurales primitives du système nerveux central ont été transplantées dans le mutant de poisson zèbre mitfa qui manque de mélanophores. Dès 24 heures après la transplantation, les cellules tumorales peuvent être observées envahissant les tissus cérébraux environnants. Les greffes tumorales continuent de croître dans le ventricule et les tissus cérébraux environnants au cours de la semaine suivante, et la fluorescence peut également être observée dans la région des reins.

Les cellules tumorales continuent de proliférer et d’envahir, de sorte que 28 jours après la fécondation, une masse tumorale peut être observée dans tout le cerveau du poisson-zèbre. Un groupe représentatif de poissons-zèbres transplantés avec des cellules tumorales cérébrales marquées au mCherry est illustré dans cette figure. La greffe de cellules tumorales est généralement réalisée chez 80 à 90 % des poissons-zèbres, et les greffes de tumeurs persistent jusqu’à l’âge adulte.

Dans cette expérience, un CNS-PNET de poisson-zèbre du tectum optique, marqué au NRAS et marqué à la mCherry, et un CNS-PNET marqué à la GFP du cervelet ont été récoltés par dissociation de la tumeur entière, transformés en une suspension unicellulaire, puis mélangés dans un rapport de un pour un avant la transplantation. Cet embryon représentatif qui a été imaginé quatre jours après la transplantation démontre que les cellules tumorales du tectum optique, en rouge, migrent plus largement dans le cerveau hôte que la tumeur cérébelleuse. Une fois maîtrisés, environ 300 embryons peuvent être injectés en trois à quatre heures.

À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires, telles que l’imagerie d’animaux vivants et l’administration de médicaments, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires liées à la biologie des cellules tumorales, à la réponse aux médicaments et à la chimiorésistance. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la modélisation du cancer du poisson-zèbre pour explorer de nouveaux inhibiteurs dans le traitement des cancers du cerveau pédiatriques.