Bromodésoxyuridine (BrdU) l'étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton

Les microbes contribuent à la dégradation de nombreux substrats de carbone organique dissous ou composés DOC, tels que Racine et les milieux aquatiques. Pour bien comprendre le rôle des microbes dans la transformation des DOC, l’identification simultanée de leur taxonomie et de leur fonction est nécessaire. Cette vidéo présente une procédure d’identification taxonomique des bactéries libres ou du plancton bactérien qui transforment des mares spécifiques de COD et des environnements aquatiques.

Des échantillons d’eau prélevés dans un environnement d’essai sont traités et incubés avec un composé d’intérêt et la bromo désoxyuridine, BRDU, qui s’incorpore dans l’ADN nouvellement synthétisé et les cellules en croissance active. Ensuite, les bactéries marquées BRDU plancton sont marquées avec des anticorps anti-BRDU conjugués ZI. Le plancton bactérien présentant des niveaux élevés de marquage BRDU est isolé par tri cellulaire activé par fluorescence.

L’ADN est ensuite extrait des cellules triées et l’identification taxonomique est effectuée sur la base des résultats de l’analyse du gène de l’ARN ribosomique 16 s basée sur la PCR. Bonjour, je m’appelle Steven Robbins du laboratoire du Dr Chen Mao au Département des sciences biologiques de l’Université d’État de Kent. Aujourd’hui, lu et moi allons vous montrer une méthode indépendante de la culture pour l’identification du plancton bactérien dégradant le DOC dans les environnements aquatiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les amendements nutritifs, suivis d’une analyse sur l’ADN de la communauté bactérienne, est qu’elle se concentre sur les bactéries hautement actives et exclut les cellules dormantes et à croissance lente. Nous montrons ici l’identification de bactéries plantain qui utilisent un composé DOC spécifique. Mais cette méthode peut également être appliquée pour étudier les bactéries planctoniques qui utilisent d’autres composés DOC uniques ou un groupe de DLC tels que les exsudats d’algues.

Prenons donc quelques échantillons d’eau et commençons. Avant de prélever des échantillons d’eau pour détecter la présence de planccton bactérien dégradant le DOC, les échantillons d’eau doivent être traités de manière appropriée. Les échantillons présentés ici ont été prélevés sur la côte de la Géorgie pour éliminer les grosses particules et les ERV de l’échantillon d’eau.

À l’aide d’une pompe péristaltique, l’eau de la tourie de collecte est transférée à une unité de filtration munie d’un filtre à pores d’un micromètre. Ensuite, transférez des aliquotes de 36 millilitres du filtrat dans trois tubes stériles en polypropylène de 50 millilitres. Chacun contenant quatre millilitres d’une solution d’aldéhyde paraforme à 10 % fraîchement préparée Incuber pendant deux heures à température ambiante pour préserver les cellules après l’incubation.

Versez l’eau dans la tour de filtration d’une unité de filtration sous vide en verre avec des filtres à membrane blanche de 0,22 micromètre et appliquez le vide pour aspirer la solution. Lavez le filtre en appliquant 10 millilitres de PBS à travers le filtre à vide. Étiquetez les filtres comme des commandes négatives et stockez-les à moins 20 degrés Celsius.

Pour établir un écosystème expérimental ou un microcosme, commencez par remplir six flacons en verre pré-rincés d’un litre avec 800 millilitres d’échantillon d’eau pré-filtrée. Ajouter BRDU à chaque microcosme jusqu’à une concentration finale de 10 micromolaires. Faites tourner rapidement le ballon à la main pour mélanger.

Chaque échantillon sera analysé et tripliqué. Donc, à trois des microcosmes, ajoutez le composé DOC modèle. Ici, la reine est ajoutée aux microcosmes à une concentration finale de 100 nanomolaires.

Ensuite, aux trois autres microcosmes, ajoutez le PBS stérile. Ceux-ci serviront de contrôles non DOC et placeront tous les microcosmes dans un incubateur à secousses de 100 tr/min dans l’obscurité à la température in situ, qui est de 25 degrés Celsius. Ici, aux points de temps de 0, 8, 16 et 24 heures.

Prélevez 36 millilitres de chaque microcosme dans un tube stérile en polypropylène de 50 millilitres contenant quatre millilitres d’aldéhyde paraforme frais à 10 % et incubez pendant deux heures à température ambiante pour fixer les cellules. Ensuite, filtrez les cellules préservées à travers des filtres à membrane blanche de 0,22 micromètre. Appliquez 10 millilitres de PBS à travers le filtre à vide pour éliminer les résidus de PFA.

Procéder immédiatement à l’immunodétection INS situ ou stocker les filtres à moins 20 degrés Celsius pour tester l’incorporation de BRDU dans le plancton bactérien. Commencez par jeter les filtres à échantillon à température ambiante pour compromettre la paroi cellulaire bactérienne. Placez le filtre sur une unité de filtration, puis pipetez un millilitre de solution de lysozyme sur le filtre pour couvrir les cellules et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Après l’incubation, appliquez un vide pour retirer la solution. Une fois que la solution passe à travers le filtre, lavez les cellules en ajoutant 10 millilitres de PBS et appliquez un vide. Ensuite, pour compromettre davantage la paroi cellulaire, ajoutez un millilitre de solution de protéinase K au filtre pour couvrir les cellules.

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Laver avec du PBS pour produire de l’ADN à strate unique. Ajoutez un millilitre de solution d’exonucléase pour couvrir les cellules du filtre.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, lavez le filtre en passant 10 millilitres de PBS à travers le filtre à vide. Ensuite, coupez les bords du filtre pour supprimer la partie qui n’a pas de cellules.

Ensuite, sur une surface sèche nettoyée à l’alcool, utilisez une lame stérile pour couper le filtre en huit morceaux de taille égale. Huit chambres d’incubation à joint de cadre sont nécessaires pour chaque échantillon, placez un huitième du filtre dans la chambre d’incubation à joint de cadre assemblé, côté échantillon vers le haut. Une fois les chambres assemblées, utilisez le kit de prolifération cellulaire Roche Intu pour détecter in situ les cellules marquées A-B-R-D-U.

Une fois les procédures debout terminées, retirez la section du filtre de la chambre d’incubation et placez-la sur une surface stérile à l’aide d’une lame stérile, coupez la section du filtre en petits morceaux. Transférez les morceaux de filtre dans un microtube à centrifuger de deux millilitres contenant un millilitre de PBS, fermez hermétiquement le tube et fermez-le avec du paraform. Ensuite, incubez le tube dans un incubateur à agitation à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant 10 minutes.

Après l’incubation, fixez le tube et faites-le tourbillonner à la vitesse maximale. Pendant cinq minutes, pipetez le NATANT SUP dans un tube stérile en polypropylène de 15 millilitres. Ensuite, suspendez à nouveau le filtre dans le PBS et répétez les étapes de vortex et d’incubation deux fois de plus, en ajoutant le snat dans le même tube de 15 millilitres pour chaque échantillon.

Stockez les cellules remises en suspension à quatre degrés Celsius. L’échantillon doit être analysé par télécopieur dans les deux jours. Enfin, triez les cellules pour obtenir la population avec un niveau élevé d’incorporation de BRDU.

Ici, un cytomètre de flux de zone BD fax et le logiciel correspondant sont utilisés. Une fois les cellules triées, la population enrichie en BRDU peut être analysée pour déterminer son identité taxonomique. Pour amplifier les 16 gènes de l’ARN ribosomique des types de PCR de filtre bactérien effectuées, pipetez les cellules triées sur un filtre à membrane en polycarbonate blanc de 0,22 pore et allumez la pompe à vide à l’aide d’une lame stérile coupant les bords libres de cellules du filtre.

Coupez le filtre en quatre morceaux de taille égale pour chaque condition, placez un seul morceau de filtre dans chacun des trois tubes de réaction PCR avec les cellules tournées vers l’intérieur du tube. Ajouter 45 microlitres d’eau de qualité PCR. Laissez la section du filtre s’immerger complètement dans l’eau.

Ensuite, ajoutez deux billes PCR Roche illustra pure T ready to go brièvement vortex pour aider à dissoudre les billes. Ajoutez ensuite deux microlitres de ribosomal avant et 16 s en marche arrière. amorces du gène de l’ARN.

Ajoutez soit un microlitre de BSA pour aider à absorber les inhibiteurs d’amplification, soit un microlitre d’eau. Effectuer une amplification PCR sur un thermocycleur. Il est recommandé d’appliquer un programme de PCR d’atterrissage, qui fait en sorte que la température à genoux de 62 à 52 degrés Celsius diminue séquentiellement de 62 à 52 degrés Celsius d’un degré Celsius par cycle, suivie de 15 cycles à 52 degrés Celsius.

Confirmez l’amplification de la PCR par électrophorèse sur un C de gel Agros coloré au bromure 1 %, excisez les amplicons de PCR du gel et nettoyez avec un kit d’extraction rapide de gel KaiGen cayo. Après la purification du gel PCR, rassemblez les amplicons du même échantillon. Les amplicons d’ADN ribosomique 16 s purifiés sont maintenant prêts pour un certain nombre d’analyses moléculaires.

Des échantillons ont été prélevés sur un site côtier de la Géorgie et traités pour étudier la dégradation de la bactérie Racine en suivant les procédures décrites dans cette vidéo. La racine est un composé polyamoureux que l’on trouve partout dans les environnements marins. Il peut servir de source de nutriments et d’énergie pour les bactéries marines, comme le montre ici.

L’analyse des faits des échantillons a révélé qu’après une incubation de 24 heures, un groupe de bactéries avec un niveau plus élevé d’intensité de fluorescence FXI, qui était positivement lié à l’étendue de l’incorporation de BRDU, a été développé dans les microcosmes amendés de Racine. Ces cellules ont été désignées comme des cellules à forte incorporation de BRDU ou HI et devaient contenir principalement des bactéries dégradant Racine. Non salut.

Des cellules ont été trouvées dans les témoins sans ajout, qui ne contenaient que des cellules présentant des niveaux plus faibles d’incorporation de BRDU, appelées cellules li, devaient contenir principalement du plancton bactérien qui n’était pas en mesure d’utiliser. Les cellules Racine HI ajoutées ont été triées dans des tubes séparés, puis collectées sur des filtres à membrane. Des amplicons partiels de 16 gènes de l’ARN ribosomique ont été obtenus après PCR par filtre et confirmés par électrophorèse sur gel.

Après le filtrage de tri, l’amplification PCR des gènes fonctionnels peut également être effectuée pour examiner la diversité fonctionnelle entre les cellules triées. Nous venons de vous montrer comment séparer et identifier physiquement les cellules bactériennes fonctionnelles dans l’environnement aquatique à l’aide d’une approche qui associe le tri cellulaire activé par fluorescence et l’incorporation de BRDU. N’oubliez pas que BIDU est une terre de tête, une blouse de laboratoire et un glos doivent toujours être portés lors de l’exécution de cette procédure.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.