Name: Bromodésoxyuridine (BrdU) létiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Découvrez l'étiquetage au BrdU et le tri cellulaire par fluorescence pour identifier les bactéries planctoniques dégradant le carbone organique dissous. Cette méthode permet d'isoler les cellules activement en croissance et d'étudier leur taxonomie.

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Le financement de ce projet a été fournie par la National Science Foundation accorde OCE1029607 (XM) et MCB0702125 (au MAM) et la Gordon and Betty Moore Foundation (au MAM).

1. Traitement des échantillons d'eau <ol><li> Filtrer l'eau 10L de l'environnement grâce à une membrane filtrante à pores um de taille pour enlever les grosses particules et bacteriovores. Recueillir le filtrat de l'eau dans une bonbonne. </li><li> Transfert de 36 ml de chaque filtrat dans 3 tubes Eppendorf stériles (50 ml) contenant 4 ml solution fraîchement préparée de paraformaldéhyde (PFA; 10%). Incuber pendant 2 heures à température ambiante pour préserver les cellules. Recueillir cellules sur 0,22 um de-la taille des pores des filtres à membrane blanche par filtration sous vide. Lavez le filtre en faisant passer 10 ml de tampon phosphate salin (PBS) à travers le filtre par filtration sous vide. Étiqueter les filtres de contrôles négatifs et de les stocker à -20 ° C. </li></ol> Étapes 1.3 à 1.4 sont facultatives pour établir DOC-limitée conditions. <ol start="3"><li> Ajouter un mélange d'azote et de phosphore inorganiques (5 uM NH 4 Cl, 5 uM NaNO 3, et 1 uM NaH 2 PO 4 de concentration finale) dans la tourie. </li><li> Incuber dans l'obscurité à température in situ pendant 48 heures avec agitation occasionnelle. </li></ol> 2. Microcosme création et l'incubation <ol><li> Remplissez chacune des six flacons de verre de 1 L avec 800 ml d'eau de l'échantillon de la bonbonne de l'étape 1.4 pour établir des microcosmes. Ajouter BrdU (10 uM, concentration finale) de chaque microcosme. Mélangez bien. </li><li> Ajouter 1 ml de modèle composé solution DOC dans trois des microcosmes, ces servira modifications DOC. Ajouter 1 ml de PBS stérile dans les trois restantes microcosmes, ces servira sans plus de contrôle. </li><li> Incuber tous les microcosmes dans un agitateur incubateur et incuber dans l'obscurité à température in situ tout en agitant à 100 rpm. </li><li> Recueillir 36 ml d'échantillon d'eau de chaque microcosme et transférer dans des tubes de 50 ml Eppendorf stériles à des points de temps de 0, 8, 16 et 24 heures. Immédiatement ajouter 4 ml de frais PFA (10%) pour des tubes de prélèvement et incuber pendant 2 heures à température ambiante pour préserver les cellules. </li><li> Filtre préservé cellules par 0,22 um-la taille des pores des filtres à membrane en polycarbonate. Laver les filtres avec 10 ml de PBS. Procéder immédiatement à l'étape suivante ou stocker les filtres à -20 ° C. </li></ol> 3. En immunodétection in situ pour l'incorporation de BrdU <ol><li> Décongeler les filtres (échantillons DOC modifiée, sans plus de contrôle et les contrôles négatifs) à température ambiante. </li><li> Appliquer 1 ml de solution de lysozyme [10 mg / ml de lysozyme de blanc d'œuf dans 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4 pour couvrir les cellules bactériennes sur le filtre. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Lavez le filtre en faisant passer 10 ml de PBS à travers elle sous aspiration. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de protéinase K [2 mg / ml de protéinase K dans 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4 pour couvrir les cellules bactériennes sur le filtre. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Lavez le filtre en faisant passer 10 ml de PBS à travers elle sous aspiration. </li><li> Ajouter une solution de exonucléase ml [exonucléase III (50 U / ml) dans 5 mM de MgCl2 et 50 mM Tris-HCl] 5 pour couvrir les cellules bactériennes sur le filtre. Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes. Lavez le filtre en faisant passer 10 ml de PBS à travers elle sous aspiration. </li><li> Assemblez chambres d'incubation cadre joint (Bio-Rad) selon les instructions du fabricant. </li><li> Trancher le filtre en huitièmes à l'aide d'une lame stérile sur une consommation d'alcool nettoyé la surface sèche. </li><li> En utilisant des pinces, placer une huitième section d'un filtre dans une chambre d'incubation assemblés cadre joint (huit cadres joint chambres sont nécessaires pour chaque échantillon de filtre). Le côté de la section de filtre qui contient des cellules doit faire face à la hausse. L'humidité à l'arrière du filtre permet le bâton de filtre à la diapositive. Si le filtre devient sèche, appliquer une petite goutte (2 pi) du dih 2 O dans le centre de la chambre avant de placer la section du filtre sur la diapositive. </li></ol> Étapes 03.08 à 03.20 utilisent les réactifs de la ROCHE En Kit prolifération cellulaire in situ, fluos en suivant les procédures de modification des instructions du fabricant. Sauf pour PBS, tous les réactifs sont fournis dans le kit. <ol start="8"><li> Appliquer suffisamment de tampon d'incubation (0,5% d'albumine sérique bovine, 0,1% de Tween 20 dans du PBS), pour bien couvrir toute la section de filtre dans la chambre d'incubation sans causer de débordement fois le sceau est appliqué. </li><li> Placez un couvercle en polyester cadre sur le cadre de la chambre d'incubation. Appuyez pour bien sceller la chambre d'incubation. Eviter les bulles d'air au-dessus du filtre. Incuber les chambres scellées pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité. </li><li> Retirer le joint de polyester et d'ouvrir des chambres d'incubation. (Remarque: l'ouverture des chambres, parfois se tirer vers le haut le sceau cadre de la diapositive Dans ce cas, de préparer une nouvelle chambre pour les étapes suivantes..) </li><li> Pipeter le tampon d'incubation d'un coin de la chambre. Eviter le contact avec le filtre. </li><li> Lavez le filtre en douceur de pipetage 100 ul de PBS dans ethors de la chambre 3 fois. </li><li> Préparer anti-BrdU-fluos solution de travail en suivant les étapes recommandées par le fabricant immédiatement avant utilisation. </li><li> Pipeter 120 pi anti-BrdU-fluos solution de travail sur le filtre, en prenant soin de façon uniforme couvrir toute la surface. </li><li> Refermer la chambre avec une housse de polyester neuf. Eviter les bulles d'air sur le dessus du filtre. Incuber la chambre dans l'obscurité à 37 ° C pendant 3 heures. Cette étape sera l'étiquette BrdU incorporé l'ADN in situ avec de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC). </li><li> Retirez le couvercle en polyester et d'ouvrir la chambre d'incubation. Pipeter la solution anti-BrdU-fluos de travail. Lavez le filtre 3 fois avec du PBS. </li><li> Transférer le filtre de la chambre d'incubation d'une surface stérile. Trancher la section filtre en petits morceaux à l'aide d'une lame stérile. </li><li> Transférer les morceaux de filtre en 2 microtubes ml, contenant chacun 1 ml de PBS. Étroitement hermétiquement le tube et le joint avec du parafilm. Incuber à 37 ° C et 200 rpm pendant 10 min. </li><li> Fixez les tubes sur un Vortexer et le vortex à la vitesse maximale pendant 5 minutes. Déposer le surnageant dans un tube stérile de 15 ml Eppendorf. Répétez les étapes d'incubation et de vortex pour 5 fois plus. Combinez le surnageant dans le même tube de 15 ml Eppendorf pour chaque échantillon. Typiquement, 80% de cellules peuvent être récupérés dans la suspension. </li><li> Stocker le surnageant de cellules en suspension à 4 ° C. Trier dans les 2 jours. </li></ol> 4. Analyse FACS Une procédure pour un cytomètre de flux BD FACSAria et du logiciel correspondant est décrit ici. <ol><li> Optimiser le réglage du débit étapes suivantes cytomètre recommandé par le fabricant. Cela implique: le réglage du contrôle d'amplification de définir les paramètres requis et breakoff le sweet spot, optimisation du délai laser et zone de facteurs d'échelle pour la pression de la gaine expérimenter et optimiser les réglages pour le FSC et SSC tensions, seuil FSC, FSC de fluorescence d'échelle, la fluorescence tensions PMT , etc </li><li> Exécuter des échantillons de contrôle négatif sur le cytomètre en flux (FCM) en fonction de l'intensité de fluorescence du FITC et dispersent de côté (SSC). Augmenter le seuil FITC jusqu'au pas de cellules dans les contrôles négatifs peuvent être visualisés par l'affichage d'acquisition FITC-SSC. </li><li> Exécuter des échantillons de contrôle sans plus et d'examiner le mode de distribution de 10 000 cellules en fonction de FITC et l'acquisition de la SSC. Définir une porte pour enfermer toutes les cellules et de les désigner comme des «cellules de basse intensité» (LIS). </li><li> Exécuter DOC-amendé échantillons et d'examiner le modèle de distribution de 10.000 cellules basées sur FITC et SSC. Certaines cellules apparaissent dans la grille prédéfinie LI. Définir une autre porte pour enfermer les cellules qui ont une plus grande intensité de fluorescence (HIS) que Lis. Acquérir les statistiques pour voir l'abondance relative des cellules fermée. </li><li> Trier les cellules dans des tubes HI collection contenant 500 ul de PBS à «purifier 1 goutte" mode. Terminez le tri lorsque le nombre de ses atteint 500 000 chefs d'accusation. </li></ol> 5. Filtre amplification par PCR des gènes ARNr 16S Filtre les procédures de PCR sont modifiées de Kirchman et al. 6 <ol><li> Filtre cellules triées sur un blanc, 0,22 um-pores de taille, 25 mm de diamètre, membrane en polycarbonate filtre. Coupez le bord du filtre qui ne contient pas de cellules bactériennes en utilisant une lame stérile. Trancher le filtre en 8 morceaux égaux de taille. </li><li> Placez un seul morceau de filtre dans un tube de réaction PCR, avec les cellules vers l'intérieur du tube. Ajouter de l'eau 45 ul de grade PCR dans le tube de réaction PCR. Plonger le filtre entièrement dans l'eau. </li><li> Ajouter 2 ROCHE illustra PuReTaq Read-To-Go Perles PCR dans le tube de réaction PCR, brièvement au vortex. Ajouter 2 ul de chacune des avant et arrière du gène ARNr 16S amorces (0,4 uM concentration finale pour chaque amorce), tels que 27F et 1492R 7, dans chacun des tubes de réaction PCR. </li><li> (Facultatif) Ajoutez 1 microlitre bovins solution de sérum albumine (BSA, la concentration finale est 30μg/100 ul) au mélange réactionnel de PCR pour aider à l'amplification des inhibiteurs de s'adsorber. Si l'on choisit de ne pas ajouter de BSA, ajouter 1 microlitre d'eau à la place. </li><li> Effectuer l'amplification par PCR sur un cycleur thermique. Une touche bas programme de PCR est recommandée, qui a la température de recuit séquentielle diminuant de 62 à 52 ° C par 1 ° C par cycle de 11 cycles, suivie par 15 cycles avec une température de recuit de 52 ° C. Tous les cycles comprennent dénaturant (à 95 ° C), le recuit (à 62 à 52 ° C), et l'extension (à 72 ° C) les étapes d'une durée de 50 ans. Un initiale de 3 min de dénaturation et dernière étape d'extension de 10 min est également inclus dans le programme de PCR. </li><li> Confirmer l'amplification par PCR par électrophorèse sur un bromure d'éthidium teinté gel à 1% d'agarose. Accise amplicons PCR à partir du gel et de nettoyer avec le kit QIAGEN QIAquick gel extraction. </li><li> Effectuer deux autres amplifications PCR pour chaque échantillon, chaque fois que l'utilisation d'une nouvelle section de filtre. Après un gel de PCR Purificatile, la piscine des amplicons du même échantillon ensemble. Purifié 16S ADNr amplicons sont maintenant prêtes pour un certain nombre d'analyses moléculaires qui permettent l'identification taxinomique, tels que la construction de bibliothèques clone et le séquençage. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Les résultats représentatifs sont décrits à l'aide d'une étude de putrescine bactéries dégradant comme un exemple. Des échantillons d'eau ont été recueillies à partir d'un site côtier de la Géorgie et traitées suivant les procédures décrites ci-dessus. Analyse FACS a révélé que plus de putrescine induit le développement d'un groupe de bactéries à haute intensité de fluorescence FITC, indiquant un taux élevé de l'incorporation de BrdU (Figure 1). Ces cellules ont été désignés comme étant à haut BrdU l'incorporation des cellules (HIS) et devaient contiennent principalement putrescine bactéries dégradant. HIS sont manquants dans les commandes sans plus, qui ne contenait que des cellules avec des niveaux inférieurs de l'incorporation de BrdU (LIS). Lis ont été s'attend à ce que contiennent principalement bactérioplancton ont été incapables d'utiliser la putrescine ajouté. HIS sont triés dans des tubes séparés et ensuite recueillis sur des filtres à membrane. Amplicons du gène 16S ARNr ont été obtenus pour les cellules en utilisant un filtre haute HI PCR. <img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Cytométrie de flux sans plus de contrôle et de modèle composé modifiée (putrescine comme un exemple ici) échantillons prélevés après 24 h d'incubation. Analyse de la distribution cellulaire a été basée sur (1) l'intensité de fluorescence du FITC étiquetage (axe x), ce qui est positivement liée au niveau d'incorporation de BrdU, et (2) la diffusion latérale (SSC, axe des y), ce qui est positivement liée à la cellule taille. Notations Gate est basée sur le niveau d'incorporation de BrdU, (HI, haute-BrdU constitution; LI, faible BrdU constitution). Le pourcentage relatif de cellules HI et LI sont présentés dans les portes correspondantes.

<ol><li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li>
<li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li>
<li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li>
<li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li>
<li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+%28BrdU%29+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+%28Exo+III%29+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li>
<li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li>
<li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+stains%3A+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li>
<li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li>
<li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li>
<li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li>
<li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Notre approche de couples BrdU constitution, FACS et 16S ADNr pour permettre l&#39;analyse des espèces au niveau d&#39;identification du bactérioplancton qui métabolisent les composants individuels du DOC dans les milieux aquatiques. Le dosage de l&#39;incorporation de BrdU étiquettes des cellules bactériennes en fonction des activités métaboliques, ce qui permet l&#39;analyse uniquement sur les bactéries actives et ne comprennent donc pas des cellules dormantes. Dans notre approche, l&#39;incorporation de BrdU est ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Tapez </td><td> Société </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> B5002-5G </td><td></td></tr><tr><td> Le lysozyme </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> L6876-5G </td><td></td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> P2308-25MG </td><td></td></tr><tr><td> In Situ prolifération cellulaire Kit, fluos </td><td> Kit </td><td> Roche </td><td> 11810740001 </td><td> Consommer plus de l&#39;Anti-BrdU-fluos et le tampon d&#39;incubation par réaction que suggéré par le fabricant. </td></tr><tr><td> Chambres d&#39;incubation Cadre-Seal </td><td> Matériau </td><td> Bio-Rad </td><td> FSL-1201 </td><td></td></tr><tr><td> Polycarbonate filtres à membranes (142 mm de diamètre, 1,0 um-la taille des pores) </td><td> Matériau </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> Filtres à membrane en polycarbonate (25 mm de diamètre, de 0,2 um-la taille des pores) </td><td> Matériau </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Perles </td><td> Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick gel extraction kit </td><td> Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> FailSafe PCR System </td><td> Kit </td><td> EPICENTRE </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodésoxyuridine (brdu) l&#39;étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Les microbes sont les principaux agents de médiation de la dégradation de nombreuses carbone organique dissous (DOC) des substrats dans les milieux aquatiques. Toutefois, l&#39;identification des taxons bactériens qui transforment les piscines spécifiques de COD dans la nature pose un défi technique. Nous décrivons ici une approche qui couple bromodésoxyuridine (BrdU) l&#39;incorporation, tri cellulaire par fluorescence (FACS), et ARNr 16S basée sur l&#39;analyse moléculaire qui permet l&#39;identification indépendante de la culture du bactérioplancton capables de dégrader un composé DOC spécifiques dans les milieux aquatiques. Microcosmes bactérioplancton en triple sont mis en place pour recevoir les deux BrdU et un composé modèle de DOC (DOC amendements), ou seulement BrdU (sans ajout de contrôle). Substituts BrdU les positions de la thymidine dans l&#39;ADN bactérien nouvellement synthétisé et BrdU marqué l&#39;ADN peut être facilement immunodétectée 1,2. Grâce à une incubation de 24 h, bactérioplancton qui sont capables d&#39;utiliser le composé ajouté DOC devraient être activés sélectivement, et ont donc des niveaux plus élevés d&#39;incorporation de BrdU (cellules HI) que les non-réactive les cellules dans les modifications du DOC et les cellules dans un no- Outre les contrôles (faible incorporation de BrdU cellules, les cellules LI). Après immunodétection de fluorescence, les cellules HI sont distingués et physiquement séparé des cellules LI par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 3. Tri DOC-réactive (cellules HI) sont extraits de l&#39;ADN et taxinomique identifiés par 16S ARNr ultérieure basée sur des analyses, y compris la PCR, la construction de bibliothèques clone et le séquençage.

Bactérioplancton environnement sont incubés avec un modèle de carbone organique dissous (DOC) composé et un réactif de marquage de l&#39;ADN, bromodésoxyuridine (BrdU). Ensuite, DOC-dégradants cellules sont séparées de la communauté en vrac en fonction de leur incorporation de BrdU élevée en utilisant la fluorescence tri cellulaire (FACS). Ces cellules sont ensuite identifiés par des analyses moléculaires ultérieures.

Bromodésoxyuridine (BrdU) l&#39;étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton

Les microbes sont des agents majeurs médiant la dégradation de nombreux substrats de carbone organique dissous (COD) dans les environnements aquatiques. Cependant, l'identification...

Les micro-organismes interviennent dans la dégradation de nombreuses substances de carbone organique dissous ou composés C.O.D., comme dans les environnements racinaires et aquatiques. Pour comprendre pleinement le rôle des micro-organismes dans la transformation du C.O.D., une identification simultanée de leur taxonomie et de leur fonction est nécessaire. Cette vidéo présente une procédure permettant l'identification taxonomique de bactéries libres ou de plancton bactérien qui transforment des réserves spécifiques de C.O.D. et d'environnements aquatiques.Des échantillons d'eau prélevés dans un environnement test sont traités et incubés avec un composé d'intérêt et du bromodésoxyuridine (BRDU), qui s'incorpore dans l'ADN nouvellement synthétisé et dans les cellules en croissance active. Ensuite, le plancton bactérien marqué au BRDU est révélé à l'aide d'anticorps anti-BRDU conjugués au fluorochrome ZI. Le plancton bactérien présentant des taux élevés de marquage au BRDU est isolé par tri cellulaire activé par fluorescence.L'ADN est ensuite extrait des cellules triées et l'identification taxonomique est réalisée à partir des résultats d'une analyse du gène de l'ARN ribosomique 16 S par PCR. Bonjour, je m'appelle Steven Robbins du laboratoire du Dr Chen Mao du Département des sciences biologiques de l'Université d'État de Kent. Aujourd'hui, lu et moi allons vous présenter une méthode indépendante de culture pour l'identification des bactéries planctoniques dégradant le DOC dans les environnements aquatiques.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les amendements nutritifs suivis d'une analyse de l'ADN des communautés bactériennes, est qu'elle concentre l'analyse sur les bactéries très actives tout en excluant les cellules dormantes et celles à croissance lente. Nous montrons ici l'identification de bactéries associées à la banane plantain qui utilisent un composé spécifique de la matière organique dissoute (DOC). Toutefois, cette méthode peut également être appliquée à l'étude du plancton bactérien utilisant un autre composé unique de DOC ou un groupe de composés organiques dissous, tels que les exsudats algales.Alors, prélevons quelques échantillons d'eau et commençons. Avant de tester les échantillons d'eau pour les bactéries planctoniques dégradant le DOC, ces échantillons doivent être correctement traités. Les échantillons présentés ici ont été collectés au large de la côte de Géorgie afin d'éliminer les grandes particules et les ER VRE de l'échantillon d'eau.Utilisez une pompe péristaltique pour transférer l'eau du fût de collecte vers une unité de filtration équipée d'un filtre de taille de pore d'un micromètre. Ensuite, transférez des aliquotes de 36 millilitres du filtrat dans trois tubes stériles en polypropylène de 50 millilitres. Chaque tube contenant quatre millilitres de solution fraîchement préparée de paraformaldéhyde à 10 %. Incubez pendant deux heures à température ambiante afin de préserver les cellules après l'incubation.Verser l'eau dans la tour de filtration d'une unité de filtration sous vide en verre équipée de filtres membranaires blancs de 0,22 micromètre de diamètre de pore et appliquer le vide pour faire passer la solution à travers. Rincer le filtre en faisant passer 10 millilitres de PBS à travers le filtre sous vide. Étiqueter les filtres comme témoins négatifs et les conserver à moins 20 degrés Celsius.Pour mettre en place un écosystème expérimental ou un microcosme, commencez par remplir six flacons en verre d’un litre, préalablement rincés, avec 800 millilitres de l’échantillon d’eau préfiltré. Ajoutez du BRDU à chaque microcosme afin d’obtenir une concentration finale de 10 micromolaire. Tournez rapidement le flacon à la main pour homogénéiser. Chaque échantillon sera analysé en triplicat. Ainsi, ajoutez le composé modèle de DOC à trois des microcosmes. Ici, la reine est ajoutée aux microcosmes à une concentration finale de 100 nanomolaire.Ensuite, ajouter du PBS stérile aux trois autres microcosmes. Ceux-ci serviront de témoins sans DOC. Placer tous les microcosmes dans un incubateur agité à 100 tr/min, à l'obscurité et à la température in situ, soit 25 degrés Celsius. Effectuer les prélèvements aux points temporels de 0, 8, 16 et 24 heures.Prélevez 36 millilitres de chaque microcosme dans un tube stérile en polypropylène de 50 millilitres contenant quatre millilitres de paraformaldéhyde frais à 10 %, puis incubez pendant deux heures à température ambiante pour fixer les cellules. Ensuite, filtrez les cellules fixées à travers des membranes blanches de 0,22 micromètre de diamètre de pore. Appliquez 10 millilitres de PBS à travers le filtre sous vide pour éliminer les résidus de PFA.Procédez immédiatement à la détection immuno in situ INS ou conservez les filtres à moins 20 degrés Celsius pour doser l'incorporation de BRDU dans le plancton bactérien. Commencez par placer les filtres d'échantillons à température ambiante afin d'altérer la paroi cellulaire bactérienne. Placez le filtre sur un dispositif de filtration, puis ajoutez un millilitre de solution de lysozyme sur le filtre afin de recouvrir les cellules et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.Après l'incubation, appliquez un vide pour éliminer la solution. Une fois que la solution a traversé le filtre, lavez les cellules en ajoutant 10 millilitres de PBS et appliquez un vide. Ensuite, pour affaiblir davantage la paroi cellulaire, ajoutez un millilitre de solution de protéinase K sur le filtre afin de recouvrir les cellules.Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Laver avec du PBS pour produire de l'ADN en simple brin. Ajouter un millilitre de solution d'exonucléase pour recouvrir les cellules sur le filtre.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l'incubation, laver le filtre en faisant passer 10 millilitres de PBS à travers le filtre sous vide. Ensuite, découper les bords du filtre pour éliminer la partie qui ne contient pas de cellules.Ensuite, sur une surface sèche nettoyée à l’alcool, utilisez une lame stérile pour découper le filtre en huit morceaux de taille égale. Huit chambres d'incubation à joint de cadre sont nécessaires pour chaque échantillon ; placez un huitième du filtre dans chaque chambre d'incubation à joint de cadre assemblée, côté échantillon vers le haut. Une fois les chambres assemblées, utilisez le fluide du kit de prolifération cellulaire Roche Intu pour détecter in situ les cellules marquées A-B-R-D-U.Une fois les procédures habituelles terminées, retirez la section du filtre de la chambre d'incubation et placez-la sur une surface stérile. À l’aide d’un scalpel stérile, découpez la section du filtre en petits morceaux. Transférez les morceaux de filtre dans un tube microcentrifuge de deux millilitres contenant un millilitre de PBS, refermez hermétiquement le tube et scellez-le avec du parafilm. Incubez ensuite le tube dans un incubateur agité à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant 10 minutes.Après l'incubation, fixez fermement le tube et agitez-le au vortex à vitesse maximale. Pendant cinq minutes, prélevez le surnageant SUP à l’aide d’une pipette et transférez-le dans un tube stérile en polypropylène de 15 millilitres. Resuspendez ensuite le filtre dans le PBS et répétez les étapes de vortex et d’incubation deux fois supplémentaires, en ajoutant à chaque fois le surnageant au même tube de 15 millilitres pour chaque échantillon.Conserver les cellules en suspension à quatre degrés Celsius. L’échantillon doit être analysé par cytométrie en flux dans les deux jours. Enfin, trier les cellules afin d’obtenir la population présentant un niveau élevé d’incorporation de BRDU.Ici, un cytomètre de flux à zone BD FACS et le logiciel correspondant sont utilisés. Une fois les cellules triées, la population enrichie en BrdU peut être analysée afin d'en déterminer l'identité taxonomique. Pour amplifier les gènes de l'ARN ribosomique 16 S de diverses bactéries, des PCR sur filtre sont réalisées : pipetez les cellules triées sur un filtre en membrane de polycarbonate blanc de 0,22 µm de taille de pore, puis mettez en marche la pompe à vide et, à l’aide d’une lame stérile, découpez les bords du filtre dépourvus de cellules.Divisez le filtre en quatre morceaux de taille égale pour chaque condition, puis placez un seul morceau de filtre dans chacun des trois tubes de réaction PCR, côté cellules tourné vers l'intérieur du tube. Ajoutez 45 microlitres d'eau de qualité PCR. Laissez le morceau de filtre s'immerger complètement dans l'eau.Ensuite, ajoutez deux pastilles Roche illustra pure T ready to go PCR et vortexez brièvement pour aider à dissoudre les pastilles. Puis ajoutez deux microlitres de chacun des amorces 16 s ARNr, sens et antisens.Ajouter soit un microlitre de BSA pour aider à absorber les inhibiteurs d'amplification, soit un microlitre d'eau. Réaliser l'amplification PCR sur un thermocycleur. Un programme PCR en dégression de température est recommandé, avec une température d'hybridation qui diminue séquentiellement de 62 à 52 degrés Celsius d'un degré Celsius par cycle, suivi de 15 cycles à 52 degrés Celsius.Confirmer l'amplification par PCR par électrophorèse sur des gels d'agarose à 1 % colorés au bromure d'éthidium, exciser les amplicons PCR à partir du gel et les purifier à l'aide d'un kit d'extraction rapide de gels KaiGen cayo. Après la purification sur gel PCR, regrouper les amplicons du même échantillon. Les amplicons d'ADN ribosomique 16 s purifiés sont désormais prêts pour diverses analyses moléculaires.Des échantillons ont été prélevés sur un site côtier de Géorgie et traités afin d'étudier les bactéries dégradant la racine selon les procédures décrites dans cette vidéo. La racine est un composé polyamore qui peut être omniprésent dans les environnements marins. Elle peut servir de source de nutriments et d'énergie pour les bactéries marines, comme illustré ici.L'analyse FACTS des échantillons a révélé qu'après une incubation de 24 heures, un groupe de bactéries présentant un niveau plus élevé d'intensité de fluorescence FXI, corrélée positivement au degré d'incorporation de BRDU, s'était développé dans les microcosmes amendés avec Racine. Ces cellules ont été désignées comme des cellules à forte incorporation de BRDU ou HI et devaient contenir principalement des bactéries dégradant Racine. Pas de hi.Des cellules ont été observées dans les témoins sans ajout, qui ne contenaient que des cellules présentant des taux plus faibles d'incorporation de BRDU, appelées cellules lii, censées principalement contenir du plancton bactérien incapable d'utiliser. Les cellules Racine HI ajoutées ont été triées dans des tubes séparés, puis collectées sur des filtres membranaires. Des amplicons partiels du gène ARN ribosomique 16S ont été obtenus après PCR sur filtre et confirmés par électrophorèse sur gel.Après le tri par filtration, une amplification par PCR des gènes fonctionnels peut également être réalisée afin d'examiner la diversité fonctionnelle parmi les cellules triées. Nous venons de vous montrer comment séparer physiquement et identifier des cellules bactériennes fonctionnelles dans un environnement aquatique, en combinant le tri cellulaire activé par fluorescence et l'incorporation de BRDU. N'oubliez pas que le port d'une blouse de laboratoire, d'une blouse protectrice et de gants est obligatoire lors de la réalisation de cette procédure.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Droplet plates-formes basées microfluidiques sont des candidats prometteurs pour l'expérimentation à haut débit car ils sont capables de générer picolitres, auto-compartimentées vaisseaux moindre coût aux cadences kHz. Grâce à l'intégration rapide, sensible et haute résolution de fluorescence des méthodes spectroscopiques, les grandes quantités de données générées au sein de ces systèmes peut être efficacement extraite, exploité et utilisé.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

Suivi des changements subtils dans la progression et la cinétique des étapes du cycle cellulaire peut être accompli par l'utilisation d'une combinaison de marquage métabolique des acides nucléiques avec BrdU et totale coloration de l'ADN génomique par l'iodure de propidium. Cette méthode évite la nécessité de la synchronisation chimique des cellules de cyclisme, empêchant ainsi l'introduction de dommages à l'ADN non-spécifique, ce qui affecte à son tour la progression du cycle cellulaire.

Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

Procédé pour l'analyse quantitative de la réplication du chromosome de synchronisation est décrit. La méthode utilise l'incorporation de BrdU en combinaison avec...

Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

La vidéo décrit le test de marquage par impulsions par étapes de cellules de mammifères avec de la bromodéoxyuridine (BrdU) pour mesurer la prolifération cellulaire. L’absorption de BrdU permet le suivi temporel des cellules qui étaient en phase de synthèse à un moment précis, sans qu’il soit nécessaire de synchroniser les cellules.

Dosage du marquage pulsé de la bromodéoxyuridine : une technique pour mesurer la prolifération cellulaire

Cette vidéo décrit le protocole de coloration par immunofluorescence BrdU. La technique permet d’identifier les cellules dans différentes phases du cycle cellulaire. L’ajout de colorants d’ADN et le marquage des anticorps permettent une analyse détaillée du devenir des cellules de la phase S à des moments ultérieurs.

Coloration par immunofluorescence BrdU : une technique pour identifier les cellules dans différentes phases du cycle cellulaire

Ce protocole décrit l'utilisation de bromodésoxyuridine (BrdU) absorption pour permettre le suivi temporel des cellules qui étaient en phase S à un moment précis dans le temps. Addition de colorants d'ADN et de l'étiquetage d'anticorps facilite l'analyse détaillée du sort des cellules en phase S au temps plus tard.

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

Présenté ici est un protocole pour une seule cellule, l'épifluorescence technique basée sur la microscopie pour quantifier les taux de pâturage chez les eucaryotes prédateurs aquatiques avec une haute précision et une résolution taxonomique.

Bactéries étiquetées fluorescentes comme traceur pour révéler de nouvelles voies de flux de carbone organique dans les écosystèmes aquatiques

Ce protocole présente un test rapide de sensibilité aux antimicrobiens (AST) en 2,5 heures par imagerie de diffusion Raman stimulée par une cellule unique du métabolisme D2O. Cette méthode s’applique aux bactéries dans l’urine ou l’environnement sanguin total, ce qui est transformateur pour l’AST phénotypique rapide à cellule unique en clinique.

Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

Dans le présent protocole, nous montrons comment visualiser la résection de l’extrémité double brin de l’ADN pendant la phase S/G2 du cycle cellulaire à l’aide d’une méthode basée sur l’immunofluorescence.

Évaluation de la résection finale globale de l’ADN double brin à l’aide du marquage BrdU-ADN couplé à l’imagerie de discrimination du cycle cellulaire

Nous présentons ici une méthode basée sur la cytométrie en flux pour la visualisation et la quantification de plusieurs marqueurs associés à la sénescence dans des cellules individuelles.

Imagerie simultanée et détection par cytométrie en flux de plusieurs marqueurs de sénescence fluorescents dans les cellules cancéreuses sénescentes induites par le traitement

Découvrez l'étiquetage au BrdU et le tri cellulaire par fluorescence pour identifier les bactéries planctoniques dégradant le carbone organique dissous. Cette méthode permet d'isoler les cellules activement en croissance et d'étudier leur taxonomie.

Bromodésoxyuridine (BrdU) létiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton (Vidéo) | JoVE Journal

Bromodésoxyuridine (BrdU) l'étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton

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