Améliorer 2D et 3D Skin In vitro Modèles utilisant macromoléculaire Crowding

L’objectif global de cette procédure est d’améliorer le dépôt de matrice extracellulaire et d’améliorer les modèles de peau 2D et 3D actuels en utilisant l’encombrement macromoléculaire. L’encombrement améliore la génération de matrices dérivées de cellules et de cultures organotypiques matures dans un laps de temps condensé. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire, car elle offre des moyens améliorés de générer des matrices extracellulaires dérivées de cellules pour la bio-ingénierie de la peau et d’autres tissus.

Le principal avantage de cette technique est que des matrices dérivées de cellules et des constructions cutanées organotypiques peuvent être générées dans un laps de temps considérablement condensé lors de l’application d’un encombrement macromoléculaire à ces cultures. La technique de microscopie à réflexion interférentielle vous permet de visualiser le dépôt total de la matrice extracellulaire sans avoir besoin de coloration par anticorps. Les applications de ces techniques s’étendront de l’étude du dépôt de matrice extracellulaire par les cellules cutanées à l’amélioration des thérapies des plaies, en particulier avec la génération de meilleurs équivalents cutanés et la culture tissulaire pour la greffe.

Pour commencer, ensemencez 50 000 fibroblastes primaires, kératinocytes primaires, ou une co-culture des deux, dans un millilitre de milieu pro well, dans les puits d’une plaque de 24 puits. Laissez les cellules adhérer dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Ensuite, jetez l’ancien milieu et remplacez-le par un millilitre de milieu frais contenant des crowders macromoléculaires et de l’acide ascorbique 100 micromolaires.

Incuber les cultures pendant six jours, en changeant de milieu tous les deux jours. Effectuer l’immunofluorescence et le Western blot selon le protocole textuel. Pour fabriquer et utiliser une matrice dérivée de cellules, après avoir cultivé les cellules pendant six jours avec des crowders moléculaires et de l’acide ascorbique comme nous venons de le démontrer, décellularisez les couches cellulaires pour obtenir une matrice dérivée de cellules en utilisant d’abord 1X PBS pour laver les couches cellulaires deux fois.

Aspirez le PBS, puis ajoutez 250 microlitres de désoxycholate de sodium à 0,5 % et incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Aspirez le lysat cellulaire, puis ajoutez 250 microlitres supplémentaires de désoxycholate de sodium à 0,5 % et répétez l’incubation et l’aspiration de 10 minutes deux fois de plus. Utilisez de l’eau distillée pour laver deux fois la matrice dérivée de la cellule.

Aspirez l’eau, puis ajoutez 1X PBS. Conservez la matrice à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Pour préparer une suspension cellulaire secondaire, aspirez le PBS de la matrice et ensemencez 50 000 kératinocytes sur le tapis F par exemple.

Laissez les cellules adhérer pendant la nuit. Pour réaliser la microscopie à réflexion interférentielle, ou RIM, sur une matrice dérivée d’une cellule, effectuez l’acquisition d’images à l’aide d’un microscope confocal selon le protocole texte. Pour couler un gel de collagène avec des fibroblastes encapsulés dans un insert de culture cellulaire, aliquote 10 millilitres de collagène de queue de rat de type un dans un bécher froid.

Ajoutez un millilitre de DMEM froid et 0,5 millilitre d’hydroxyde de sodium molaire pour neutraliser le collagène acide. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de suspension de fibroblastes. À l’aide d’une pipette froide, répartissez uniformément les 12 millilitres de solution dans des inserts de culture cellulaire dans une plaque de culture à six puits.

Incuber le gel à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Une fois que le gel s’est solidifié, immergez-le dans un milieu de fibroblastes ou FM. Ensuite, après l’avoir incubé pendant 24 heures, aspirez le FM. Utilisez quatre millilitres de milieu frais contenant des crowders macromoléculaires pour remplacer l’ancien FM en ajoutant deux millilitres à l’intérieur de l’insert de culture cellulaire et deux millilitres à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire. Après une incubation de 24 heures, utilisez un agent de triche à 0,125 % de trypsine pour trysoniser les kératinocytes.

Tapotez doucement les côtés de la fiole pour déloger les cellules et ajoutez un milieu contenant du sérum pour neutraliser la trypsine. Après avoir compté les cellules, préparez une suspension de kératinocytes. Ensuite, aspirez le milieu des inserts de culture cellulaire et ajoutez les kératinocytes sur le dessus du gel.

Incuber le gel pendant une heure. Une fois que les kératinocytes se sont fixés à la surface du gel, utilisez deux millilitres de KSFM ou de milieu sans sérum CTN-57 pour immerger la cellule à l’intérieur de l’insert de culture en gel et ajoutez deux millilitres de FM à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire. Après une incubation de 24 heures, jetez l’ancien milieu et remplacez-le par un milieu frais contenant des encombrements macromoléculaires.

Après sept jours dans la culture immergée, pour élever la culture à une interface air-liquide, transférez l’insert de culture dans une plaque à puits profond. Ajoutez 10 millilitres de milieu de stratification à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire, en gardant l’intérieur de l’insert sec. Enfin, incubez les cultures et changez de milieu tous les trois jours pendant 14 jours.

Récoltez-les et traitez-les selon le protocole texte. Comme le montre ici, l’encombrement macromoléculaire a permis aux fibroblastes de déposer plus de matrice extracellulaire ou ECM par rapport aux cultures témoins. Lors de la sécularisation, il était évident que les fibroblastes étaient les principaux dépositaires du collagène un, du collagène quatre et de la fibronectine.

Cette figure démontre que ce sont les fibroblastes plutôt que les kératinocytes qui étaient les principaux déposants du collagène sept, et c’est le premier rapport de dépôt réussi de collagène sept in vitro. À l’aide de RIM, l’étendue complète de la matrice dérivée de la cellule a été capturée. Une superposition de l’image RIM avec coloration des anticorps montre la quantité relative de ce composant ECM par rapport à la quantité totale d’ECM.

Dans un modèle de peau 3D in vitro, l’encombrement macromoléculaire ou MMC a raccourci le temps de culture de cinq semaines à trois semaines, afin d’obtenir une co-culture de peau organotypique mature. Comme on le voit ici, par coloration H et E, à trois semaines, la culture avec MMC consistait en un épiderme pleuristrifié et un derme stromol. De plus, une immunocoloration intense et continue du collagène sept a été détectée à la jonction derrière-épidermique des cultures cellulaires encombrées, par rapport à une immunocoloration faible et irrégulière du collagène sept dans les cultures témoins.

La microscopie électronique à transmission montre également la présence de fibrilles d’ancrage dans les cultures organotypiques générées par MMC, montrant le collagène fonctionnel sept. Les matrices dérivées de cellules pourraient être utilisées à des fins d’ensemencement de cellules secondaires comme échafaudage alternatif car la complexité de la matrice extracellulaire est maintenue et elle est produite par les cellules elles-mêmes. Les cultures de peau organotypiques, qui sont générées sous encombrement macromoléculaire, pourraient être utilisées comme modèle de peau 3D amélioré car elles contiennent un derme de crête stromale, une jonction dermectorale majeure et un épiderme pleuristratif.

Des cultures organotypiques, ou équivalentes à la peau, générées avec des crowders macromoléculaires, peuvent également être utilisées pour la greffe de peau car elles ont une jonction dermalépidermique mieux développée, ce qui est susceptible d’améliorer le succès de la greffe. En plus du dépôt amélioré de matrice extracellulaire, l’encombrement macromoléculaire peut être appliqué à d’autres systèmes in vitro pour améliorer les réactions avec des vitesses limitées, sans avoir à augmenter la quantité de réactifs. Par exemple, les réactions en chaîne par polymérase.