Analyses de la population de cellules pendant la carcinogenèse cutanée

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer des analyses de population cellulaire dans le modèle murin de carcinomes basocellulaires du cancer de la peau. Ceci est accompli en induisant d’abord l’expression des gènes cibles chez la souris. Dans un deuxième temps, l’épiderme est isolé de la peau de la souris.

Après avoir généré une suspension unicellulaire, les cellules épidermiques sont marquées avec des marqueurs de service cellulaire spécifiques. En fin de compte, les changements de population cellulaire au cours du développement tumoral dans la peau peuvent être surveillés par analyse cytométrique en flux. Le développement du cancer est un processus impliquant de nombreux types de cellules.

L’objectif de cette procédure est d’aider les chercheurs à étudier comment différentes cellules contribuent au développement du cancer de la peau. Cette méthode peut donner un aperçu des interactions cellulaires pendant le développement du cancer de la peau, mais peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le cancer du pancréas. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il est difficile de déterminer quand l’expérience doit être terminée sans évaluation visuelle.

Pour commencer, les souris Ma Keratin 14 Cree ER appelées souris K 14 avec les souris Rosa 26 contenant le gène mutant lissé SMU M deux marqué YFP appelé SMU M deux, appelé SMU. Souris. Ensuite, immergez des échantillons de queue de 0,5 centimètre de long récoltés sur des souris doubles positives âgées de trois à six semaines dans une solution de lyse de queue PCR directe avec un milligramme par millilitre de protéinase K. Ensuite, incubez les échantillons pendant la nuit à 55 degrés Celsius en secouant. Le lendemain, faites tourner le tissu à toute vitesse dans une micro-centrifugeuse pour éliminer les débris.

Ensuite, pour génotyper chaque animal, utilisez un microlitre de SNAT de chaque spécimen dans des réactions PCR individuelles avec les amorces et les conditions recommandées par le fournisseur. Utilisez une aiguille d’alimentation incurvée de calibre 20 pour administrer du tamoxifène aux animaux. Double positif pour K 14 C er, et ROSA 26 par gavage oral pendant cinq jours consécutifs pour induire l’expression de OO M two dans les kératinocytes.

En général, les phénotypes sont plus sévères sur l’oreille et la queue des souris K 14 OO marquées à la GFP pour récolter la peau pour l’analyse cellulaire. Tout d’abord, utilisez un tremblement pour retirer la fourrure de l’animal euthanasié. Retirez ensuite la peau de la souris et plongez le tissu dans une solution disbe à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures.

Après le traitement dispa, utilisez une paire de pinces pour séparer l’épiderme du derme. Utilisez maintenant une paire de ciseaux pour émincer l’épiderme. Ensuite, plongez le tissu dans une solution de collagénase quatre pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius dans un tube de 50 millilitres.

Tourner doucement le tube toutes les 20 minutes pour dissocier les cellules. Utilisez un microscope pour confirmer la dissociation cellulaire lorsque des cellules uniques peuvent être détectées dans le milieu de collagénase. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes supplémentaires pour augmenter le rendement cellulaire.

Ensuite, filtrez le mélange de tissus à travers une passoire de cellules de 70 microns et lavez les cellules pendant 10 minutes à 500 fois G et à température ambiante pour étiqueter les cellules en commençant par réhydrater, en suspendant la pastille fraîchement lavée dans du PBS complété par 10 % FBS à 2,5 fois 10 des six cellules par millilitre. Ensuite, placez la solution cellulaire sur de la glace pendant 30 minutes pour bloquer toute liaison non spécifique. Ensuite, transférez les aliquotes des cellules dans des microtubes de 1,5 millilitre pour un marquage spécifique des anticorps.

Ajouter les anticorps dans chaque tube à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre. Faites tourbillonner doucement les tubes pendant plusieurs secondes pour mélanger les anticorps avec les cellules, puis replacez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes supplémentaires. Après avoir lavé les tubes dans un millilitre de PBS, remettez les granulés en suspension dans du PBS, puis ajoutez du DPI à une concentration finale d’un milligramme par millilitre.

Lors de l’analyse des données, sélectionnez d’abord des cellules uniques en fonction du graphique de dispersion directe par rapport au graphique de diffusion latérale, à l’exclusion des cellules mortes positives DABI. Les souris ne développent pas de carcinome basocellulaire, sauf lorsque la signalisation Hedgehog est activée, comme on le voit sur ces images. L’expression induite par le tamoxifène de l’oncogène lisse M two YFP entraîne un phénotype cutané qui est apparent même au niveau anatomique de croissance dans les échantillons de peau colorés h et e de ces animaux.

Des tumeurs cutanées peuvent être observées chez les souris K 14 SMU. Sans induction de SMU M deux YFP, la peau de l’animal n’a pas montré de morphologie anormale par h et e. La coloration de ces diagrammes à points montre une analyse représentative des cellules myéloïdes chez les souris normales et porteuses de tumeurs.

Les cellules CD 11 B positives GR one positives sont dérivées de cellules myéloïdes, dont certaines sont des cellules suppressives dérivées de myéloïdes chez des souris normales et non induites par M M deux YFP. La population cellulaire positive de CD 11 B GR one est à peine détectable, mais augmente en réponse à l’inflammation ou au développement tumeur. Chez les souris K 14 SMU.

L’expression induite de smu, M, deux, YFP et kératinocytes dans la peau entraîne une augmentation de la population cellulaire positive de CD 11 B GR un. Cette technique permettra aux chercheurs dans le domaine de la biologie de la peau d’effectuer une analyse moléculaire du carcinome à cellules B chez la souris.