Essai de superposition des protéines membranaires: Un protocole pour tester l'interaction entre les protéines solubles et insolubles In vitro

Test des protéines. L’interaction protéique est indispensable pour la dissection de la fonctionnalité protéique. Cette vidéo présente un test in vitro de liaison aux protéines pour tester l’interaction entre une protéine membranaire et une protéine immobilisée avec une protéine soluble.

Tout d’abord, les protéines de fusion sont clonées, exprimées et extraites. La protéine insoluble marquée est immobilisée sur la membrane de nitrocellulose et traitée pour être repliée jusqu’à sa confirmation native. La membrane est ensuite sondée avec des protéines solubles marquées et un immuno-transfert est effectué pour détecter les protéines.

Si les protéines marquées interagissent, elles sont capturées par la protéine immobilisée sur la membrane, et le signal de l’immuno-transfert sera observé. Ainsi, ce test fournit une méthode fiable pour tester l’interaction entre une protéine insoluble et une protéine en solution. Le principal avantage de cette technique par rapport aux vaisseaux existants comme GST pull down, est que vous pouvez évaluer de manière fiable la liaison entre les protéines insolubles et les protéines solubles in vitro.

La première étape de cette procédure consiste à générer des protéines génétiquement marquées pour la détection. Commencez par cloner la protéine qui sera immobilisée sur la membrane. Se référer ici sous le nom de pro Im pour protéine immobilisée dans un vecteur d’expression, codant une grande balise telle que GST, le vecteur d’expression vide, qui code uniquement pour que la balise sera utilisée comme un contrôle négatif de protéine immobilisée, et est appelé pro IM nc.

Ensuite, clonez la protéine qui sera utilisée comme sonde soluble dans un vecteur d’expression, en codant une étiquette différente telle que le streptocoque deux. On l’appellera prosol pour protéine soluble en tant que contrôle négatif, clone, protéine soluble de contrôle négatif dans le même vecteur d’expression. On l’appellera Prosol NC pour le contrôle négatif des protéines solubles.

Ensuite, utilisez un système d’expression protéique tel qu’un coli ou un virus balo pour exprimer les protéines marquées. Le système d’expression utilisé doit être soigneusement choisi en fonction de la nécessité de modifications post-traductionnelles. Extraire les protéines exprimées de l’organisme de votre choix. Pour pro IM et pro I mnc Resus.

Suspendez les cellules dans le tampon de chargement de la page SDS contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Ensuite, faites bouillir les cellules pendant cinq minutes, puis centrifugez-les pour éliminer le précipité afin d’extraire le Prosol et le Prosol NC. Utilisez des procédures standard. Le pro IMS peut être extrait dans des conditions de dénaturation car les protéines seront repliées après avoir été immobilisées dans la membrane de nitrocellulose.

Cependant, le prosol doit être extrait pour donner une confirmation native car il sera ajouté au tampon de liaison une fois que les protéines marquées auront été extraites. Déterminez la concentration des protéines recombinantes à l’aide d’une méthode standard telle que le kit de dosage des protéines BioRad. Si c’est un extrait brut plutôt que des protéines purifiées qui seront utilisés pour le dosage.

Estimer la concentration de la protéine d’intérêt par balayage densitométrique de la bande correspondante sur un gel de poly acrylamide SDS coloré au kumasi. En utilisant les concentrations connues de BSA comme référence. Ensuite, tracez la courbe standard en fonction des intensités de signal mesurées par la densitométrie à balayage de la BSA et calculez la quantité de protéines contenue dans l’extrait brut.

L’étape suivante de la procédure consiste à immobiliser pro Iam et pro IAM NC sur la membrane. Commencez par charger un microgramme, chacun des extraits pro Iam et pro IAM NC en double sur un gel de poly acrylamide SDS. Après l’électrophorèse, retirez le gel des plaques de verre et placez-le dans 100 millilitres de tampon de transfert, puis incubez en agitant doucement pendant 20 minutes à température ambiante.

Après l’incubation, effectuez un western blot pour transférer les protéines dans une membrane de nitrocellulose après le transfert afin de permettre aux protéines liées à la membrane de se replier. Placez la membrane dans 15 millilitres de tampon A et incubez-la en agitant doucement. Pour éliminer les résidus de SDS, incubez pendant 15 minutes à température ambiante en agitant doucement.

Après l’incubation, retirez soigneusement la membrane du tampon. Placez ensuite la membrane dans 25 millilitres de tampon de dénaturation. Incuber pendant deux heures à température ambiante avec une légère agitation.

Pendant l’incubation, la membrane de nitrocellulose deviendra opaque. Ensuite, à l’aide d’une pince, transférez la membrane dans 25 millilitres de TBS et incubez en agitant doucement pendant cinq minutes. Au cours de cette étape, la membrane retrouve sa couleur blanche d’origine.

Ensuite, transférez la membrane dans 25 millilitres de tampon de liaison. Incuber à quatre degrés Celsius en agitant doucement pendant la nuit. Ensuite, la protéine soluble sera utilisée pour sonder la membrane à la recherche de la protéine immobilisée.

Tout d’abord, préparez les tampons d’hybridation en diluant un à 10 microgrammes de prosol et de prosol NC dans des tubes séparés contenant 10 millilitres de tampon de liaison frais. Transférez ensuite le tampon dans un sac d’hybridation. Ensuite, coupez la membrane en deux bandes, toutes deux contenant pro IM et pro IAM nc.

Ces membranes seront placées dans le tampon d’hybridation. Transférez chaque membrane dans la solution d’hybridation de prosol ou de prosol NC et incubez pendant 1,5 heure à température ambiante avec une agitation douce. Retirer les membranes des solutions d’hybridation et rincer trois fois pendant 15 minutes dans du TBS.

Pour visualiser les interactions protéine-protéine, bloquez la membrane avec 2,5 % de lait écrémé dans du TBST pendant une heure. Après l’incubation, placez les membranes bloquées dans la solution d’anticorps primaire. Ici, l’anticorps polyclonal de lapin antis streptocoque deux est utilisé.

Incuber pendant une heure à température ambiante avec une légère agitation après l’incubation. Rincez les membranes dans 20 millilitres de TBST pendant 15 minutes et deux fois pendant cinq minutes à température ambiante en agitant doucement. Ensuite, placez les membranes dans la solution d’anticorps secondaires conjugués HRP Ici, un anticorps IgG anti lapin conjugué à HRP est utilisé.

Incuber pendant une heure à température ambiante avec une agitation douce. Rincez les membranes dans 20 millilitres de TBST pendant 15 minutes et deux fois pendant cinq minutes à température ambiante avec une agitation douce comme avant, après le rinçage final dans le TBS, visualisez l’interaction protéique protéine à l’aide d’un substrat chimiluminescent HRP ici Millipore. Im Molan Cémiluminescent de l’Ouest.

Le substrat HRP est utilisé après immuno-transfert du prosol. Rincez la membrane et le TBST pendant 15 minutes et deux fois pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, sondez à nouveau les membranes avec l’anticorps primaire pour que le marqueur pro.

Je suis suivi par l’anticorps secondaire approprié. Visualisez PRO I et pro Im NNC en détectant la chimiluminescence pour valider l’identité des bandes obtenues dans le test de recouvrement de membrane protéique. L’interaction entre les protéines A et K et YFP et MP CYFP a été évaluée dans les cellules épidermiques du tabac à l’aide de la méthode décrite dans cette vidéo, comme montré ici.

Lorsque la complémentation de la fluorescence biomoléculaire a été évaluée, un signal YFP fort a été reconstruit. Ce signal BFC s’est accumulé à Punta à la périphérie cellulaire, ce qui est diagnostique du plasma car MP est une protéine hautement insoluble. Lorsqu’il est exprimé chez des bactéries ou dans des plantes, le test de recouvrement de membranes protéiques a été adopté pour valider cette interaction.

Des extraits protéiques in vitro contenant un microgramme de GST MP ou de GST non fusionné ont été résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS suivie d’un électrotransfert sur une membrane de nitrocellulose. Lorsque ces proiams ont été sondés avec un streptocoque soluble nnk deux GST mp, mais non fusionné, GST a montré une liaison. De plus, lorsque le même ensemble de pro IMS a été sondé avec un streptocoque deux marqué par une protéine nano nc IE Arabidopsis cytoplasmique non apparentée, aucune liaison n’a été observée, démontrant davantage la spécificité de l’interaction A NK MP Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de remplir correctement les protéines immobilisées en suivant le protocole présenté.