Immunomarquage à l’or des coupes exosomiques : une technique pour visualiser les marqueurs diagnostiques dans la lumière exosomale

Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires renfermant une variété de biomolécules qui servent de biomarqueurs du cancer.

Pour visualiser les biomarqueurs exosomaux, commencez par des coupes exosomiques ultraminces intégrées dans de la résine soutenues par des grilles métalliques de microscopie électronique appropriées. Incuber les grilles dans des gouttes de glycine. La glycine se lie et neutralise les groupes aldéhydes réactifs dans les sections pour surmonter leur interférence avec le dosage.

Rincez l’échantillon à l’eau pour éliminer les réactifs résiduels. Ensuite, incubez l’échantillon dans un tampon de blocage. Le tampon porte des protéines sériques qui bloquent les sites de liaison des anticorps non spécifiques dans l’échantillon.

Ensuite, incubez l’échantillon dans la solution d’anticorps primaire souhaitée. Ces anticorps reconnaissent et se lient à leurs biomarqueurs cibles localisés dans la lumière exosomale. Lavez tous les anticorps non liés avec un tampon approprié.

Maintenant, transférez les grilles portant l’échantillon dans des gouttes contenant des anticorps secondaires conjugués à l’or qui se fixent aux anticorps primaires. Les nanoparticules d’or servent de marqueurs denses en électrons pour visualiser la localisation fine des molécules cibles. Lavez tous les anticorps secondaires non liés avec un tampon approprié.

Enfin, dans des conditions sombres, incubez les grilles séquentiellement dans des solutions d’acétate d’uranyle et de citrate de plomb. Ces réactifs de métaux lourds colorent et améliorent le contraste des molécules organiques telles que les lipides, les protéines et les glycogènes dans l’échantillon, ce qui les différencie de l’arrière-plan.

Observez les sections colorées au microscope électronique à transmission. Les biomarqueurs marqués à l’or apparaissent sous forme de particules sombres dans la lumière des structures d’exosomes colorées par des métaux lourds.

Pour commencer, incubez des grilles contenant des sections non colorées de 60 nanomètres d’épaisseur en gouttes de 50 microlitres de glycine 0,02 M pendant 10 minutes pour éteindre les groupes aldéhydes libres. Ensuite, rincez les sections dans 100 microlitres d’eau distillée trois fois pendant 10 minutes chacune. Après le dernier rinçage, incuber les sections pendant 1 heure à température ambiante dans du PBS contenant 1 % de BSA. Ensuite, incubez les grilles en gouttes de 50 à 100 microlitres d’un anticorps anti-KRS pendant 1 heure.

Ensuite, lavez les grilles cinq fois pendant 10 minutes chacune dans une goutte de PBS contenant 0,1 % de BSA. Ensuite, transférez les grilles dans une goutte d’un anticorps secondaire approprié et incubez les sections pendant 1 heure à température ambiante. Maintenant, lavez les grilles cinq fois pendant 10 minutes chacune avec une goutte séparée de PBS contenant 0,1 % de BSA. Colorez deux fois les sections avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 20 minutes dans l’obscurité, puis avec du citrate de plomb de Reynold pendant 10 minutes. Placez la section colorée dans un microscope électronique à transmission et visualisez l’échantillon à l’aide de 80 kV et imagez-les à l’aide du logiciel du microscope.

• Exosomes - Small extracellular vesicles enclosing cancer biomarkers.
• Glycine - A compound used to bind and neutralize reactive aldehyde groups.
• Blocking Buffer - A solution containing serum proteins that block non-specific antibody binding sites.
• Primary Antibody - A protein that recognizes and binds to target biomarkers in the exosomal lumen.
• Secondary Antibodies - Proteins tagged with gold-nanoparticles used to visualize primary antibodies.

• Introduce Exosomes - Definition and importance in cancer diagnosis (e.g., exosomes).
• Outline Glycine's Role - Its function in stabilizing exosomal structures (e.g., glycine).
• Explain Blocking Buffer - Serum proteins preventing unwanted reactions (e.g., blocking buffer).
• Educate on Antibody Tagging - Importance in visualizing exosomal biomarkers.

• What are exosomes and how do they serve as cancer biomarkers?
• What is the role of glycine in visualizing exosomal biomarkers?
• Why is a blocking buffer used in this process?

• Practical Application - Exosomes as diagnostic tools in cancer studies (e.g., exosome detection).
• Industry Impact - Enhancement of diagnostic accuracy in healthcare (e.g., cancer diagnostics).
• Societal Importance - Improving early detection and treatment strategies (e.g., personalized medicine).
• Scientific Advancements - Advancements in biomarker detection techniques.