Name: Une méthode innovante pour Exosome Quantification et Taille Mesure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse d'exosomes par nanoparticle tracking analysis (NTA) semi-automatisée. Cette technique permet la quantification et la mesure de taille des vésicules extracellularires isolées du sang humain.

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Les auteurs tiennent à remercier Christina Ballázs, Hug Aubin et Jörn Hülsmann pour la lecture critique du manuscrit et leur excellente assistance rédactionnelle. De plus, les auteurs remercient Gisela Mueller pour l’assistance technique. Les auteurs remercient Particle Metrix GmbH d’avoir fourni les fonds couvrant les frais de publication.

REMARQUE: Les expériences présentées dans cet ouvrage ont été approuvés par le comité d&#39;éthique institutionnel de l&#39;Université de Düsseldorf. 1. Préparation Exosome <ol><li> Prélever le sang entier dans trois tubes de citrate par ponction veineuse (total de 9 ml). Verser le sang dans un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 1 500 xg pendant 20 min à 4 ° C pour initier la séparation des cellules du plasma. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml de faucon. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 2800 g pendant 20 min à 4 ° C pour éliminer toutes les cellules du plasma (plasma acellulaire; PCP). Transférer la PCP à des tubes d&#39;ultracentrifugation, 1 ml par tube. </li><li> Centrifuger à 100 000 xg pendant 90 min à 4 ° C à épuiser exosomes. Retirer 900 pi de surnageant. Remettre en suspension le culot dans 100 pl les restant dans le tube d&#39;ultracentrifugation. Ajouter 900 ul de PBS. </li><li> Centrifuger à nouveau 100 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Retirer 900 pi de supernatant. Re-suspendre le culot avec les 100 pi restants. </li><li> Transfert 5-20 ul de remise en suspension dans 40 ml d&#39;eau distillée. Filtrer la suspension à travers un filtre de 450 nm à séparer exosomes de particules plus grosses. Utilisez cette suspension finale pour la mesure des particules. </li></ol> 2. Procédure de démarrage de l&#39;instrument de suivi des particules <ol><li> Lancez le programme en double-cliquant sur l&#39;icône du logiciel-. Cliquez sur les différents onglets de logiciels (&quot;Cell Check&quot;, &quot;Mesure&quot;, &quot;Analyse&quot;) pour basculer entre eux à travers le protocole. </li><li> Suivez les instructions à l&#39;écran pour une mise en oeuvre automatique de la procédure de démarrage. Cochez les cases à la fois pour le contrôle de qualité de la cellule et de l&#39;alignement automatique. NOTE: Chacune de ces étapes peuvent être répétées séparément si nécessaire par le bouton (A) ou (B) en appuyant sur l&#39;onglet &quot;contrôle de cellule&quot;. </li><li> Ouvrez l&#39;entrée et l&#39;orifice de sortie de l&#39;instrument NTA et injecter 10 ml d&#39;eau distillée avec une seringue dans le canal de la cellule à travers l&#39;orifice d&#39;entrée. Fermer l&#39;orifice de sortie comme la dernière quantité d&#39;eau est injectée. Placer un récipient sous l&#39;orifice de sortie pour recueillir la solution de déchets. Se assurer que la cellule de mesure est exempte de bulles d&#39;air et ne pas seringue bulles d&#39;air dans le système. Fermez immédiatement l&#39;orifice d&#39;entrée. </li><li> Effectuer le contrôle de la qualité de la cellule en cliquant sur &quot;OK&quot;. Le logiciel affiche les résultats de la qualité de cellule après quelques secondes. </li><li> Si les particules sont encore visualisées sur l&#39;écran Live View du logiciel ou si le résultat du contrôle de la qualité ne est bon ou mauvais, répétez l&#39;étape 2.3 jusqu&#39;à ce que les particules restantes sont retirés de la cellule de mesure. Répéter aussi l&#39;étape 2.3 après chaque mesure pour éviter l&#39;accumulation de particules. Si répéter l&#39;injection d&#39;eau distillée et le contrôle de la cellule ne produit pas un «bon» résultat, passez à 2,9. </li><li> Préparer une suspension uniforme de contrôle contenant 200 nm de taille polystyrene particules à être utilisés pour aligner les foyers du laser et microscope. Ajouter une goutte de la suspension concentrée, fournie par le fabricant de l&#39;instrument, à 500 ml d&#39;eau distillée pour obtenir la concentration requise de telle sorte que 600 ± 100 particules par écran sont affichées en temps réel dans la carte. </li><li> Injecter la suspension d&#39;alignement dans l&#39;instrument NTA comme décrit dans l&#39;étape 2.3. Appuyez sur &quot;OK&quot; pour démarrer l&#39;alignement automatique, une routine automatisée à travers lequel le système va automatiquement trouver la position optimale des deux foyers. </li><li> Quand un message apparaît indiquant que le système est maintenant prêt pour des expériences, cliquez sur OK pour démarrer la mesure. </li><li> Occasionnellement, nettoyer le canal de la cellule entre les expériences manuellement par rinçage de la cellule avec une solution à 30% d&#39;éthanol. Nettoyez le canal chaque fois que le logiciel affiche un rapport d&#39;erreur automatique. </li></ol> 3. Mesure de l&#39;échantillon <ol><li> Rincer le canal avec de l&#39;eau distillée avant eamesure de l&#39;échantillon ch (comme décrit à l&#39;étape 2.3). </li><li> Injecter la suspension de exosomes (préparé dans la section 1) pour le canal, comme décrit dans l&#39;étape 2.3. </li><li> Ajustez les principaux paramètres suivants dans le logiciel selon vos besoins: <ol><li> Sensibilité. Afin de trouver la plage de sensibilité optimale, cliquez sur le bouton &quot;nombre de particules par rapport Sensibilité&quot; pour afficher une courbe pour les particules mesurées par écran pour les différents niveaux de sensibilité. Choisir un niveau de sensibilité avant de la pente maximale de la courbe. Un niveau de sensibilité plus élevée permet la visualisation de petites particules plus mais augmente également les questions liées au bruit de fond. </li><li> Luminosité minimale. Choisissez un éclat de départ de 20 pour la mesure de exosome utiliser cette fonction comme un filtre. Réglementer ce paramètre jusqu&#39;à particules fortement la lumière de diffusion sur vierges. Réglementer le bas pour amplifier faiblement diffusant artefacts. Varier la luminosité au besoin tout au long de l&#39;expérience. NOTE: Les particules qui légersScatter trop fortement chevaucher et peuvent être exclues de l&#39;analyse par erreur. </li><li> Min et Max Taille. Définissez un filtre numérique pour éliminer le bruit de pixel et la dispersion indésirable de particules surdimensionnées en régulant la taille minimum et maximum. Utilisez une gamme de 10 à 500 pixels pour la mesure des exosomes. </li><li> Shutter. Régler la période de temps pendant laquelle l&#39;appareil est ouvert à 1/300 sec. </li></ol></li><li> Vivez paramètres lus: <ol><li> Basculer entre un appareil photo numérique et une vue modus analogique à tout moment en cliquant sur le bouton &quot;Live-image&quot;. </li><li> Tout au long de l&#39;expérience, surveiller la barre d&#39;intensité de diffusion, qui indique l&#39;état de saturation de l&#39;échantillon en tant qu&#39;indicateur de couleur codé. Ne pas analyser les exosomes si la barre de diffusion est rouge. Dans ce cas, diluer l&#39;échantillon afin d&#39;éviter ce phénomène. Si la condition expérimentale interdit une manipulation de la suspension de l&#39;échantillon, réguler à la baisse de la sensibilité ou de réguler à la hausse la luminosité dans le logiciel-settings pour améliorer les résultats de mesure. REMARQUE: Lorsque les échantillons avec une concentration extrêmement élevée de particules sont analysés la dispersion va fusionner particules individuelles et ils sont comptés comme une seule particule. </li><li> Notez le nombre de particules comptées dans le champ de vision de l&#39;écran. </li></ol></li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Mesure&quot;. </li><li> Choisissez réglages dans le «options d&#39;exécution&quot; tableau. <ol><li> Avant chaque acquisition, sélectionnez «mouvement de contrôle» pour un test de la dérive des particules à cocher répétée. Effectuer le test au moins une fois avant de commencer toute l&#39;analyse. Si la dérive est supérieure à 20 um / sec, attendre avant de continuer la mesure de sorte que l&#39;échantillon se arrête de couler. </li><li> Sélectionner le nombre d&#39;expériences (5) et le retard temporel entre eux (0). </li><li> Effectuer un &quot;spécimen de chèque» si nécessaire. Ce test fait partie de l&#39;alignement automatique de la procédure de démarrage et peut être répétée après que nécessaire. </li&gt; </ol></li><li> Enfin, cliquez sur le bouton &quot;d&#39;acquisition vidéo de fonctionner&quot;. Dans la nouvelle fenêtre, définir le nombre de cycles (15) et le nombre de positions de mesure (11). REMARQUE: La tête de laser et du microscope peut être déplacé à analyser le nombre de particules à 11 positions différentes. Selon la demande expérimentale, décider si l&#39;expérience doit être effectuée sur une seule position ou sur différents postes. <ol><li> Confirmez la durée minimale d&#39;une particule doit être suivi doit être considérée comme une particule individuelle par la résolution de la vidéo (faible). A des résultats plus faibles de résolution dans une durée de suivi plus courte. </li><li> Sélectionnez un nom de fichier et cliquez sur &quot;OK&quot; pour démarrer la mesure. </li></ol></li></ol> 4. Interprétation des résultats <ol><li> Voir les résultats et les paramètres suivants affiche après la mesure sur l&#39;onglet &quot;Résultats&quot;: (1) le nombre total de particules tracées, (2) Nombre moyen d&#39;une partieicles par position, et (3) la concentration de particules. <ol><li> Voir le tableau résultat de la moyenne pour le rapport numérique de la taille des particules (diamètre, surface et volume) au pourcentage du nombre de particules, ainsi que les valeurs de la moyenne et de la différenciation standard. </li><li> Utiliser la table d&#39;analyse de crête si plus d&#39;un pic existe dans l&#39;analyse graphique. Ce tableau montre la répartition des particules plus petites que la première respectivement deuxième pic. </li></ol></li><li> Voir le graphique calculée après la mesure de voir une distribution de particules par taille. Utilisez les icônes dans le mode d&#39;affichage et au-dessus du graphique pour modifier les paramètres. </li></ol>

<ol><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThery%2C+C+%22Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%22">Current protocols in cell biology / editorial board</a>. Bonifacino, J. S. (3.22), (2006).</li>
<li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li>
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<li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006(2012).</li>
<li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+current+knowledge+of+their+composition%2C+biological+functions%2C+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li>
<li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+surfaces.+B%2C+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li>
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</ol>

Ce travail a été soutenu par les fonds institutionnels du Département de chirurgie cardiovasculaire de la Faculté de médecine de l’HHU. Les coûts de publication de cette étude ont été pris en charge par Particle MetrixGmbH.

Nous démontrons un protocole détaillé pour l&#39;isolement exosomes du sang et du présent suivi de nanoparticules comme une méthode nouvelle et novatrice pour mesurer la taille et la concentration de exosomes dans un fluide biologique. Dans les expériences présentées sang périphérique humain a été utilisé comme origine des exosomes. Cependant, d&#39;autres origines, tels que l&#39;urine, le crachat, le surnageant de culture cellulaire, etc., peuvent également être utilisées comme matériau d&#39;essai. Basé sur la variabilité biologique de concentration exosomes chez les humains, les tests de différents individus peuvent présenter une concentration remarquable variable des exosomes. Cependant, la concentration de particules dans la sonde d&#39;essai biologique peut avoir un impact sur les résultats. Par conséquent, une approche fiable et normalisée de la dilution de sondes est nécessaire. Dans la méthode présentée exosomes contenant le plasma a été généré à partir de 9 ml de sang total périphérique. Par centrifugation différentielle étapes d&#39;une boulette de exosome été isolé à partir1 ml de plasma et remis en suspension dans 5 ml d&#39;eau distillée à entraîner dans l&#39;échantillon de travail des exosomes suspension. Ce paramètre de pré-défini nous a fourni avec une bonne concentration de particules, ce est à dire, l&#39;intensité de dispersion approprié pendant NTA. En plus de l&#39;aspect et du volume de dilution, la composition des solutions utilisées est également importante. Nous avons utilisé de l&#39;eau distillée pour la remise en suspension définitive des exosomes. Bien entendu, différents supports pour l&#39;étape de dilution finale peuvent également être utilisées, selon les exigences du montage expérimental. Toutefois, dans le cas de mesures du potentiel zêta de ioniques-solutions, en particulier lors de l&#39;essai des échantillons d&#39;une capacité de tamponnage, une dilution prudent dans des conditions libres de turbulence est utile. Pour la comparaison directe de plusieurs échantillons, nous recommandons de conserver le même niveau de dilution pour tous les échantillons. Tous les réglages, sauf la sensibilité et la résolution vidéo peuvent être modifiés par la suite en utilisant le logiciel d&#39;analyse ZETAview. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Bien que les auteurs estiment que le système mis en place de la présente représente actuellement l&#39;instrument le plus approprié, il ne est pas le seul système disponible NTA. Un certain nombre de rapports précédents ont employé d&#39;autres systèmes qui se appliquent les mêmes principes NTA mais fournissent une autre conception de l&#39;instrument qui va de pair avec quelques fonctionnalités différentes 10. Nous pensons que les aspects pratiques concernant la manipulation des échantillons et la reproductibilité des résultats sont d&#39;une importance capitale dans le choix de la séquence méthodologique pour l&#39;évaluation de exosomes. Nous pensons également qu&#39;un système de détection idéal devrait éliminer les facteurs selon l&#39;utilisateur qui peuvent interférer avec les résultats des mesures. L&#39;approche d&#39;analyse de exosomes qui est présentée ici répond au critère de la manipulation facile à un haut degré. Comme autre avantage, l&#39;analyse semi-automatisée des échantillons est réalisée dans un procédé rapide, générant des résultats dans un court laps de temps. Une visualisation en ligne des exosomes facilite l&#39;analyseur à gadans une idée instantanée des caractéristiques d&#39;exosomes, par exemple, la concentration brute. Un ajout très simple et élégante à la technique de mesure présenté ici est l&#39;utilisation d&#39;anticorps marqué et la capture des exosomes du faisceau laser dispersé en utilisant un filtre précédent devant le détecteur. De cette façon sous-populations d&#39;exosomes peuvent être distingués en fonction de leurs antigènes de surface et autres caractéristiques biologiquement pertinentes qui sont techniquement accessible à un coloration fluorescente sélective. Un inconvénient de la version actuelle de notre instrument de suivi des particules est le fait que, à des niveaux de sensibilité très élevée, tels que des artefacts de bruit de fond peuvent être présents, qui se appuie sur la paroi du canal de la cellule. Une solution technique et l&#39;amélioration du système actuel pourraient être disponibles dans un proche avenir. Par ce procédé, les réflexions de la lumière de dispersion laser sur la paroi du canal est réduit, augmentant ainsi<html> la précision des signaux de mesure et des données obtenues et de l&#39;abaissement de la limite de détection. Bien que le protocole actuellement utilisé pour l&#39;isolation des exosomes est bien établi et l&#39;instrument de suivi de particules appliqué a une résolution remarquablement précis avec une distribution de taille inférieure de 30 nm, il ne ya aucune garantie que les particules détectées sont en effet tout à fait vrai exosomes. D&#39;autres particules, telles que des fragments de cellules mortes ou des complexes protéiques plus grands peuvent également être présents dans la suspension d&#39;exosomes et conduire à des signaux faux positifs. Une méthode fiable par laquelle cette «pollution» peut être exclue peut être microscopie électronique (ME), soit de transmission EM EM ou balayage. Malheureusement, aucun marqueur général et spécifique pour exosomes a été identifié à ce jour, bien qu&#39;un certain nombre de marqueurs de surface proposées précédemment ont gagné une quantité croissante de l&#39;attention, y compris tétraspanine (Tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11. &quot;&gt; Indépendamment de l&#39;évolution future de la recherche sur les exosomes biologie, notamment en matière de marqueurs spécifiques d&#39;exosomes, le protocole qui est présentée ici fournira une méthode puissante pour l&#39;isolement et la détection des exosomes. Concentration et la taille peuvent être facilement déterminées dans un logiciel assistée manière directe. L&#39;ajout de marqueurs fluorescents sélectifs ou des anticorps fluorophores couplé seront probablement améliorer encore les applications possibles de l&#39;approche présentée de NTA.

La fonction exacte des exosomes circulant restée inconnue pendant une longue période de temps. Même maintenant le mécanisme de chemin d&#39;accès complet des exosomes est pas entièrement comprise. Depuis exosomes portent des antigènes, des protéines et de l&#39;ARN (ARNm et des miRNA) qui les concerne leur cellule d&#39;origine des parents, leur fonction de cellule-cellule émetteurs de signalisation a essentiellement été donné la priorité. De nombreux procédés différents ont été décrits dans la littérature pour l&#39;isolement et la détection quantitative d&#39;exosomes 1,2. Toutefois, aucun consensus sur une «norme d&#39;or» a été atteint. Pendant ce temps la majorité des scientifiques actifs dans le domaine de la recherche exosomes conviennent qu&#39;une méthode cohérente de l&#39;isolement est fortement justifiée pour atteindre un plus haut degré de comparabilité entre les différents rapports et études. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) est l&#39;outil le plus commun et répandu pour l&#39;analyse des exosomes 3. FACS a benEFIT que, par marquage par fluorescence, des cellules d&#39;origines différentes peuvent être comparés à une étape. Les inconvénients majeurs de FACS sont que cette méthode ne est pas assez sensible pour identifier les particules inférieures à 0,5 pm 4, tandis que les exosomes sont généralement comprises entre 30 à 120 nm de diamètre 5, encore moins de mesurer leur taille. La microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à transmission (MET) d&#39;autres outils d&#39;analyse de taille de particule et la morphologie des exosomes. Toutefois, les deux SEM et TEM ont l&#39;inconvénient que la préparation des échantillons est beaucoup de temps, les deux méthodes impliquent étapes de main-d&#39;œuvre et chacun a un risque de génération artefact. Ni méthode est adaptée pour un débit d&#39;échantillonnage élevée et la caractérisation de plusieurs milliers de particules individuelles d&#39;un échantillon. En outre, une analyse quantitative de routine quotidienne clinique où les échantillons doivent souvent être analysé simultanément ou au moins dans une très courte période estdifficile à réaliser. De nouvelles techniques de production nous permettent maintenant d&#39;analyser exosomes sans travaux préparatoires intensifs avant (SEM par exemple, de l&#39;environnement). Ces techniques modernes sont encore assez gênant pour l&#39;analyse de grandes suspensions de volume contenant exosomes afin de déterminer leur nombre moyen et la distribution de la taille 6. Une autre méthode très sensible pour la visualisation et l&#39;analyse des exosomes est l&#39;analyse de nanoparticules de suivi (NTA). Cette méthode tire parti de deux principes différents de la physique. Tout d&#39;abord, des particules sont détectées par la lumière diffusée quand ils sont irradiés avec un faisceau laser. Le second phénomène est appelé mouvement brownien, selon lequel la diffusion des différentes particules dans une suspension liquide est inversement proportionnelle à leur taille. Dans ce dernier cas, le mouvement dépend aussi de la température et de la viscosité du liquide. Cependant, ce taux est directement liée à la taille des particules et est utilisé par NTA. Utilisation douceanalyse basée-ware, des images numériques de la lumière diffusée par les particules simples sont enregistrées. Lots de taches lumineuses dispersées et leur vitesse de déplacement fournissent des données qui facilitent la détermination du nombre total des particules et la distribution granulométrique. Cette technique est particulièrement puissant pour l&#39;analyse des particules d&#39;un diamètre moyen inférieur à 100 nm. Taille et la concentration Les mesures sont effectuées avec le ZETAview brownien et Microscope Analyse électrophorèse Video Motion. Il se agit d&#39;un dessus de bureau nanoparticule instrument d&#39;analyse semi-automatique pour échantillons liquides (ci-après dénommé instrument de suivi des particules). Il se compose du suivi analyseur de particules ainsi que d&#39;un ordinateur portable avec le logiciel utilisé pour l&#39;analyse de données. Des échantillons biologiques hétérogènes sont comme convenant à ce procédé sous forme de suspensions homogènes de plus des particules inorganiques. Microscope de diffraction laser à l&#39;aide d&#39;une caméra vidéo est utilisée pour la détection de particules et de la observation de leur mouvement. Bien que l&#39;axe de microscope est horizontal et centré dans le canal de cellule remplie d&#39;une suspension contenant des exosomes, le faisceau laser est orienté verticalement. Les particules irradiés par la dispersion de la lumière laser, qui est enregistré sous 90 ° par une caméra vidéo numérique via le microscope (Figure 1). L&#39;intensité de la lumière diffusée permet l&#39;observation de particules de plus grand diamètre de 60 nm. Dans un tel réglage de la luminosité d&#39;une particule ne est pas la seule indication de la taille des particules. Si aucun champ électrique est appliqué, le mouvement des particules ne suit le mouvement brownien et peut servir d&#39;indicateur pour le calcul de la taille des particules. Cependant, l&#39;appareil est également capable d&#39;appliquer un champ électrique à travers le canal de la cellule. Lorsque soumis à ce champ, le potentiel, la polarité et le niveau de charge ionique des exosomes suspendus deviennent d&#39;autres déterminants de la direction de leur mouvement. Velocity et le résultat de direction dans un mo électrophorétiquebilité histogramme. Bien que la recherche d&#39;une méthode optimale pour analyser exosomes isolés ya un problème, un autre se trouve dans l&#39;isolement d&#39;exosomes efficace de différents supports, tels que le sang, l&#39;ascite, l&#39;urine, le lait, le liquide amniotique ou le support de la cellule. Différentes méthodes ont été décrites à ce jour, qui sont basées sur une ultracentrifugation, réactifs de séparation industriels (tels que Exoquick) 7, des billes magnétiques pour antigène employant séparation 8 ou 9 étapes ultrafiltration. Dans ce protocole, nous démontrons l&#39;ensemble du processus d&#39;isolement de exosomes par ultracentrifugation et montrons comment analyser l&#39;exosomes résultant contenant la suspension par l&#39;intermédiaire de l&#39;instrument de suivi de particules. Considérations particulières relatives à l&#39;analyse des exosomes dérivés de plasma moyennes ou de la culture de cellules humaines sont fournis.

<table><tbody><tr><td>Tube de citrate</td><td>BD</td><td>364305</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>Eau distillée</td><td>Braun</td><td>3880087</td><td>Aqua ad iniectabilia</td></tr><tr><td>Tube Falcon</td><td>Greiner Bio One 188271</td><td></td><td>Tube PP, Steril 15 ml</td></tr><tr><td>Tube d’ultracentrifugation</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td>Tube de microfuge Polyallomer 1,5 ml</td></tr><tr><td>Polybead</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>07304</td><td>Seringue de solution d’alignement 2,6 % solides-latex </td></tr><tr><td>(Filtre)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td>Seringue 5 ml</td></tr><tr><td>(ZetaView)</td><td>Braun</td><td>4606051V</td><td>Aiguille 5 ml</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>305180</td><td>BD Filtre à aiguille Blunt Fill</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555</td><td>Filtre à seringue, hydrophile, 450 &micro ; m</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>L8-M</td><td>Rotor : 70Ti N° sér. E21078</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>PMX 100, Type 101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Rotor : A-4-44</td></tr></tbody></table>

une méthode innovante pour exosome quantification et taille mesure

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Bien que l’importance biologique des exosomes ait récemment fait l’objet d’une attention scientifique et clinique croissante, on ignore encore beaucoup de choses sur leurs voies complexes, leur biodisponibilité et leurs diverses fonctions dans la santé et la maladie. Les travaux actuels portent sur la présence et le comportement des exosomes (in vitro comme in vivo) dans le contexte de différents troubles humains, notamment dans les domaines de l’oncologie, de la gynécologie et de la cardiologie.
Malheureusement, il n’existe ni consensus concernant un étalon-or pour l’isolement des exosomes, ni accord sur une telle méthode pour leur analyse quantitative. Comme il existe de nombreuses méthodes pour la purification des exosomes et aussi de nombreuses possibilités pour leur analyse quantitative et qualitative, il est difficile de déterminer une combinaison de méthodes pour l’approche idéale. 
Ici, nous démontrons l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), une méthode semi-automatisée pour la caractérisation des exosomes après isolement du plasma humain par ultracentrifugation. Les résultats présentés montrent que cette approche d’isolement, ainsi que la détermination du nombre et de la taille moyens des exosomes, fournissent des données reproductibles et valides, comme le confirment d’autres méthodes, telles que la microscopie électronique à balayage (MEB).

L&#39;échantillon utilisé pour cette démonstration montre un réglage optimal pour la mesure avec une sensibilité de 85%, avant de la pente maximale de la courbe de sensibilité (figure 2). La luminosité, le min / max des valeurs ont été choisis comme recommandé dans le protocole. Une concentration de 5,3 particules / ml x 10 6 a été mesurée, tandis que la taille moyenne des particules était de 0,149 um, la plupart d&#39;entre eux étaient 0,137 um. Les valeurs reçues après la mesure peuvent être enregistrées dans un rapport avec un format de fichier .pdf ou .txt pour l&#39;exportation dans une base de données. Le graphique peut être ajustée préféré comme décrit dans le protocole (article 4). La séquence vidéo est également enregistré et peut être utilisé pour plus tard hors ligne nouvelle analyse. Cependant, dans une telle analyse hors-ligne, les paramètres pré-acquisition de l&#39;appareil photo ne peuvent pas être modifiées rétrospectivement. Afin de trouver les paramètres optimaux pour une mesure, nous décrivons ici èmee optimisation des réglages de l&#39;appareil sur l&#39;exemple d&#39;un 100 nm de taille standard de polystyrène. L&#39;influence de deux paramètres, la sensibilité et min / max sur la distribution de taille d&#39;image vidéo et la taille des particules est discuté en détail. Tous les autres paramètres sont résumés dans le tableau 1. Une impression visuelle de l&#39;impact de la sensibilité (allant de 50 à 94) analogiques et numériques sur des images est visualisée sur la figure 3. Les informations quantitatives dérivée à partir des images est présentée en figure 4, en fonction des paramètres du tableau 1, Min = Taille 5 Taille et Max = 200. Une relation typique du nombre de particules détectées par rapport sensibilité est représenté sur la figure 4A. Entre 50 et 90, le nombre de particules détectées a augmenté avec sensibilité et augmenté de façon spectaculaire pour les sensibilités&gt; 90. Une gamme de sensibilité optimale a été observée entre 66 et 86 (A). les distributions de tailles des particules obtenues avec difréglages de sensibilité dif- sont montrés sur la figure 4B. Les distributions de taille de particule représentent la moyenne de trois mesures individuelles. Pour une sensibilité trop faible (sensibilité = 62, courbe rouge) à seulement quelques particules ont été analysés dans les statistiques résultant plutôt pauvres. Le nombre de particules analysées augmenté avec sensibilité et atteint un optimum entre 70 (courbe jaune) et 86 (courbe tan). Augmenter encore le fil de la sensibilité à une dégradation de la distribution de taille de particule avec le nombre de particules tombant et la distribution de taille de décalage vers des tailles plus petites (sensibilité = 94, la courbe bleue). La figure 4C montre l&#39;évolution du diamètre de x50 à base de nombre (50% les particules sont plus petites que ce diamètre) en fonction de la sensibilité. Dans l&#39;intervalle beige, le RSD de la taille des particules est inférieure à 8% et correspond à l&#39;intervalle optimal dans A. Les régions rouges indiquent RSD&gt; 8% à la suite de mauvaises statistiques (sensibilité trop bas) ou large distributions avec passage à de plus petites tailles (sensibilité trop élevée). Les réglages de Taille Min et Max Taille des filtres sont appliqués aux images numériques afin d&#39;éliminer les particules avec des tailles de spot inférieure à Min Taille et plus grand que Max Taille. En raison de la capacité à diffuser la lumière, une particule crée un endroit d&#39;une certaine taille sur une image numérique. La taille de la tache est mesurée en nombre de pixels (px). Quand une particule diffuse la lumière très bien (par exemple, les particules&gt; 200 nm ou d&#39;agrégats), la taille du spot est assez grand, par exemple,&gt; 500 px. La taille du spot est assez faible (par exemple, &lt;10 px) pour les petites particules (par exemple, &lt;20 nm) en fonction du matériau de particules. Taille du spot (px) ne peut pas être échangé avec la taille des particules (nm) car ils ne sont pas identiques et il n&#39;y a pas de relation directe entre ces deux variables. Une optimisation de Min et Max Taille permet à l&#39;utilisateur de filtrer les objets indésirables tels que des agglomérats (Max) ou petite tailleobjets tels que bruit de fond (Min Taille). L&#39;influence de Min / Max Taille de la distribution de taille de particule d&#39;une taille standard 100 nm est représentée sur la figure 4D (sensibilité = 82). Lorsque l&#39;intervalle est réglé sur petits spots (par exemple, min = 1, max = 52; courbe orange), le nombre de particules analysées est réduite et le diamètre de x50 à base de nombre est légèrement déplacée vers de plus petites tailles. Un cadre pour les taches plus grandes (min = 40, max = 1,000; courbe rouge) se traduit par une distribution de taille de particules large décalé vers de plus grandes tailles. Pour obtenir le nombre total égales de particules, les limites de l&#39;intervalle de deux distributions orange et rouge ont été ajustées pour correspondre à 80 particules. La distribution avec des paramètres optimaux (min = 5, max = 200; courbe tan) se compose de 360 ​​particules. Une série d&#39;expériences ont été effectuées avec succès exosomes isolées par ultracentrifugation et mesurées par le NTA en utilisant le système présenté. Les données résultantes ont été trèscohérente et confirmé un niveau élevé de reproductibilité. Autres méthodes d&#39;isolement doivent montrer des résultats similaires. Cependant, l&#39;étape de dilution a été identifié comme une étape particulièrement critique et son impact sur le nombre total de particules calculées doit être réévalué. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de la configuration de la NTA. L&#39;axe de microscope / vidéo et le faisceau laser sont orientés orthogonalement par rapport à l&#39;autre, se croisant à la section transversale du canal de la cellule. La lumière diffusée par les particules est affiché dans le &quot;live-view&quot; fenêtre du logiciel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; Figure 2. Nombre de particules par rapport courbe de sensibilité. Le nombre de particules par rapport courbe de sensibilité affiche les particules dans une position à un moment lors d&#39;une analyse automatique de la sensibilité. Cette visualisation graphique est utilisé pour déterminer les meilleurs choix concernant les mesures initiales. Une valeur de sensibilité est choisi avant la pente maximale de la courbe. Il est important de se rappeler que les artefacts ne sont pas éliminés dans cette expérience de test et peuvent affecter le graphique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Figure 3. Impact de la sensibilité en mode analogique et de l&#39;image numérique. Visualisation des particules sur l&#39;écran en direct de vue se affiche pendant sensibilités entre 50 et 94 pour les deux analogique (rangée du haut) unD Digital (rangée du bas) vues. Lorsque la sensibilité est trop faible, à seulement quelques particules sont détectées (à gauche). Au sensibilité optimale les particules apparaissent comme des points simples et isolés les uns des autres (au milieu). À un particules de sensibilité relativement élevés fusionner conduisant à une mauvaise qualité d&#39;image (à droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Figure 4. Influence de la sensibilité min et maxi de taille pour un échantillon contrôle à 100 nm de particules de polystyrène (A) Terrain de la sensibilité en fonction du nombre détecté de particules. l&#39;intervalle optimal est de 66 à 86, préalablement à la pente maximale de la courbe. Distributions (B) de la taille des particules obtenues avec plusieurs réglages de sensibilité (62-94); graphiques pour trop faible (62) ou trop haute (94) la sensibilité ne tiennent pas compte de la distribution de taille de particule de 100 nm échantillon témoin de polystyrène. (C) Nombre de diamètre sur la base de x50 par rapport à la sensibilité; l&#39;erreur de x50 dans l&#39;intervalle beige est inférieure à 8%, l&#39;intervalle optimal est de 66 à 86. (D) Effet de la taille minimum et maximum de la distribution de taille de particule; paramètres optimaux (min = 5 et max = 200) capturent la distribution correcte pour l&#39;échantillon de contrôle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Paramètres pré-acquisition </td></tr><tr><td> Sensibilité </td><td> variable </td></tr><tr><td> Obturateur </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Frame rate </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Résolution </td><td> Salutgh </td></tr><tr><td> Cycles </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Acquisitions multiples </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Position </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Paramètres post-acquisition </td></tr><tr><td> Luminosité min </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Max Taille </td><td> variable </td></tr><tr><td> Min Taille </td><td> variable </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Résumé des paramètres pré- et post-acquisition pour le réglage de l&#39;instrument de suivi de particules.

Une méthode d’isolement des exosomes du sang total et d’analyse ultérieure par suivi des nanoparticules à l’aide d’un instrument semi-automatique est présentée dans cet article. La technologie présentée fournit une méthode extrêmement sensible pour visualiser et analyser les particules en suspension liquide.

Une méthode innovante pour Exosome Quantification et Taille Mesure

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

L'objectif de cette procédure est d'analyser les exosomes selon leur taille et de les quantifier à l'aide d'un instrument d'analyse de suivi de nanoparticules, ou NTA, par une méthode semi-automatisée. Cela est réalisé en utilisant des étapes de centrifugation différentielle afin d'obtenir un culot d'exosomes à partir de sang humain. Les exosomes sont remis en suspension à une concentration prédéterminée en fonction de la quantité de plasma initial, afin d'obtenir une intensité de diffusion appropriée.Lors de l'analyse de suivi de trajectoire nanoparticulaire (NTA), la suspension est ensuite filtrée pour séparer les exosomes des particules plus grandes. Ensuite, un étalonnage de l'instrument de NTA est effectué à l'aide d'une suspension témoin contenant des particules de polystyrène de 200 nanomètres. La solution d'exosomes est alors injectée dans l'instrument de NTA et le réglage idéal de la NTA est sélectionné en réalisant un test préliminaire avant d'effectuer le test final.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant la quantification de toutes les particules mesurées et la liste des particules selon leur taille. La démonstration de cette méthode est essentielle, car la solution et les paramètres pour chaque solution d'exosomes préparée doivent être réalisés individuellement afin d'obtenir les meilleurs résultats. Les exosomes mesurés doivent être à une concentration I afin que le mode de visualisation en temps réel affiche environ 600 particules par écran.En outre, un test préliminaire doit être effectué afin de déterminer la plage de sensibilité optimale pour le mesurage. Un réglage élevé de la sensibilité permet de visualiser davantage de petites particules, mais augmente également les problèmes liés aux bruits de fond. La procédure sera démontrée par Anto May, étudiant diplômant de notre laboratoire. Pour commencer la préparation des exosomes, prélevez du sang total dans trois tubes contenant du citrate par ponction veineuse, pour un volume total de neuf millilitres.Ensuite, versez le sang dans un tube Falcon de 15 millilitres et centrifugez l'échantillon à 1 500 ×g pendant 20 minutes à 4 °C pour amorcer la séparation des cellules et du plasma. Transférez le surnageant dans un nouveau tube Falcon de 15 millilitres. Puis, centrifugez à nouveau l'échantillon à 2 800 ×g pendant 20 minutes à 4 °C afin d'éliminer toutes les cellules du plasma.Transférez le plasma sans cellules ou le PSC dans des tubes d'ultracentrifugation, un millilitre par tube. Ensuite, centrifugez le PSC à 100 000 ×g pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius afin de dépléter les exosomes. Retirez 900 microlitres de surnageant et remettez en suspension le culot dans les 100 microlitres restants dans le tube d'ultracentrifugation.Après avoir ajouté 900 microlitres de PBS, centrifugez à 100 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Comme précédemment, retirez 900 microlitres de l'agent surnageant et remettez en suspension les culots dans les 100 microlitres restants. Transférez cinq à 20 microlitres de la suspension resuspendue dans 40 millilitres d'eau distillée.Filtrez la suspension à l’aide d’un filtre de 450 nanomètres pour séparer les exosomes des particules plus grandes. Utilisez cette suspension finale pour la mesure des particules afin d’utiliser l’instrument de suivi des particules. Commencez d’abord le programme en double-cliquant sur l’icône du logiciel.Cliquez sur les différents onglets du logiciel pour passer de l'un à l'autre tout au long du protocole. Suivez les instructions affichées à l'écran. Pour une exécution automatisée de la procédure de démarrage, cochez les cases correspondant au contrôle de qualité des cellules et à l'alignement automatique.Chacune de ces étapes peut être répétée séparément si nécessaire en appuyant sur le bouton A ou B dans l'onglet de contrôle de la cellule. Placer un bécher sous le port de sortie pour recueillir la solution usée et ne pas introduire de bulles d'air dans le système. Ouvrir les ports d'entrée et de sortie de l'instrument d'analyse de suivi de nanoparticules (nanoparticle tracking analysis ou NTA) et injecter 10 millilitres d'eau distillée à l'aide d'une seringue dans le canal de la cellule par le port d'entrée.Fermez immédiatement les ports d'entrée et de sortie pendant l'injection de la dernière quantité d'eau. Assurez-vous que la cellule de mesure est exempte de bulles d'air. Effectuez le contrôle de qualité de la cellule en cliquant sur.Okay.Le logiciel affichera le résultat de la qualité cellulaire après quelques secondes ; si des particules sont encore visibles à l'écran de la vue en direct du logiciel, ou si le résultat du contrôle de qualité est seulement bon ou médiocre, répétez l'injection d'eau distale jusqu'à ce que les particules résiduelles soient éliminées de la cellule de mesure L. Répétez également cette étape après chaque mesure afin d'éviter l'accumulation de particules. Préparez ensuite une suspension témoin contenant des particules uniformes de polystyrène de 200 nanomètres de taille. Pour aligner les foyers du laser et du microscope, ajoutez une goutte de la suspension concentrée fournie par le fabricant de l'appareil à 500 millilitres d'eau distillée, afin d'obtenir la concentration requise, telle que 600 ± 100 particules soient affichées par écran en vue en direct.Injecter la suspension d'alignement dans l'instrument NTA comme effectué pour la pression d'eau distillée. Il est possible de commencer également l'alignement, une procédure automatisée au cours de laquelle le système trouvera automatiquement la position optimale des deux foyers. Lorsqu'une invite apparaît indiquant que le système est désormais prêt pour les expériences, cliquer sur OK pour démarrer la mesure.Nettoyez occasionnellement manuellement le canal de la cellule entre les expériences en rinçant la cellule avec une solution d'éthanol à 30 %. Nettoyez le canal chaque fois que le logiciel affiche un rapport d'erreur automatique. Pour effectuer la mesure du système.Commencez par rincer le canal avec de l'eau distillée avant chaque mesure d'échantillon. Ensuite, injectez la suspension d'exosomes dans le canal. L'étape suivante consiste à régler les paramètres principaux dans le logiciel afin d'ajuster la sensibilité.Trouvez la plage de sensibilité optimale en cliquant sur le nombre de particules en fonction de la sensibilité pour afficher une courbe représentant le nombre de particules mesurées par écran pour différents niveaux de sensibilité. Choisissez un niveau de sensibilité situé avant la pente maximale de la courbe. Un niveau de sensibilité plus élevé permet de visualiser davantage de petites particules, mais augmente également les problèmes liés au bruit de fond.Pour ajuster la luminosité minimale, choisissez une luminosité initiale de 20 pour la mesure des exosomes. Pour utiliser cette fonction comme filtre, réglez ce paramètre afin d'assombrir les particules fortement diffusantes de la lumière. Réduisez-le pour amplifier les artefacts de diffusion faible, en ajustant la luminosité selon les besoins tout au long de l'expérience.Ensuite, réglez un filtre numérique pour éliminer le bruit des pixels et les particules diffusées indésirables de taille excessive. En régulant la taille minimale et maximale, utilisez une plage de 10 à 500 pixels pour la mesure des exosomes. Ajustez l'obturateur en modifiant la durée d'ouverture de l'appareil en réglant l'obturateur sur 300, ce qui correspond à 3,3 millisecondes.Pour ajuster les paramètres de lecture en direct, basculez à tout moment entre un mode de vue numérique et analogique en cliquant sur le bouton d'image en direct. Pendant l'expérience, surveillez la barre d'intensité de diffusion, qui affiche l'état de saturation de l'échantillon sous forme d'un indicateur codé par couleur.Ne pas analyser les exosomes si la barre de diffusion est rouge. Pour commencer la mesure, cliquer sur l'onglet de mesure. Choisir les paramètres dans le tableau des options d'exécution.Avant chaque acquisition, sélectionnez la vérification du mouvement, un test répété de dérive des particules, choisissez le nombre d'expériences et le délai temporel entre celles-ci. Effectuez une vérification de l'échantillon si nécessaire. Enfin, cliquez sur le bouton de démarrage de l'acquisition vidéo.Dans la nouvelle fenêtre, définissez le nombre de cycles et le nombre de positions de mesure. Confirmez la durée minimale. Une particule est suivie afin d'être comptabilisée comme une particule individuelle.En réglant la résolution vidéo, une résolution plus faible entraîne une durée de suivi plus courte. Enfin, sélectionnez un nom de fichier et cliquez sur OK pour démarrer la mesure. La courbe du nombre de particules en fonction de la sensibilité affiche les particules présentes en un endroit donné à un instant précis.Lors d'un balayage automatique de sensibilité, une valeur de sensibilité est choisie avant la pente maximale du graphique. Les artefacts ne sont pas éliminés dans cette expérience test et peuvent affecter le graphique. La visualisation des particules sur l'écran de la vue en direct est utile pour régler la valeur de sensibilité appropriée.Une valeur trop faible conduit à la détection d'un faible nombre de particules. Une valeur trop élevée donne une image de mauvaise qualité, tandis qu'à un niveau de sensibilité optimal, les particules de bonne qualité apparaissent comme des points uniques bien isolés les uns des autres. L'onglet des résultats après la mesure permet la lecture des paramètres, notamment le nombre total de particules détectées, le nombre moyen de particules par position, la concentration en particules, ainsi que le rapport numérique entre la taille des particules et le pourcentage du nombre de particules.Le graphique calculé après la mesure montre la répartition des particules selon leur taille. Les icônes en mode affichage peuvent être utilisées pour modifier les paramètres du graphique. De plus, il existe différentes méthodes pour analyser les exosomes.Cette méthode décrit une approche très simple et élégante pour effectuer une analyse similaire selon un processus rapide permettant d'obtenir des résultats en peu de temps. Afin de comparer plusieurs échantillons, nous recommandons de maintenir le même niveau de dilution pour tous les échantillons. Tous les paramètres, à l'exception de la sensibilité et de la résolution vidéo, peuvent être modifiés ultérieurement à l'aide d'un ensemble de logiciels d'analyse peu nombreux.Ainsi, l'analyse comparative des données obtenues dans différentes expériences sur la quantité et la taille des exosomes devient possible de manière semi-automatisée.

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