Une méthode innovante pour Exosome Quantification et Taille Mesure

L’objectif de cette procédure est d’analyser les exosomes par leur taille et de les quantifier à l’aide d’une analyse de suivi de nanoparticules ou d’un instrument NTA par une méthode semi-automatisée. Ceci est accompli en utilisant des étapes de centrification différentielle pour obtenir une pastille d’exosome à partir de sang humain. Les exosomes sont remis en suspension à une concentration prédéterminée pour la quantité de plasma de départ afin d’obtenir l’intensité de diffusion appropriée.

Au cours de l’ATN, la suspension est ensuite filtrée pour séparer les exosomes des particules plus grosses. Ensuite, un étalonnage de l’instrument NTA est effectué à l’aide d’une suspension de contrôle contenant des particules de polystyrène de taille nanométrique. La solution d’exosome est ensuite injectée dans l’instrument NTA et le réglage idéal du NTA est sélectionné en effectuant un pré-test avant d’effectuer le test final.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la quantification de toutes les particules mesurées et la liste des particules par leur taille. La démonstration de cette méthode est essentielle car la solution et le réglage de chaque solution d’exosome préparée doivent être effectués individuellement pour obtenir les meilleurs résultats. Les exosomes mesurés doivent être dans une concentration I afin que le mode de visualisation en direct affiche environ 600 particules par écran.

De plus, un pré-test doit être effectué pour trouver la plage de sensibilité optimale pour la mesure. Un réglage élevé de la sensibilité permet de visualiser davantage de petites particules, ce qui augmente également les problèmes liés aux bruits de fond. La procédure sera démontrée par Anto May, un étudiant diplômé de notre laboratoire. Pour commencer la préparation des exosomes, prélevez du sang total dans trois tubes de citrate par ponction veineuse pour un total de neuf millilitres.

Ensuite, versez le sang dans une centrifugeuse à tube Falcon de 15 millilitres et copiez l’échantillon à 1 500 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius pour initier la séparation des cellules du plasma. Transférez le S naissant dans un nouveau tube Falcon de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez à nouveau l’échantillon à 2 800 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius pour retirer toutes les cellules du plasma.

Transférez le plasma acellulaire ou CFP dans des tubes d’ultracentrifugation à raison d’un millilitre par tube. Ensuite, centrifugez le CFP à 100 000 G pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius pour épuiser les exosomes. Retirez 900 microlitres de surnageant et remettez la pastille en suspension dans les 100 microlitres restants dans le tube d’ultracentrifugation.

Après avoir ajouté 900 microlitres de centrifugeuse PBS, vous gagnez à 100 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Comme précédemment, retirez 900 microlitres d’agent dorsal et remettez les granulés en suspension avec les 100 microlitres restants. Transférez cinq à 20 microlitres de la suspension Resus dans 40 millilitres d’eau distillée.

Filtrez la suspension à travers un filtre de 450 nanomètres pour séparer les exosomes des particules plus grosses. Utilisez cette suspension finale pour la mesure des particules afin d’utiliser l’instrument de suivi des particules. Tout d’abord, démarrez le programme en double-cliquant sur l’icône du logiciel.

Cliquez sur les différents onglets du logiciel pour passer de l’un à l’autre dans le protocole. Suivez les instructions à l’écran. Pour une mise en œuvre automatisée de la procédure de démarrage, cochez les cases pour le contrôle de la qualité des cellules et l’alignement automatique.

L’une ou l’autre de ces étapes peut être répétée séparément si nécessaire en appuyant sur le bouton A ou B sur l’onglet de vérification de la cellule. Placez un bécher sous le port d’observation pour recueillir les déchets de solution et n’injectez pas de bulles d’air dans le système. Ouvrez les ports d’entrée et de sortie de l’instrument d’analyse de suivi des nanoparticules ou NTA et injectez 10 millilitres d’eau distillée à l’aide d’une seringue dans le canal cellulaire par l’orifice d’entrée.

Fermez immédiatement l’orifice d’entrée et de sortie au moment où la dernière quantité d’eau est injectée. Assurez-vous que la cellule de mesure est exempte de bulles d’air. Effectuez le contrôle de la qualité des cellules en cliquant sur. D’accord.

Le logiciel affichera le résultat de la qualité de la cellule après quelques secondes, si des particules sont toujours visualisées sur l’écran de visualisation en direct du logiciel, ou si le résultat du contrôle de qualité n’est que bon ou mauvais, répétez l’injection d’eau distale jusqu’à ce que les particules restantes soient retirées de la cellule de mesure L.Aussi, Répétez cette étape après chaque mesure pour éviter l’accumulation de particules. Ensuite, préparez une suspension de contrôle contenant des particules de polystyrène uniformes de 200 nanomètres. Pour aligner les foyers du laser et du microscope, ajoutez une goutte du concentré de suspension fourni par le fabricant de l’instrument à 500 millilitres d’eau distillée, ce qui permet d’obtenir la concentration requise, de sorte que 600 plus ou moins 100 particules sont affichées par écran dans la vue en direct.

Injecter la suspension d’alignement dans l’instrument NTA comme pour la presse à eau distillée. D’accord pour commencer également l’alignement, qui est une routine automatisée grâce à laquelle le système trouvera automatiquement la position optimale des deux foyers. Lorsqu’une invite s’affiche indiquant que le système est maintenant prêt pour les expériences, cliquez sur OK pour démarrer la mesure.

De temps en temps, nettoyez manuellement le canal cellulaire entre les expériences en rinçant la cellule avec une solution à 30 % d’éthanol. Nettoyez le canal chaque fois que le logiciel affiche un rapport d’erreur automatique. Pour effectuer la mesure du système.

Tout d’abord, rincez le canal avec de l’eau distillée avant chaque mesure d’échantillon. Injectez ensuite la suspension d’exosomes dans le canal. L’étape suivante consiste à ajuster les principaux paramètres dans le logiciel pour ajuster la sensibilité.

Trouvez la plage de sensibilité optimale en cliquant sur nombre de particules en fonction de la sensibilité pour afficher une courbe des particules mesurées par écran pour différents niveaux de sensibilité. Choisissez un niveau de sensibilité avant la pente maximale de la courbe. Un niveau de sensibilité plus élevé permet de visualiser davantage de petites particules, mais augmente également les problèmes liés au bruit de fond.

Pour régler la luminosité minimale, choisissez une luminosité de départ de 20 pour la mesure des exosomes. Pour utiliser cette fonction comme filtre, réglez ce paramètre jusqu’à ce que les particules fortement diffusantes de la lumière soient effacées. Régulez-le vers le bas pour amplifier les artefacts de diffusion hebdomadaires, très lumineux si nécessaire tout au long de l’expérience.

Ensuite, réglez un filtre numérique pour éliminer le bruit des pixels et la diffusion indésirable des particules surdimensionnées. En régulant la taille minimale et maximale, utilisez une plage de 10 à 500 pixels pour la mesure des exosomes. Réglez l’obturateur en modifiant la période d’ouverture de l’appareil photo en réglant l’obturateur sur 300, ce qui équivaut à 3,3 millisecondes.

Pour régler les paramètres de lecture en direct, basculez entre un mode d’affichage numérique et analogique à tout moment en cliquant sur le bouton d’image en direct. Tout au long de l’expérience. Surveillez la barre d’intensité de diffusion, qui affiche l’état de saturation de l’échantillon sous la forme d’un indicateur de code couleur.

N’analysez pas les exosomes si la barre de diffusion est rouge. Pour commencer la mesure, cliquez sur l’onglet de mesure. Choisissez les paramètres dans le tableau des options d’exécution.

Avant chaque acquisition, sélectionnez le mouvement de contrôle, un test de dérive des particules de contrôle répété, sélectionnez le nombre d’expériences et le délai entre elles. Effectuez une vérification d’échantillon si nécessaire. Enfin, cliquez sur le bouton Exécuter l’acquisition vidéo.

Dans la nouvelle fenêtre, définissez le nombre de cycles et le nombre de positions de mesure. Confirmez la durée minimale. Une particule est suivie pour être comptée comme une particule individuelle.

En réglant la résolution vidéo, une résolution plus faible entraîne une durée de suivi plus courte. Enfin, sélectionnez un nom de fichier et cliquez sur OK pour commencer la mesure. La courbe de nombre de particules en fonction de la sensibilité affiche les particules dans une position à un moment donné.

Lors d’un balayage de sensibilité automatique, une valeur de sensibilité est choisie avant la pente maximale du graphique. Les artefacts ne sont pas éliminés dans cette expérience de test et peuvent affecter le graphique. La visualisation des particules sur l’écran d’affichage en direct est utile pour régler la bonne valeur de sensibilité.

Une valeur trop faible permet de détecter peu de particules. Alors qu’une valeur trop élevée montre une image médiocre, les particules de qualité apparaissent comme un seul point bien isolé les uns des autres dans le niveau de sensibilité optimal. L’onglet des résultats après la mesure permet la lecture des paramètres, y compris le nombre total de particules tracées, le nombre moyen de particules par position et la concentration des particules, ainsi que le rapport numérique entre la taille des particules et le pourcentage de nombre de particules.

Le graphique calculé après la mesure montre la distribution des particules par taille. Les icônes en mode d’affichage peuvent être utilisées pour modifier les paramètres du graphique. En outre, il existe différentes façons d’analyser les exosomes.

Cette méthode montre une méthode très simple et élégante pour effectuer une analyse de méthode similaire dans un processus rapide pour générer des résultats en peu de temps. Afin de comparer plusieurs échantillons, nous vous recommandons de conserver le même niveau de dilution pour tous les échantillons. Tous les paramètres acceptent la sensibilité et la résolution vidéo peut être modifiée par la suite à l’aide de l’ensemble de quelques logiciels d’analyse.

De cette façon, l’analyse comparative des données obtenues dans différentes expériences sur la quantité et la taille des exosomes devient disponible de manière semi-automatisée.