Évaluation de la fonction vésiculaire extracellulaire au cours de l’Infection palustre

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la fonction des vésicules extracellulaires libérées par les globules rouges infectés par le parasite du paludisme. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du paludisme, telles que la façon dont les parasites régulent la communication parasite-hôte. Le principal avantage de cette technique est la visualisation de l’arbitage vésiculaire par les cellules indoterot sous étude de la fonction régulatrice de l’ARN vésiculaire par les cellules indoterot.

Mya Alondez, Smartin Bagu et Bayo Babatunde, tous des étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Dans un tube de micro-centrifugeuse, ajoutez 100 microgrammes de vésicules extracellulaires et un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, centrifugez les vésicules extracellulaires à une vitesse maximale de 20 000 fois g pendant sept minutes pour former une pastille.

Une fois la centrifugation terminée, jeter le surnageant sans déranger la pastille. Dissoudre ensuite la pastille de vésicule extracellulaire dans 100 microlitres de dilumate C.To assurer un mélange complet, le pipeter plusieurs fois. Ensuite, dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse, ajoutez quatre microlitres de la solution de colorant éthanolique PKH67 à 100 microlitres de C. Ensuite, tourbillonnez bien le mélange.

Préparez la solution de colorant 2XPKH67 de 40 micromolaires juste avant le processus de coloration. Combinez ensuite rapidement 100 microlitres de deux suspensions vésiculaires extracellulaires avec un volume égal de solution de colorant éthanolique PKH67. Ensuite, pipetez le mélange 10 fois pour assurer un bon mélange.

Une fois le mélange terminé, incubez la solution de colorant vésiculaire extracellulaire et éthanolique PKH67 pendant cinq minutes à l’abri de la lumière. Au cours de l’incubation, continuez à faire tourbillonner le mélange trois à quatre fois. Pour arrêter la réaction de coloration, ajoutez 200 microlitres de sérum au mélange et incubez pendant une minute pour que l’excès de colorant se lie.

Ensuite, lavez trois fois les vésicules extracellulaires avec une solution saline tamponnée au phosphate. Après le lavage, centrifugez l’échantillon à 20 000 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, dissolvez la pastille vésiculaire extracellulaire dans 100 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate pour atteindre une concentration finale d’un microgramme par microlitre.

Transférez les cellules endothéliales dans un millilitre de milieu de croissance complet des cellules endothéliales dans une lamelle recouverte de polyélène. Laissez les cellules développer une monocouche sur la lamelle. Une fois la monocouche formée, retirez soigneusement le milieu et ajoutez un millilitre de milieu frais pour laver les cellules deux fois.

Ajoutez ensuite 50 microgrammes de vésicules extracellulaires colorées à PKH67 dans la lamelle et incubez pendant quatre heures. Après l’incubation, aspirez le milieu. Pour éliminer toutes les vésicules extracellulaires non liées, lavez trois fois les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate.

Un grand soin doit être pris lors de la manipulation de la coloration des lamelles à l’aide de pinces fines pour éviter la perte de cellules et la rupture de la lamelle. Après le lavage, utilisez trois pour cent de solution de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate pour fixer les cellules pendant 15 minutes. Encore une fois, lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate trois fois et ajoutez 250 microlitres de tritan à 0,1 pour cent x 100 dans une solution saline tamponnée au phosphate pour perméabiliser les cellules et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, lavez trois fois les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate et ajoutez 400 microlitres de tampon de blocage aux cellules. Ensuite, incubez les cellules à température ambiante pendant trente minutes pour éviter une liaison non spécifique. Après le blocage, lavez une fois les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate.

Diluez ensuite cinq microlitres de solution mère de phalloïde dans 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate avec un pour cent d’albumine sérique bovine pour préparer la solution de coloration pour chaque lamelle. Ajoutez ensuite 200 microlitres de la solution de coloration sur la lamelle et incubez à température ambiante pendant 20 minutes. Une fois l’incubation terminée, lavez trois fois les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate.

Utilisez ensuite la concentration finale de deux microgrammes par millilitre de 3342 crocheté dans 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate pour contre-colorer l’ADN pendant 30 secondes. Après la coloration, ajoutez 400 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate pour laver deux fois la lamelle. Ensuite, soulevez délicatement la lamelle à l’aide d’une pince et retournez-la sur le dessus d’une goutte de support de montage anti-décoloration sur une lame de verre.

Utilisez un mouchoir pour enlever délicatement tout excès de support, puis scellez l’environnement avec du vernis à ongles. Il faut également faire très attention à ne pas exposer les cellules à une trop grande quantité de colorant pendant la microscopie pour éviter le blanchiment cellulaire. Dans un insert de culture tissulaire de 24 puits avec une taille de coulée de 0,4 micromolaire, ensemencez des cellules endothéliales.

Laissez ensuite les cellules se développer dans la culture pendant cinq jours sans être dérangées pour former une monocouche différenciée. Changez de support tous les deux jours. Une fois la monocouche formée, ensemencez 50 microgrammes dans un millilitre de vésicules extracellulaires sur la chambre supérieure.

Ajoutez ensuite 20 milligrammes par millilitre de rotomine dextran dans le puits supérieur et incubez à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Surveiller la migration du dextran fluorescent vers le fond du puits en mesurant la mission de fluorescence à partir de 40 microlitres d’avoquate moyen. Programmez ensuite la longueur d’onde d’excitation à 544 nanomètres et la longueur d’onde d’émission à 590 nanomètres pour un lecteur de micro-plaques multi-étiquettes.

Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules. Ensuite, ré-suspendez les cellules endothéliales dans un milieu de culture endothéliale complet et ensemencez les cellules dans une plaque de 96 puits dans 100 microlitres de milieu de croissance des cellules endothéliales. Pour atteindre une concentration de 0,1 à dix microgrammes par millilitre, ajoutez 100 microlitres de milieu contenant des antibiotiques.

Surveillez la viabilité des cellules tous les deux jours à l’aide d’un objectif 20 fois au microscope optique. Continuez à cultiver les cellules pendant encore 10 à 14 jours et remplacez le milieu contenant l’antibiotique tous les deux à trois jours, en fonction de la croissance cellulaire. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de réactif MTS dans chaque puits et mélangez le réactif.

Incuber la plaque à 96 puits à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Au bout de quatre heures, agitez brièvement la plaque sur un shaker. Lisez ensuite les absorbants des cellules traitées et non traitées à l’aide d’un lecteur de plaques à 490 nanomètres.

Un jour avant la transduction lentivirale, ensemencez les cellules endothéliales dans un millilitre de milieu complet. Attendez que les cellules atteignent 50 à 80 % de confluence pour la transduction lentivirale Avant d’ouvrir le tube, faites tourner la suspension lentivirale à 200 fois g pendant 30 secondes pour éviter le débordement. Ajoutez ensuite du bromure d’hexidiméthyryne dans les cellules pour ajuster à une concentration finale de huit microgrammes par millilitre et faites tourner doucement la plaque.

Ajoutez le lentivirus dans les cellules et faites à nouveau tourner doucement la plaque pendant 30 secondes pour assurer un bon mélange. Pour augmenter l’efficacité de la transduction lentivirale, centrifugez le mélange cellule-viral à 300 fois g pendant 45 minutes à température ambiante. Ensuite, incubez le mélange cellule-viral à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, jeter le milieu contenant la particule virale et le remplacer par un milieu de culture préchauffé, frais et complet. Le deuxième jour, commencez la sélection de puromycine. Remplacez le milieu de culture complet par un milieu contenant de la puromycine.

Après avoir sélectionné la puromycine, récoltez les cellules. En suivant les instructions du fabricant, isolez l’ARN des cellules à l’aide d’un kit d’isolement d’ARN. Utilisez un kit de transcription inverse pour isoler l’ADN complémentaire avec les micro-ARN sélectionnés.

Configurez ensuite la réaction PCR quantitative. Pour surveiller l’internalisation des vésicules extracellulaires par les cellules endothéliales, des vésicules vertes marquées PKH67 ont été analysées par microscopie confocale. Dans le dosage, la faloudine et le crochet 33342, dont les colorants agissent respectivement en rouge et en bleu nucléide, sont utilisés pour suivre la translocation des vésicules à l’intérieur des cellules endothéliales.

Les images confocales obtenues montrent une absorption immédiate des vésicules par les cellules endothéliales après quatre heures. Ensuite, pour étudier la perméabilité de la capacité de diffusion monocouche des cellules endothéliales de la rodamine b, l’isothyosionadedextran a été analysé. Ce test montre que l’incubation des cellules endothéliales avec 50 et 100 microgrammes par millilitre de vésicules extracellulaires augmentait la perméabilité de la monocouche endothéliale après deux heures.

Dans le graphique, l’axe des x représente la concentration des vésicules extracellulaires et l’axe des y représente les changements de pli dans la perméabilité endothéliale lue à 590 nanomètres. Ensuite, pour déterminer la sensibilité des cellules endothéliales avec le traitement à la puromycine, une courbe de destruction a été tracée. La courbe de destruction montre que moins de 0,15 microgramme par millilitre de puromycine est suffisant pour tuer toutes les cellules.

De plus, pour déterminer le niveau d’expression du micro-ARN451a isolé des cellules endothéliales, une PCR quantitative en temps réel a été effectuée. Les diagrammes à barres montrent une surexpression significative du transcrit micro-ARN451a contre le gène de la femme de ménage U6. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies infectieuses pour explorer le rôle des Evs dans l’interaction de l’hôte et la communication cellulaire via le transfert de matériel génétique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser l’absorption de l’EV par les cellules réceptrices et d’étudier la fonction de l’ARN dans la régulation des cellules endothéliales.

N’oubliez pas que travailler avec les parasites du paludisme et le sang humain peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants, une blouse de laboratoire et le travail sous une cagoule stérile, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.