Criblage de la mort cellulaire à l’aide de la coloration DAPI : une méthode de dépistage rapide de la mort cellulaire clonogénique induite par l’IR dans des lignées cellulaires cancéreuses

L’exposition à des rayonnements ionisants tels que les rayons X peut causer des dommages à l’ADN, conduisant éventuellement à la mort cellulaire. Pour dépister l’effet des rayonnements ionisants sur les profils de mort cellulaire, commencez par prendre une boîte de culture contenant des cellules cancéreuses adhérentes placée sur la surface d’une lamelle.

Irradiez la boîte de culture avec des rayons X pendant la durée souhaitée. Ce traitement provoque des dommages à l’ADN à l’intérieur des cellules. Ensuite, aspirez le milieu usagé de la boîte de culture et ajoutez un fixateur approprié. Cette solution pénètre dans les cellules et verrouille les composants cellulaires en place lors des étapes de coloration suivantes.

Jetez la solution fixatrice. Retirez de la boîte de culture la lamelle contenant les cellules traitées aux rayons X. Retournez la lamelle et placez-la sur la surface d’une lame de verre portant une goutte de colorant DAPI dessus de sorte que les cellules soient en contact direct avec le DAPI.

Les molécules DAPI pénètrent dans les noyaux et se lient aux sites riches en A-T de l’ADN. Maintenant, visualisez les cellules sous un microscope à fluorescence. Les noyaux apparaissent bleus et présentent des morphologies distinctes.

Les cellules présentant des noyaux condensés et fragmentés sont indicatives de l’apoptose, la mort cellulaire programmée. D’autres présentant des noyaux à lobes multiples représentent que les cellules subissent une catastrophe mitotique. Ceux dont les noyaux sont aplatis et qui présentent de multiples points brillants suggèrent des cellules en cours de sénescence.

Prélever les cellules de l’incubateur et aspirer le milieu de culture de la boîte de culture. Coupez la pointe d’une micropipette de 1 000 microlitres à environ 5 millimètres de l’extrémité à l’aide de ciseaux et utilisez-la pour ajouter 1 millilitre de solution de fixation dans la boîte de culture.

Appliquez la solution de fixation le long des parois de la boîte de culture pour minimiser les dommages aux cellules. Ensuite, transférez cette boîte de culture dans une boîte de culture carrée et secouez-la doucement pour répartir uniformément la solution de fixation sur la lamelle. Après cela, incubez le plat pendant 10 minutes à température ambiante.

Aspirez la solution de fixation du plat. Maintenant, ajoutez 2 millilitres de PBS le long des parois du plat, puis aspirez le PBS. Pour vous préparer à la coloration DAPI, ajoutez 5 microlitres de réactif de coloration DAPI sur une lame de verre. Ensuite, retirez la lamelle du plat à l’aide d’un scalpel et égouttez l’excès de PBS sur la lamelle en touchant le bord de la lamelle avec une serviette en papier.

Maintenant, montez la lamelle à l’envers sur la goutte de réactif de coloration DAPI sur la lame de verre afin que les cellules soient exposées au réactif de coloration DAPI. Enfin, examinez les cellules colorées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre DAPI.