Name: Préparation de lignées cellulaires pour Knockdown conditionnelle de lexpression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par E4orf4 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Découvrez comment préparer des lignées cellulaires avec knockdown conditionnel d'Acf1 ou SNF2h par shRNA inductible à la doxycycline. Cette méthode permet d'évaluer l'impact de la déplétion des sous-unités ACF sur la mort cellulaire induite par E4orf4.

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Ce travail a été financée (en partie) par la Fondation ISRAEL SCIENCES (Grant 399/11), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le cadre de la coopération germano-israélienne Projet (DIP), et par l&#39;Institut de la famille Rappaport pour la recherche en des sciences médicales.

1. Génération de lignées cellulaires inductibles <ol><li> Avant l&#39;expérience on a besoin pour trouver la concentration minimale du médicament G418 qui tue toutes les cellules utilisées pour la préparation des lignées cellulaires souhaités. A cet effet, la plaque les cellules de choix dans plusieurs plaques en double à 70% de confluence dans le milieu qui sera utilisé lors de l&#39;expérience et d&#39;ajouter des concentrations croissantes de G418 (0-1,000 ug par ml). Surveiller les cellules quotidiens afin de déterminer la concentration minimale G418 qui tue les cellules de façon efficace. La mort cellulaire est observée dans les 3-7 jours. </li><li> Avant de génération de lignées cellulaires, il est recommandé de vérifier par des essais de transfection transitoire que le plasmide exprimant le shRNA peut réduire dans une certaine mesure l&#39;expression du gène à l&#39;étude. Cela peut être fait dans n&#39;importe quelle lignée de cellules qui peuvent être efficacement transfectées. </li><li> Plate T-Rex-293 cellules à une densité d&#39;environ 5x10 6 cellules par plaque de 10 cm dans 8 ml de milieu DMEM (contenant 10% de Tet sytige FBS approuvé, 2 mM de L-glutamine, 100 unités par ml de pénicilline et de la streptomycine 0,1 mg par ml, 5 mg par ml blasticidine). Incuber les plaques pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Le lendemain, changer le milieu à 8 ml de milieu frais avant la transfection. </li><li> Transfecter les cellules en utilisant 10 mg de plasmide GFP + pSuperior.neo Acf1 (figure 1) de codage ou SNF2h shRNA dirigée par un promoteur inductible par la tétracycline H1, ainsi que le gène de résistance à la néomycine fusionnée à la GFP et entraîné par un promoteur constitutif PGK. Ajouter l&#39;ADN à 500 ul de 150 mM de NaCl. Ajouter le réactif jetPIE à une autre partie aliquote de 500 pl de 150 mM de NaCl à 2 l par ug d&#39;ADN. Ajouter la solution jetPIE à l&#39;ADN et bien mélanger au vortex. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Pipeter doucement complexes ADN sur les plaques de 10 cm contenant 70-80% des cellules confluentes. Remettre les plaques dans l&#39;incubateur. </li><li> Le lendemain, remplacer le milieu avec un milieu sélectif (milieu DMEM quedécrit ci-dessus contenant un supplément de 500 ug par ml de G418). </li><li> Pour les deux prochaines semaines surveiller les cellules et remplacer le milieu sélectif d&#39;une matière similaire frais tous les 3-4 jours jusqu&#39;à ce que les colonies apparaissent et peuvent être visualisées sans microscope. </li><li> Avant d&#39;isolement de colonies, de préparer des plaques 24 puits avec un milieu sélectif. </li><li> Identifier les colonies de l&#39;oeil, et marquer leur emplacement dans le bas de la plaque à l&#39;aide d&#39;un marqueur de couleur. Vérifiez sous le microscope que les colonies sont bien séparés. </li><li> Dans la hotte stérile, aspirer le support de la plaque, les rincer doucement avec du PBS chaud et aspirer ainsi tout le liquide restant. Ajouter 3 pi de 0,25% de trypsine / EDTA à une colonie sur la plaque. Pipeter la trypsine à plusieurs reprises jusqu&#39;à ce que les cellules se détacher et de les ajouter à l&#39;un des puits de la plaque 24-puits. Répétez cette opération pour plusieurs autres colonies sur la plaque. </li><li> Cultiver les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 jusqu&#39;à remplir le puits. Puis diviser les cellules dérivées dechacune des colonies d&#39;origine dans trois puits, chacun dans un document distinct plaque de 12 puits et incuber pendant la nuit. </li><li> Le jour suivant, remplacez le support dans une plaque avec un milieu contenant 1 ug par ml de doxycycline à partir d&#39;une solution mère préparée dans de l&#39;eau bidistillée (1-5 mg par ml). Remplacer le milieu dans une plaque de commande avec un milieu sans doxycycline. Incuber les cellules pendant 72 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Récolte des cellules de l&#39;une traitée et l&#39;autre non traité et de chaque clone de cellules pour la préparation des extraits protéiques et l&#39;analyse Western blot pour déterminer l&#39;efficacité de Acf1 ou knockdown SNF2h. Utiliser des anticorps à Acf1 ou SNF2h ainsi que des anticorps contre l&#39;alpha-tubuline, servant de témoin de charge. Utiliser les cellules dans le troisième puits, elle n&#39;est pas traitée, pour l&#39;expansion de clones de cellules sélectionnées dans laquelle la doxycycline outre conduit à au moins 50% de réduction dans le niveau de la protéine étudiée. Congeler des aliquotes de ces cellules dans 90% de FBS, 10% de DMSO pour une utilisation ultérieure. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Induction de knockdown et transfection <ol><li> Cellules de la plaque dans le milieu sélectif dans des plaques de 10 cm. Ajouter la doxycycline à 1 ug par ml de la moitié des plaques et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 48-72 heures (voir Figure 4). </li><li> Après 48-72 heures, trypsiniser les cellules de chaque groupe de cellules, les compter, et plaque 1.5x10 6 cellules par plaque de 6 cm dans le même milieu, avec ou sans doxycycline. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant la nuit. Plan de telle sorte que chaque groupe de plaques de la section 2.1 fournit les cellules pendant douze plaques 6 cm, dont deux doubles pour le dosage DAPI pour chaque point ainsi que d&#39;une plaque pour analyse par Western blot de chaque échantillon (voir figure 4). </li><li> Le jour suivant la transfection des cellules dans des plaques 6 cm avec les combinaisons suivantes de plasmides: 1 pg d&#39;un plasmide vide ou une quantité identique de l&#39;plasmide codant pour E4orf4, avec 4 pg d&#39;un vecteurexprimant la GFP ou Acf1-SNF2h-GFP rendues résistantes à la shRNA dans les clones cellulaires par introduction de mutations silencieuses, ou 3 pg du vecteur correspondant vide et 1 ug plasmide exprimant la GFP (figure 4). Utilisez le réactif jetPIE comme décrit plus haut (10 pi par 5 pg d&#39;ADN) pour préparer le mélange de transfection. Pour chaque échantillon, préparer un mélange de transfection pour trois plaques. </li><li> Après une incubation de 15 min de l&#39;ADN avec le réactif jetPIE à la température ambiante, doucement pipeter des quantités égales de complexes d&#39;ADN de chaque mélange de transfection sur trois plaques 6 cm et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant la nuit. </li></ol> 3. Essai DAPI dans les cellules transfectées <ol><li> Le lendemain, extraire des protéines d&#39;une plaque par échantillon pour analyse par Western blot pour déterminer que Acf1 ou SNF2h ont été efficacement renversé et que E4orf4 a été exprimée également dans les différents échantillons. </li><li> Aspirer le fluide à partir des plaques destinées à la DAPItest, lavez délicatement les plaques avec du PBS et ajouter 1 ml de paraformaldéhyde 4% préparée dans du PBS pour couvrir les cellules. Préparation de la solution de paraformaldéhyde et le traitement des cellules avec ce produit chimique doit être effectuée sous une hotte chimique. Incuber pendant 15 min à température ambiante sans agitation. </li><li> Aspirer le paraformaldéhyde et laver trois fois avec du PBS, se balançant à la température ambiante pendant 5 min à chaque fois. Ajouter l&#39;éthanol à 80% conservé à -20 ° C et incuber à 20 ° C pendant au moins 1 heure. Les plaques peuvent être maintenus sous l&#39;éthanol à -20 ° C pendant plusieurs jours dans la mesure où ils sont bien scellé pour empêcher l&#39;évaporation d&#39;éthanol et séchage. </li><li> Aspirer l&#39;éthanol et laver les cellules deux fois avec du PBS et une fois avec du PBS-BT (PBS contenant 0,5% de BSA et 0,05% de Tween-20), se balançant à la température ambiante pendant 5 minutes à chaque fois. </li><li> Pour empêcher la liaison d&#39;anticorps non spécifique, les cellules bloquer dans 1 ml de PBS-BT tampon contenant du sérum de chèvre à 10% pendant 20 min tout en basculant à température ambiante. Puis, lavez til cellules deux fois dans du PBS-BT, à 5 min à chaque lavage. </li><li> Incuber les cellules avec l&#39;anticorps primaire (un anticorps spécifique E4orf4 dans notre cas) dans 1 ml de PBS-BT pendant 1 heure tout en balançant à la température ambiante. Puis laver deux fois dans du PBS-BT et une fois dans du PBS contenant 0,1% de BSA, 5 min pour chaque lavage. </li><li> Incuber les cellules dans 1 ml de PBS-BSA 0,1% contenant le cas échéant d&#39;anticorps secondaire marqué par fluorescence et 0,5 ug par ml concentration finale de DAPI à 40 min tout en basculant à température ambiante dans l&#39;obscurité. Ensuite laver avec du PBS pendant 5 min, bien sécher par aspiration et maintenir les plaques à l&#39;envers pendant une heure supplémentaire ou toute la nuit pour obtenir un séchage complet. Ensuite, montez diapositives couverture sur les cellules, en utilisant Fluoromount-G solution. Conserver les plaques à 4 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;au moment de compter les noyaux apoptotiques. </li><li> Demandez à un collègue afin d&#39;identifier les différentes plaques par de nouveaux numéros, comptant noyaux apoptotiques dans les différents échantillons peut être fait d&#39;une manière impartiale. </li><li> Visualisez les cellules sous un upright microscope à fluorescence à un grossissement de 400X (dans l&#39;air) ou 630X (dans de l&#39;huile d&#39;immersion). Identifier les cellules transfectées qui sont colorées pour les différentes protéines exprimées dans chaque échantillon, et de compter le nombre de noyaux condensés ou fragmentés visualisés par coloration DAPI à l&#39;intérieur de la population de cellules transfectées. Surveiller plusieurs domaines et compter un total d&#39;au moins 200 cellules transfectées. </li><li> Calculer le pourcentage de noyaux avec une morphologie apoptotique au sein de la population de cellules transfectées. Répétez l&#39;expérience, avec des doublons, 2-3 fois pour calculer la signification statistique des changements entre les différents échantillons. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs L&#39;efficacité des colonies dans lesquelles l&#39;obtention knockdown conditionnelle de l&#39;expression du gène a été couronnée de succès est variable, en fonction du gène impliqué. Dans nos mains, nous avons obtenu 7 colonies succès sur 12 testées pour Acf1 et 6 sur 18 pour SNF2h. Figure 2 shux une plaque représentant des clones de cellules sélectionnées (Figure 2A), ainsi que d&#39;une colonie unique (figure 2B). Figure 3 montre un transfert représentant préparés avec des protéines extraites de cellules de différents clones cultivés en présence ou en l&#39;absence de la doxycycline pendant 72 heures. Le transfert a été colorées avec des anticorps à SNF2h et à l&#39;alpha-tubuline, servant de témoin de charge. Deux des clones (n ° 4 et 5) ont montré une forte diminution des niveaux d&#39;induction SNF2h sur la doxycycline. Il est à noter que bien que le plasmide GFP + pSuperior.neo (figure 1) utilisé pour la production de lignées cellulaires code pour une protéine de fusion GFP-néo, la fluorescence verte dans les lignées cellulaires stables était très faible et l&#39;expression d&#39;autres protéines de fusion GFP introduit de façon transitoire dans ces cellules pourrait être facilement détectée au-dessus de la fluorescence verte de fond. Une représentation schématique des expériences menées dans les clones cellulaires pour mesurerque l&#39;effet de Acf1 ou knockdown SNF2h sur la mort cellulaire induite par E4orf4 est montré dans la Fig. 4. Le temps nécessaire pour abattre l&#39;expression des gènes par la doxycycline peut varier en fonction de la stabilité de la protéine dont les niveaux devraient être réduits. Pour Acf1 et SNF2h, un traitement 72 heures a été nécessaire pour abattre efficace au niveau protéique. La figure 5 montre un exemple de cellules exprimant la GFP et E4orf4 et subissant une mort cellulaire se manifeste par l&#39;apparition de DAPI-noyaux colorés avec une morphologie condensé ou fragmenté. La figure 6 montre les résultats d&#39;une expérience représentative démontrant que la doxycycline induite Acf1 knockdown conduit à une augmentation de E4orf4 stimulée par la mort cellulaire (figure 6A). Cette augmentation ne résulte pas d&#39;une augmentation des niveaux de E4orf4 (figure 6B). Par ailleurs, la restauration de Acf1 aux cellules induites par la doxycycline réduit l&#39;augmentation de la toxicité E4orf4 aux niveaux<html> observée dans les cellules non induites (Figure 6). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> Figure 1. Carte du plasmide GFP + pSuperior.neo. La carte montre le promoteur H1 inductible par la tétracycline entraîner l&#39;expression shRNA et l&#39;expression promoteur PGK de conduite d&#39;une protéine de fusion GFP-néo. La carte a été adapté à partir du manuel OligoEngine pSuperior. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> Figure 2. Images d&#39;identification de colonies résistantes à la néomycine. D&#39;une plaque contenant des colonies (A) et d&#39;une colonie unique (B) sont affichées. Les colonies ont été obtenues par culture des cellules pendant 14 jours dans un milieu sélectif contenant de la néomycine. ys &quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> Figure 3. Les cellules d&#39;examen de l&#39;efficacité knockdown dans les colonies sélectionnées. Plusieurs colonies de sélection en présence de néomycine ont été étalées dans des puits en double. Un puits de chaque échantillon a été induite par la doxycycline (+) et un puits a été laissée non traitée (-). Les protéines ont été extraites 72 h après l&#39;induction et chromatographie sur gel SDS-PAGE. Le Western blot a été coloré avec des anticorps successivement à SNF2h et à l&#39;alpha-tubuline (servant de témoin de charge) et montre les niveaux SNF2h dans les cellules induites et de contrôle. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> Figure 4. Planification d&#39;un essai typique expérience knockdown-DAPI. Étapes successives de l&#39;expérience sont présentés, y compris le traitement doxycycline pour atteindre Acf1 ou knockdown SNF2h, une transfection à restaurer Acf1 ou SNF2h expression ou d&#39;introduire un empté vecteur et d&#39;introduire E4orf4 ou son vecteur vide correspondant dans les cellules, et l&#39;analyse des résultats. Doxycycline traités plaques sont indiqués en rouge (Dox) et les plaques de contrôle sont marqués en bleu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> Figure 5. Les cellules de détection de la mort cellulaire induite par E4orf4 par le test DAPI. Qui ont subi divers traitements décrits dans la figure 4 ont été fixées et colorées avec des anticorps spécifiques de E4orf4 et DAPI pour visualiser les noyaux des cellules transfectées. Sur cette photo a été prise à partir d&#39;un échantillon contenant E4orf4 et la protéine GFP contrôle. (A) la GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) des images fusionnées. Les flèches blanches marque de GFP et E4orf4 cellules transfectées contenant des noyaux avec des morphologies apoptotiques. Les flèches rougesmarquer les noyaux avec des formes irrégulières qui ne sont pas comptés comme des noyaux apoptotiques. Les astérisques noyaux mitotiques marque ou noyaux qui viennent divisée. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> Figure 6. Acf1 knockdown améliore la mort cellulaire induite par E4orf4. (A) Les cellules de la lignée cellulaire T-rex-293-dérivée exprimant Acf1-shRNA partir d&#39;un promoteur inductible par la tétracycline ont été induites par la doxycycline (+ Dox) ou non traitée (-Dox). Trois jours plus tard, les cellules ont été transfectées avec des plasmides exprimant E4orf4 (+ E4orf4) ou un vecteur vide (-E4orf4) avec un vecteur vide ou un plasmide exprimant la GFP Acf1-étiqueté, qui a été rendu résistant à la shRNA par l&#39;introduction de silence mutations. Les cellules ont été fixées 24 heures après la transfection et colorées avec des anticorps pour E4orf4 et au DAPI. L&#39;induction de la mort cellulaire a été mesurée par le test DAPI décrit ci-dessus et le pourcentage of cellules transfectées avec des noyaux condensés ou fragmentés a été déterminée. Une expérience représentative de trois répétitions est affiché, et les barres d&#39;erreur représentent la déviation standard. (B) Les cellules de plaques parallèles ont été récoltés pour analyse par Western blot. Le transfert a été colorées avec des anticorps à E4orf4, la GFP, et Acf1. Le Acf1 endogène et Acf1-GFP sont présentés dans deux panneaux distincts.

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<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li>
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<li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Knockdown de l&#39;expression génique spécifique est une approche importante pour l&#39;enquête de la contribution d&#39;une protéine de voies de régulation. Depuis knockdown de l&#39;expression constitutive de gènes essentiels affecte négativement la prolifération cellulaire, leur étude peut exiger soit l&#39;introduction transitoire de siRNA ou l&#39;application de systèmes stables knockdown conditionnelles. Génération de lignées cellulaires stables avec la capacité d&#39;origine médicamenteuse expression de shRNA déc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Glucose à haute DMEM </td><td> Gibco </td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet système FBS approuvé </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Pen Strep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-rex-293 cellules </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> blasticidine </td><td> InvitRogen </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> pSuperior.neo + plasmide GFP </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Transfection Polyplus </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> doxycycline </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldéhyde </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de lignées cellulaires pour knockdown conditionnelle de l&#39;expression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par e4orf4

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Inactivation fonctionnelle de l&#39;expression des gènes dans les cellules de mammifères est essentielle pour l&#39;étude de la contribution d&#39;une protéine d&#39;intérêt à 1,2 voies différentes. Toutefois, démontable conditionnelle de l&#39;expression du gène est nécessaire dans les cas où knockdown constitutif n&#39;est pas tolérée par les cellules pour une longue période de temps 3-5. Nous décrivons ici un protocole de préparation de lignées cellulaires permettant knockdown conditionnelle de sous-unités du facteur de remodelage de la chromatine ACF. Ces lignées de cellules de faciliter la détermination de la contribution de ACF à induction de la mort cellulaire par la protéine E4orf4 d&#39;adénovirus 6. Des séquences codant pour les ARN en épingle à cheveux courts pour les sous-unités et Acf1 SNF2h du facteur ACF remodelage de la chromatine ont été clonés à côté d&#39;un promoteur inductible par la doxycycline dans un plasmide contenant un gène également pour le gène de résistance à la néomycine. Clones de cellules résistantes à la néomycine ont été sélectionnées en présence de G418 et isolées. Les lignées de cellules résultants ont été induite partraitement par la doxycycline, et une fois Acf1 ou les niveaux d&#39;expression SNF2h ont été réduits, les cellules ont été transfectées avec un plasmide codant pour E4orf4 ou un vecteur vide. Pour confirmer l&#39;effet spécifique des constructions shRNA, la teneur en protéines Acf1 ou SNF2h ont été restaurés à des niveaux WT par co-transfection avec un plasmide exprimant Acf1 ou SNF2h qui ont été rendues résistantes à l&#39;shRNA par l&#39;introduction de mutations silencieuses. La capacité de E4orf4 pour induire la mort des cellules dans les différents échantillons a été déterminée par un dosage DAPI, dans lequel la fréquence d&#39;apparition des noyaux avec des morphologies apoptotiques dans la population de cellules transfectées a été mesurée 7-9. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour la détermination de la contribution fonctionnelle des différentes protéines à l&#39;induction de la mort cellulaire par leurs partenaires protéiques dans les cas où knockdown constitutif peut être mortelle cellule.

Contribution du facteur de remodelage de la chromatine ACF à la mort cellulaire induite par E4orf4 a été mesurée. Le protocole comprend la sélection de clones cellulaires dans lesquelles le traitement doxycycline induit knockdown conditionnelle de sous-unités ACF du Acf1 et SNF2h, et l&#39;utilisation du test DAPI pour mesurer la mort cellulaire induite par E4orf4 dans les lignées cellulaires inductibles.

Préparation de lignées cellulaires pour Knockdown conditionnelle de l&#39;expression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par E4orf4

L'inactivation fonctionnelle de l'expression génique dans les cellules de mammifères est cruciale pour l'étude de la contribution d'une protéine d'intérêt à divers...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'effet de l'extinction d'ACF one ou de SNF two H sur la mort cellulaire induite par E four or four. Ceci est réalisé par la génération de lignées cellulaires dans lesquelles l'expression de l'ARNi ciblant ACF one ou SNF two H est activée de manière conditionnelle par l'ajout de doxycycline, entraînant une réduction des niveaux de la protéine ACF one ou SNF two H. Dans une deuxième étape, les cellules des lignées obtenues sont traitées avec de la doxycycline afin de réduire l'expression d'ACF one ou de SNF two H, ou restent non traitées.Ensuite, E quatre ou quatre est exprimé dans les cellules avec ou sans ACF un ou SNF deux H résistant à la S-H-R-N-A. Afin d'étudier l'effet d'ACF un ou SNF deux H sur la mort cellulaire induite par E quatre ou quatre, des résultats sont obtenus qui montrent l'impact des niveaux d'ACF un ou SNF deux H sur la toxicité d'E quatre ou quatre, basée sur le comptage des noyaux présentant une morphologie apoptotique à l'aide du test JY. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que la transfection transitoire d'ARN, est que toutes les cellules expriment la S-H-R-N-A et que le pourcentage de cellules coexprimant conjointement avec le plasmide traditionnel est plus élevé. Cette méthode permet de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la mort cellulaire induite par if 4 0 4, mais elle peut également être appliquée à l'étude d'autres protéines pro-apoptotiques.En plus d'Ana Lafe, un chercheur de mon laboratoire démontrera certaines parties de cette procédure. Pour commencer la procédure de génération de lignées cellulaires inductibles, ensemencer les cellules T-Rex 293 à une densité d'environ cinq fois 10⁶ cellules par plaque de 10 centimètres dans huit millilitres de DMEM contenant du sérum, sans tétracycline et avec cinq microgrammes par millilitre de bléomycine, puis incuber les plaques toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, remplacer le milieu par huit millilitres de milieu frais avant la transfection. Le plasmide utilisé pour la transfection est le plasmide pSuperior-neo plus GFP, codant pour ACF1 ou SNF2H-SH-RNA, sous le contrôle d'un promoteur H1 inductible par la tétracycline, ainsi que le gène de résistance à la néomycine fusionné au GFP, sous le contrôle d'un promoteur PGK constitutif.Ajouter 10 microgrammes d'ADN plasmidique à 500 microlitres de chlorure de sodium à 150 millimolaire et vortexer. Ajouter ensuite le réactif jet PY à raison de deux microlitres par microgramme d'ADN dans un autre tube contenant 500 microlitres de chlorure de sodium à 150 millimolaire et vortexer. Ajouter la solution jet pie à l'ADN et mélanger soigneusement par vortexage.Incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, ajouter délicatement au moyen d'une pipette les complexes d'ADN sur les plaques de 10 centimètres contenant des cellules à une confluence de 70 à 80 %. Les cellules T-Rex 2 9 3 seront mélangées le jour suivant.Remplacez le milieu par un milieu sélectif, dans cet exemple du DMEM comme précédemment, contenant 500 microgrammes par millilitre de G quatre 18. Pendant les deux prochaines semaines, surveillez les cellules. Remplacez le milieu sélectif par un milieu frais similaire tous les trois à quatre jours jusqu'à l'apparition de colonies.Identifier les colonies à l'œil nu et marquer leur emplacement sur le fond de la boîte à l’aide d’un marqueur de couleur. Vérifier au microscope que les colonies sont bien séparées. Les colonies peuvent être isolées dès qu’elles sont suffisamment grandes pour être visualisées sans microscope.Pour la réussite de cette procédure, il est important de choisir des colonies bien séparées lors de l'isolement des colonies. Dans une hotte stérile, aspirez le milieu à partir de la boîte. Rincez délicatement avec du PBS et aspirez soigneusement tout liquide résiduel.Ajoutez trois microlitres de trips à 0,25 % dans l'EDTA à une colonie sur la plaque en pipetant répétitivement les trips jusqu'à ce que les cellules se détachent de la plaque. Transférez les cellules dans un milieu sélectif dans un puits d'une plaque de 24 puits. Répétez cette opération pour plusieurs autres colonies sur la plaque.Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, jusqu'à ce qu'elles recouvrent le puits. Ensuite, diviser les cellules de chaque colonie d'origine en trois puits distincts dans une plaque de 12 puits séparée et incuber toute la nuit le jour suivant. Remplacer le milieu dans une plaque par un milieu contenant un microgramme par millilitre de doxycycline provenant d'une solution mère préparée dans de l'eau doublement distillée.Remplacer le milieu dans une plaque témoin par du milieu sans doxycycline. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Les cellules provenant d'un puits traité et d'un puits non traité sont ensuite récoltées pour une analyse par immunotransfert afin de déterminer l'efficacité de l'extinction d'ACF1 ou de SNF2H ; un résultat représentatif est montré ici.Cette immunotransfert a été marquée avec des anticorps dirigés contre SNF deux H et la tubuline alpha. Cette dernière servant de témoin de chargement pour les deux clones. Les clones numéro quatre et numéro cinq ont montré une forte réduction de SNF deux H après induction par la doxycycline et ont donc été choisis pour être utilisés dans l'expérience d'interférence par ARN, qui sera démontrée dans le prochain segment.Les cellules non traitées de la troisième plaque serviront à amplifier la lignée cellulaire sélectionnée, et des aliquotes de ces cellules seront ensuite congelées. Pour une utilisation ultérieure afin d'induire une inhibition d'ACF un ou de SNF deux, cultiver les cellules en milieu sélectif dans des plaques de 10 centimètres, ajouter de la doxycycline à une concentration de un microgramme par millilitre dans la moitié des plaques et incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant 48 à 72 heures. Chaque groupe de plaques doit fournir suffisamment de cellules pour 12 plaques de six centimètres, incluant deux répliques pour le test DPI pour chaque point, ainsi qu'une plaque destinée à l'analyse par immunotransfert pour chaque échantillon.48 à 72 heures après l'induction, détacher les cellules de chaque groupe à l'aide de trypsine, puis, après les avoir comptées, ensemencer 1,5 fois 10 à la puissance 6 cellules par plaque de six centimètres dans le même milieu, avec ou sans doxycycline. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit ; le jour suivant, transfecter les cellules, comme indiqué.Les cellules non traitées et celles traitées à la doxycycline sont transfectées en triple dans quatre conditions différentes. Une avec un plasmide vide et un plasmide exprimant GFP, deux avec le plasmide vide ainsi qu’un vecteur exprimant ACF résistant à la SHRA, un GFP ou SNF deux HGFP, trois avec un plasmide codant pour E quatre ou quatre et un plasmide exprimant GFP, et quatre avec le plasmide codant pour E quatre, tous les quatre. Après la transfection, incuber toutes les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.Le jour suivant la transfection des cellules, extraire les protéines d'une plaque par échantillon pour une analyse par immunoblot afin de vérifier que ACF un ou SNF deux H a été efficacement inhibé et que E quatre ou quatre a été exprimé de manière équivalente dans les différents échantillons. Les 16 plaques restantes seront utilisées pour le test DPI. Aspirer le milieu des plaques destinées au test DPI et laver délicatement les cellules avec du PBS dans une hotte chimique.Ajoutez un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % préparé dans du PBS pour recouvrir les cellules, puis incubez pendant 15 minutes à température ambiante sans agitation. Aspirez le paraformaldéhyde et rincez avec du PBS en agitant à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez le rinçage deux fois supplémentaires pour un total de trois rinçages ; après le troisième rinçage au PBS, ajoutez de l’éthanol à 80 % conservé à moins 20 degrés Celsius et incubez à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure.Aspirez l'éthanol et lavez les cellules deux fois avec du PBS en agitant à température ambiante pendant cinq minutes à chaque fois, puis une fois pendant cinq minutes à température ambiante avec du PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,05 % de Tween 20 ou P-B-S-B-T. Effectuez également cette étape avec agitation pour éviter la liaison non spécifique des anticorps. Bloquez les cellules dans un millilitre de tampon P-B-S-B-T contenant 10 % de sérum de chèvre pendant 20 minutes, en agitant à température ambiante.Ensuite, laver les cellules deux fois dans du P-B-S-B-T, cinq minutes par lavage. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire, dans ce cas un anticorps spécifique de E quatre ou quatre, dans un millilitre de P-B-S-B-T pendant une heure sous agitation à température ambiante. Puis laver deux fois dans du P-B-S-B-T et une fois dans du PBS contenant 0,1 % de BSA, cinq minutes par lavage.Ensuite, ajoutez aux cellules un millilitre de PBS contenant 0,1 % de BSA et l'anticorps secondaire marqué par un fluorochrome approprié à une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre. Incubez pendant 40 minutes en agitant à température ambiante et à l'abri de la lumière. Enfin, lavez avec du PBS pendant cinq minutes.Séchez le puits par aspiration et maintenez les plaques à l’envers pendant une heure supplémentaire, voire toute la nuit, afin d’obtenir un séchage complet. Recouvrez les cellules avec des lamelles montées en utilisant une solution de montage Flora G. Conservez les plaques à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’au moment du comptage. Les cellules dont les noyaux sont en apoptose, ayant subi les différents traitements décrits dans le protocole, ont été fixées et colorées avec des anticorps spécifiques E four ou four et du DPI afin de visualiser les noyaux des cellules transfectées.Cette figure montre un exemple de cellules exprimant E four or four et GFP. Le panneau A illustre l'expression du protéine GFP témoin seule, et le panneau B montre l'expression de E four or four. Les noyaux marqués par la coloration DAPI sont présentés dans le panneau C, et les images fusionnées apparaissent dans le panneau D. Les flèches blanches indiquent les cellules transfectées exprimant GFP et E.Four or four contenant des noyaux présentant une morphologie apoptotique. Les flèches rouges marquent les noyaux ayant des formes irrégulières qui ne sont pas comptabilisés comme noyaux apoptotiques. L'astérisque marque les noyaux mitotiques ou les noyaux venant de se diviser. Le nombre de noyaux condensés ou fragmentés visualisés par la coloration DAPI a été compté afin de calculer le pourcentage de noyaux présentant une morphologie apoptotique au sein de la population de cellules transfectées, afin de préserver une objectivité optimale du test.Le décompte des noyaux apoptotiques dans les différents échantillons a été effectué de manière aveugle, la personne effectuant le décompte n'étant pas informée de l'identité des échantillons. Un résultat représentatif est présenté dans ce graphique. Des pourcentages plus élevés d'anomalies nucléaires ont été observés dans les cellules exprimant E quatre ou quatre, confirmant que T quatre ou quatre induit la mort cellulaire. Le pourcentage le plus élevé d'anomalies nucléaires a été observé dans les cellules exprimant E quatre ou quatre lorsque les niveaux de ACF un ont été réduits par une inhibition médiée par SHR et a, indiquant que la diminution de ACF un amplifie la mort cellulaire induite par E quatre ou quatre et augmente la toxicité de E quatre ou quatre dans les cellules.Le fait d'exprimer de faibles niveaux d'ACF n'était pas dû à une augmentation des niveaux d'E quatre ou de quatre, comme observé sur le Western blot. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de faciliter un décompte conseillé des noyaux apoptotiques à l'aide de DPI et d'appliquer des critères stricts pour l'identification de ces noyaux. En complément de cette procédure, d'autres méthodes telles que les essais clonogéniques peuvent être réalisées afin de valider les résultats de l'essai DA pse après cette procédure.D'autres méthodes, comme les dosages de co-immunoprécipitation, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, s'il existe une interaction physique entre les protéines étudiées.

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