Préparation de lignées cellulaires pour Knockdown conditionnelle de l'expression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par E4orf4

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer l’effet de l’inactivation de l’ACF un ou du SNF deux H sur la mort cellulaire induite par E, quatre ou quatre. Ceci est réalisé par la génération de lignées cellulaires dans lesquelles l’expression de l’ARNs ACF un ou SNF deux H est activée conditionnellement par l’ajout de doxycycline, ce qui entraîne une réduction des niveaux de protéine H ACF un ou SNF deux dans un deuxième temps. Les cellules des lignées cellulaires obtenues sont traitées avec de la doxycycline pour réduire l’expression de l’ACF un ou du SNF deux H ou ne sont pas traitées.

Ensuite, E quatre ou quatre est exprimé dans les cellules avec ou sans résistance à S-H-R-N-A ACF one ou SNF 2 H.In afin d’étudier l’effet de ACF un ou SNF deux H sur E, quatre ou quatre résultats de mort cellulaire induite sont obtenus qui montrent l’impact des niveaux d’ACF un ou de SNF deux H sur la toxicité de E quatre ou quatre sur la base du comptage des nucléos avec morphologie apoptotique à l’aide du test JY. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que la transfection transitoire des ARN, est que toutes les cellules expriment le S-H-R-N-A et que le pourcentage de cellules co-exprimant avec le plasmide traditionnel est plus élevé. Cette méthode permet de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la mort cellulaire induite par l’if 4 0, mais elle peut également être appliquée à l’étude d’autres protéines protiques.

En plus d’Ana Lafe, un chercheur de mon laboratoire fera la démonstration de certaines parties de cette procédure Pour commencer la procédure de génération de lignées cellulaires inductibles plaque T-Rex 2, 9, 3 cellules à une densité d’environ cinq fois 10 à six cellules par 10 centimètre, plaque dans huit millilitres de DMEM contenant du sérum sans tétracycline et avec cinq microgrammes, millilitre de blaster de côté dans l’incubation des plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le lendemain. Remplacez le milieu par huit millilitres de milieu frais avant la transfection. Le plasmide de transfection est le plasmide supérieur P neo plus GFP codant pour ACF un ou SNF deux H-S-H-R-N-A, piloté par un promoteur H one inductible par la tétracycline, ainsi que le gène de résistance à la néomycine fusionné avec la GFP et piloté par un promoteur PGK constitutif.

Ajoutez 10 microgrammes d’ADN plasmidique à 500 microlitres de chlorure de sodium et de vortex de 150 millimolaires. Ajoutez ensuite le réactif jet PY à raison de deux microlitres par microgramme d’ADN dans un autre tube contenant 500 microlitres de chlorure de sodium à 150 millimolaires et vortex. Ajoutez la solution de jet-pie à l’ADN et mélangez bien par vortex.

Incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, pipetez doucement les complexes d’ADN sur les plaques de 10 centimètres contenant 70 à 80 % de confluence. T-Rex 2 9 3 cellules un mélange le lendemain.

Remplacez le milieu par un milieu sélectif dans cet exemple DMEM comme précédemment, contenant 500 microgrammes par millilitre de G four 18. Pendant les deux prochaines semaines, surveillez les cellules. Remplacez le milieu sélectif par un milieu frais similaire tous les trois à quatre jours jusqu’à l’apparition des colonies.

Identifiez les colonies à l’œil nu et marquez leur emplacement au bas de la plaque à l’aide d’un marqueur de couleur. Vérifiez au microscope que les colonies sont bien séparées. Les colonies peuvent être isolées une fois qu’elles sont suffisamment grandes pour être visualisées sans microscope.

Pour le succès de cette procédure, il est important de choisir des colonies bien séparées lors de l’isolement de la colonie. Dans une hotte stérile, aspirez le milieu de la plaque. Rincez doucement avec du PBS et aspirez bien tout le liquide restant.

Ajoutez trois microlitres de 0,25 % d’EDTA à une colonie sur la plaque en caressant les déclenchements à plusieurs reprises jusqu’à ce que les cellules se détachent de la plaque. Transférez les cellules dans un milieu sélectif dans un puits dans une plaque de 24 puits. Répétez cette opération pour plusieurs autres colonies sur l’assiette.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles remplissent le puits. Ensuite, divisez les cellules de chaque colonie d’origine en trois puits, chacun dans une plaque séparée de 12 puits et incubez pendant la nuit le lendemain. Remplacer le milieu d’une boîte par un milieu contenant un microgramme par millilitre de doxycycline à partir d’une solution mère préparée dans de l’eau distillée doublement.

Remplacer le milieu dans une plaque de contrôle par un milieu sans doxycycline. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Les cellules d’un puits traité et d’un puits non traité sont ensuite récoltées pour une analyse par transfert Western afin de déterminer l’efficacité de l’ACF un ou du SNF deux H renversé, un résultat représentatif est présenté ici.

Cette tache a été colorée avec des anticorps contre le SNF deux H et l’alpha tubuline. Ce dernier servant de contrôle de chargement à deux des clones. Les numéros quatre et cinq ont montré une forte réduction du SNF deux H lors de l’induction de la doxycycline et sont donc choisis pour être utilisés dans l’expérience de knockdown, qui sera démontrée dans le segment suivant.

Les cellules non traitées de la troisième plaque seront utilisées pour élargir la lignée cellulaire sélectionnée et des aliquotes de ces cellules seront ensuite congelées. Pour une utilisation ultérieure pour induire l’inactivation des cellules à plaque ACF un ou SNF deux H dans un milieu sélectif en plaques de 10 centimètres, ajoutez de la doxycycline à un microgramme par millilitre à la moitié des plaques et incubez 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures. Chaque groupe de plaques doit fournir les cellules pour 12 plaques de six centimètres, y compris deux duplicatas pour le dosage DPI pour chaque point, ainsi qu’une plaque pour l’analyse par transfert Western de chaque échantillon.

48 à 72 heures après l’induction, la trypsine nose les cellules de chaque groupe de cellules et après les avoir comptées, plaque 1,5 fois 10 à la boîte de six cellules par six centimètres dans le même milieu avec ou sans doxycycline. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit le lendemain, transfecter les cellules. Comme indiqué.

Les cellules non traitées et les cellules traitées à la doxycycline sont transfectées en trois exemplaires de quatre manières. L’un avec un plasmide vide et l’autre avec la GFP, deux avec le plasmide vide, ainsi qu’un vecteur exprimant l’ACF résistant à SHRA, une GFP ou SNF deux, l’HGFP, trois, avec un plasmide codant pour E quatre ou quatre, et un plasmide exprimant la GFP et avec le plasmide codant pour E quatre, tous quatre. Et le vecteur exprimant ACF one GFP ou SNF two HGFP résistant à SHRA après transfection incube toutes les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Le lendemain de la transfection des cellules, extraire les protéines d’une plaque par échantillon pour l’analyse par transfert Western afin de déterminer que l’ACF un ou le SNF deux H a été efficacement neutralisé et que E quatre ou quatre a été exprimé de manière égale dans les différents échantillons. Les 16 plaques restantes seront utilisées pour le dosage DPI. Aspirez le milieu des plaques destinées au dosage DPI et lavez doucement les cellules avec du PBS dans un capuchon chimique.

Ajouter un millilitre de 4 % de para formaldéhyde préparé dans du PBS pour couvrir les cellules et incuber pendant 15 minutes à température ambiante sans agiter. Aspirez le paraformaldéhyde et lavez-le en secouant le PBS à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez le lavage deux fois de plus pour un total de trois lavages après le troisième lavage PBS à 80 % d’éthanol maintenu à moins 20 degrés Celsius et incubez à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure.

Aspirez l’éthanol et lavez les cellules deux fois avec du PBS en agitant à température ambiante pendant cinq minutes à chaque fois, puis lavez-les une fois pendant cinq minutes à température ambiante avec du PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,05 % entre 20 ou P-B-S-B-T. Également avec agitation pour éviter la liaison d’anticorps non spécifiques. Bloquez les cellules dans un millilitre de tampon P-B-S-B-T contenant 10 % de sérum de chèvre pendant 20 minutes tout en agitant à température ambiante.

Ensuite, lavez les cellules deux fois en P-B-S-B-T cinq minutes à chaque lavage. Incuber les cellules avec l’anticorps primaire, un anticorps spécifique E quatre ou quatre dans ce cas dans un millilitre de P-B-S-B-T pendant une heure tout en secouant à température ambiante. Ensuite, laver deux fois dans P-B-S-B-T et une fois dans du PBS contenant 0,1 % BSA cinq minutes chaque lavage.

Ensuite, ajoutez aux cellules un millilitre de PBS 0,1 % BSA contenant l’anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence et 0,5 microgramme par millilitre. Concentration finale de DPI incuber pendant 40 minutes en secouant à température ambiante dans l’obscurité. Enfin, lavez avec du PBS pendant cinq minutes.

Séchez le puits par aspiration et gardez les plaques à l’envers pendant une heure supplémentaire à toute la nuit pour obtenir un séchage complet et couvrez avec du papier d’aluminium sur les cellules à l’aide de la solution flora Mount G. Gardez les assiettes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’au moment de compter. Les cellules nucléaires apoptotiques qui ont subi les différents traitements décrits dans le protocole ont été fixées et colorées avec E, quatre ou quatre anticorps spécifiques et DPI pour visualiser les noyaux des cellules transfectées.

Cette figure montre un exemple de cellules exprimant E quatre ou quatre et le panneau GFP A montre l’expression de la protéine GFP de contrôle seule, et le panneau B montre E quatre ou quatre expressions. Les noyaux de coloration DAPI sont représentés dans le panneau C et les images fusionnées sont présentées dans le panneau D. Les flèches blanches marquent GFP et E.Quatre ou quatre cellules transfectées contenant des noyaux de morphologie apoptotique. Les flèches rouges marquent les noyaux de forme irrégulière qui ne sont pas comptés comme des noyaux apoptotiques ; les astérisques marquent les noyaux mitotiques, ou les noyaux qui viennent de diviser le nombre de noyaux condensés ou fragmentés visualisés par DAPI. La coloration a été comptée pour calculer le pourcentage de noyaux de morphologie apoptotique au sein de la population cellulaire transfectée afin de maintenir une objectivité optimale du test.

Le comptage du nucléo apoptotique dans les différents échantillons a été effectué à l’aveugle lorsque la personne qui comptait n’était pas consciente de l’identité de l’échantillon. Un résultat représentatif est présenté dans ce graphique. Des pourcentages plus élevés d’anomalies nucléaires ont été observés dans les cellules exprimant E quatre ou quatre, confirmant que T quatre ou quatre induit la mort cellulaire. Le pourcentage le plus élevé d’anomalies nucléaires a été observé dans les cellules exprimant E quatre ou quatre, où les niveaux d’ACF un ont été réduits par SHR et un knockdown médié, indiquant que l’inactivation d’ACF un augmente E quatre ou quatre, la mort cellulaire Inge a augmenté la toxicité de E quatre ou quatre dans les cellules.

L’expression de faibles niveaux d’ACF un n’a pas résulté d’une augmentation de E quatre ou quatre niveaux comme on l’a vu dans le Western blot. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas oublier de faciliter un comptage conseillé du stent nuclétique apoptotique avec DPI et d’appliquer des critères stricts pour l’identification de ce nuclé. En plus de cette procédure, d’autres méthodes telles que les tests de génétique clonale peuvent être effectuées pour valider les résultats de l’EPS DA Suite à cette procédure.

D’autres méthodes telles que les tests de co-immunoprécipitation peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, s’il existe une interaction physique entre les protéines étudiées.