Isolement de noyaux à partir de tissus de gliome frais congelés : une méthode pour obtenir des noyaux intacts à partir d’échantillons de tumeurs de gliome

Pour isoler les noyaux, commencez par prélever un échantillon de gliome frais et congelé - une tumeur qui prend naissance dans les cellules gliales du cerveau - dans une boîte de Pétri.

Placez la boîte de Pétri sur de la glace pour éviter la dégradation des tissus.

Ensuite, coupez l’échantillon de tissu en petits morceaux.

Ajoutez un tampon de lyse pré-refroidi aux morceaux de tissu hachés. Transférez le mélange dans un homogénéisateur Dounce. À l’aide du pilon, homogénéisez le tissu pour désintégrer les cellules et initier la lyse.

Maintenant, transférez l’homogénat dans un tube de microcentrifugation contenant un tampon de lyse frais.

Perturber mécaniquement l’homogénat à l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre. Cette étape facilite la libération des organites cytoplasmiques des cellules.

Par la suite, à l’aide d’une crépine cellulaire de taille appropriée, filtrez l’homogénat dans un tube frais pour éliminer les débris tissulaires et autres contaminants.

Après filtration, prélever le filtrat contenant les différents organites cellulaires.

Centrifuger le filtrat à basse vitesse pour granuler les noyaux plus denses au fond tandis que les autres organites cellulaires restent dans le surnageant.

Jetez le surnageant contenant des organites. Stockez les pastilles riches en noyaux bruts dans un tampon de stockage approprié pour un séquençage ultérieur en aval.

Commencez par transférer 10 à 60 milligrammes d’échantillon de tissu frais congelé dans une boîte de Pétri pré-réfrigérée. Émincez ou hachez le tissu frais congelé avec une lame de rasoir en petits morceaux sur de la glace. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse des noyaux réfrigéré sur le tissu dans la boîte de Pétri.

Ensuite, transférez le mélange dans un annonceur. Dénoncez les morceaux de tissu avec le pilon « lâche » pendant environ 20 coups jusqu’à ce que la friction soit réduite. Ensuite, dénoncez-le avec le pilon « serré » pendant 20 coups pour obtenir une homogénéisation complète des tissus.

Transférez l’homogénat dans un tube pré-refroidi de 2 millilitres et ajoutez 1 millilitre de tampon de lyse réfrigéré dans le Douncer, rincez-le et ajoutez-le dans le tube. Mélangez-le doucement et incubez-le sur de la glace pendant 5 minutes, en mélangeant avec une pointe de pipette de gros calibre une à deux fois pendant l’incubation.

Filtrez l’ensemble de l’homogénat à l’aide d’une maille de crépine de 30 micromètres et collectez-le dans un tube Falcon de 15 millilitres. Ensuite, transférez-le dans un nouveau tube prérefroidi de 2 millilitres. Une seule passoire suffit généralement pour l’ensemble de l’homogénat.

Examinez l’échantillon au microscope optique pour vérifier l’élimination des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire. Il n’est pas nécessaire que les noyaux soient ronds et que la membrane nucléaire ne soit pas déformée. S’il y a des débris, répétez la filtration.

Ensuite, centrifugez les noyaux sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 minutes. Retirez le surnageant, en laissant derrière vous environ 50 microlitres de pastille contenant des noyaux. Remettez doucement la pastille en suspension dans un autre millilitre de tampon de lyse des noyaux et incubez-la pendant 5 minutes sur de la glace.

Répétez la centrifugation. Ensuite, retirez le surnageant sans déranger la pastille. Ajoutez 500 millilitres de HB et incubez l’échantillon pendant 5 minutes sans le remettre en suspension. Ensuite, remettez les noyaux en suspension dans un autre millilitre de HB.

Centrifuger pendant encore 5 minutes. Ensuite, retirez le surnageant. Remettre les noyaux en suspension dans 200 microlitres de HB et transférer la suspension dans un nouveau tube de 2 millilitres.