Isolement de populations cellulaires à partir de tissus cérébraux à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

Transférez un morceau de tissu cérébral humain fraîchement congelé dans un broyeur approprié contenant un tampon de lyse froide.

Déplacez le pilon de haut en bas pour briser mécaniquement le tissu, libérant ainsi les cellules.

Les molécules détergentes du tampon de lyse brisent la membrane cellulaire, libérant les noyaux.

Transférez le contenu dans un tube à centrifuger approprié et ajoutez un tampon de saccharose froid au fond du tube, créant ainsi un gradient de densité.

Centrifugeuse à grande vitesse pour séparer les noyaux au fond du tube.

Jetez le surnageant et remettez les noyaux en suspension dans une solution saline tamponnée.

Ajoutez des anticorps conjugués aux fluorophores spécifiques de la cible dans les noyaux et incubez pour permettre à l’anticorps de se lier à sa protéine nucléaire cible.

Ajoutez un colorant de coloration nucléaire pour visualiser l’ADN intact.

Effectuez un tri des noyaux activés par fluorescence pour trier les noyaux de différentes populations cellulaires en fonction de signaux de fluorescence distincts.

Commencez à disséquer environ 200 à 400 milligrammes de tissu à partir d’un échantillon de tissu du cortex adulte humain frais et congelé. Placez le mouchoir dans un détonateur de mouchoir en verre de 7 millilitres contenant 4 millilitres de tampon de lyse glacé sur de la glace, et broyez le mouchoir environ 50 fois.

Transférez l’homogénat dans un tube en polypropylène ultracentrifuge de 12 millilitres. À l’aide d’une pipette de 5 millilitres, ajoutez 6,5 millilitres de tampon de saccharose glacé au fond du tube de l’ultracentrifugeuse sans perturber l’interface entre le saccharose et l’homogénat tissulaire.

Pour recueillir les noyaux, ultracentrifugez le lysat pendant une heure à 101 814 fois g, et aspirez soigneusement le surnageant et les débris sans déranger la cuillette. Ajoutez du PBS dans le tube de l’ultracentrifugeuse, en remettant en suspension les noyaux de la pastille.

Pour le tri activé par fluorescence des noyaux isolés, ajoutez environ 20 microlitres de l’échantillon remis en suspension à une solution d’anticorps contenant un anticorps anti-NeuN de souris conjugué à AlexaFlour555. Ajoutez environ 20 microlitres de l’échantillon remis en suspension à une solution d’anticorps contenant un anticorps anti-PAX6 de souris conjugué à l’APC. Après une incubation d’une heure, à 4 degrés Celsius avec agitation à l’abri de la lumière, ajoutez du DAPI dans un rapport de 1 à 1 000 à tous les échantillons et témoins.