Dosage de la quantification d’une infection bactérienne : méthode de quantification de la charge bactérienne intraoculaire dans un modèle murin d’endophtalmie bactérienne

L’endophtalmie bactérienne est une affection oculaire inflammatoire qui survient lorsque Bacillus cereus - une bactérie pathogène - infecte la région intraoculaire.

Pour quantifier l’infection bactérienne, placez un modèle murin euthanasié d’endophtalmie bactérienne latéralement sur une table d’opération. Appliquez une légère pression sous l’œil pour aider à détacher le globe oculaire de l’orbite. Transférez le globe oculaire dans un tube contenant un tampon approprié complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase.

Homogénéiser le tissu oculaire pour le désintégrer, en libérant des bactéries dans la suspension. Les inhibiteurs de protéases présents dans le tampon inactivent les protéases cellulaires libérées pour maintenir la viabilité bactérienne. Ensuite, diluez en série la suspension bactérienne pour obtenir différentes concentrations de Bacillus cereus.

Prendre une plaque de culture inclinée contenant le milieu gélosé enrichi et délimiter les rangées correspondant à chaque concentration de dilution. Versez quelques gouttes de la suspension bactérienne sur le dessus de la rangée désignée et laissez-la s’écouler jusqu’à ce qu’elle atteigne l’extrémité de l’assiette, aidant ainsi à la propagation uniforme des bactéries. Aplatissez l’assiette et incubez.

Pendant l’incubation, chaque bactérie utilise les nutriments de la gélose pour proliférer et former des colonies individuelles. Le nombre de colonies diminue, ce qui correspond à une augmentation de la dilution de la suspension bactérienne. Comptez le nombre de colonies dans une rangée particulière pour quantifier la charge bactérienne oculaire.

Au point final expérimental approprié, ajouter 400 microlitres de PBS complété par un inhibiteur de protéase dans un tube de prélèvement autoclavé étiqueté par œil sur de la glace, et placer une pince ouverte à pointe fine de chaque côté de l’œil infecté. Poussez les pointes vers le bas vers la tête pour étendre l’œil.

Une fois que les pinces sont derrière le globe oculaire, pressez les pinces ensemble et retirez la pince de la tête pour détacher le globe oculaire. Ensuite, placez immédiatement le globe oculaire dans le tube de récolte correctement étiqueté. Dans les 60 minutes suivant le prélèvement de l’échantillon, placez les tubes de récolte fermés dans un homogénéisateur de tissus et homogénéisez les échantillons pendant deux périodes d’homogénéisation d’une minute, avec une période de repos de 30 secondes entre les deux.

Après homogénéisation, placez les échantillons sur de la glace et utilisez des aliquotes de 20 microlitres d’homogénat pour diluer en série les échantillons dans 180 microlitres de PBS par dilution jusqu’à ce qu’un facteur de 1 fois 10 puissance moins 8 soit atteint. Ensuite, étiquetez chaque rangée d’une plaque carrée BHI préchauffée avec la concentration de dilution appropriée et, avec la plaque inclinée à un angle de 45 degrés, ajoutez 10 microlitres de chaque dilution en rangées individuelles en haut de la plaque. Laissez couler chaque échantillon jusqu’à ce qu’il atteigne presque le fond de la plaque avant de poser la plaque à plat. Lorsque les échantillons ont été absorbés dans la gélose, transférez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Les colonies devraient commencer à être visibles après huit heures d’incubation.

Pour une représentation précise de la concentration dans l’échantillon, comptez la rangée qui compte entre 10 et 100 colonies.