Méthodes pour détecter les cytotoxiques amyloïdes suivant Infection de pulmonaire cellules endothéliales par Pseudomonas aeruginosa

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des soins pulmonaires, telles que pourquoi les patients qui survivent à une pneumonie nosocomiale ont-ils de si mauvais résultats à long terme ? L’avantage de cette méthode est qu’elle est simple et fiable, ce qui signifie que toute personne qui se présente dans le laboratoire peut l’apprendre et le lendemain, elle génère des données utiles et reproductibles. Bien que ces méthodes analytiques puissent être appliquées pour mieux comprendre l’infection des cellules cultivées in vitro, elles peuvent également être appliquées à des modèles animaux et à des patients humains.

Pour produire un surnageant cytotoxique, il faut laver une boîte de 150 centimètres de cellules endothéliales avec HBSS et diluer une colonie de P. aeruginosa à une absorbance de 0,25 à 540 nanomètres. Diluez davantage les cellules bactériennes pour permettre une multiplicité d’infection de 20 à un millilitre sur 20 millilitres de HBSS et ensemencez les bactéries sur la plaque de cellules endothéliales. Placez ensuite les cellules infectées dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant quatre à cinq heures.

Il est essentiel que l’incubation des bactéries et des cellules endothéliales se produise pendant une durée appropriée. Si l’incubation est trop courte, les amyloïdes ne seront pas libérés dans le surnageant. Si l’incubation est trop longue, les cellules vont en fait se lyser et libérer tout leur contenu dans le surnageant.

L’indicateur que nous utilisons pour une durée d’incubation appropriée est la formation de lacunes dans la monocouche endothéliale. Lorsque des lacunes peuvent être observées dans la monocouche cellulaire par microscopie optique, récoltez le surnageant pour la centrifugation afin d’éliminer tous les débris cellulaires. Décantez le surnageant dans une seringue équipée d’un filtre de 0,2 micron et faites passer le surnageant à travers le filtre pour éliminer toute bactérie contaminante.

Ensuite, mettez de côté 1,5 millilitre de surnageant stérile pour les tests de cytotoxicité et congelez le reste de l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Pour évaluer la cytotoxicité du surnageant récolté, ajouter l’aliquote de 1,5 millilitre de surnageant stérilisé par filtre à un seul puits d’une plaque à six puits contenant une culture de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires confluentes. Placez la plaque dans un incubateur à CO2 pendant 21 à 24 heures.

Obtenez ensuite des images des régions des cultures traitées et témoins. Importez les images dans une macro imagej personnalisée et ajustez le contraste à 15 % de pixels saturés. Dupliquez les images au contraste ajusté et utilisez la soustraction de l’arrière-plan pour obtenir des images à contraste élevé des cellules intactes et de la zone interdite dans le champ de vision.

Soustrayez cette image à contraste élevé de l’image d’origine et utilisez le calculateur d’image et la fonction pour combiner l’image résultante avec l’image d’origine. Utilisez la fonction de seuil pour convertir l’image combinée en un masque avec les espaces en noir et les cellules intactes en blanc. Et utilisez la fonction d’érosion binaire pour supprimer tout bruit de l’image.

Utilisez ensuite la fraction de surface pour mesurer le rapport entre les pixels noirs et blancs dans l’image résultante. Tracez et exprimez les zones fractionnelles pour chaque point de temps de traitement, en pourcentage de la surface d’écart maximale. Pour quantifier les amyloïdes dans le surnageant, ajoutez 20 microlitres de solution mère de thioflavine T 50X fraîchement préparée et filtrée à un millilitre de PBS dans une cuvette de spectrophotomètre d’un millilitre, et chargez l’échantillon dilué sur un spectrofluorimètre.

Mesurez l’émission de fluorescence de base à l’aide d’une excitation de 425 nanomètres. Balayage de l’émission de fluorescence de 450 à 575 nanomètres par incréments de deux nanomètres. Ensuite, réglez l’instrument pour effectuer un balayage en accéléré à l’aide d’une excitation de 425 nanomètres et d’une émission de 482 nanomètres avec acquisition de données toutes les 0,2 seconde pendant 60 secondes.

Arrêtez le balayage après 20 secondes et 10 microlitres de filtre stérilisé surnageant à la cuvette. Après le mélange par inversion, rechargez la cuvette sur le spectrofluorimètre et reprenez le balayage temporel pendant les 40 dernières secondes. Une fois le laps de temps terminé, effectuez un balayage final du spectre des émissions de fluorescence en utilisant les paramètres de balayage d’origine.

L’ajout de P. aeruginosa à des couches confluentes de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires induit la formation d’un espace entre les cellules. En utilisant imagej pour évaluer la cytotoxicité surnageante démontrée au cours des 12 premières heures de traitement, des monocouches de cellules confluentes encore saines peuvent être visualisées comme toutes les régions blanches dans le champ microscopique. Cependant, 18 heures après l’ajout du surnageant prélevé sur des cultures infectées par le PA 103, des lacunes dans la monocouche peuvent être détectées, la surface de la boîte de culture dépourvue de cellules augmentant de manière linéaire jusqu’à 36 heures de traitement, date à laquelle presque aucune cellule intacte ne peut être observée.

Des résultats similaires peuvent être obtenus en utilisant la libération de lactate déshydrogénase comme marqueur de cytotoxicité. La lactate déshydrogénase est détectée pour la première fois 18 heures après l’ajout du surnageant cytotoxique et augmente de manière linéaire jusqu’à ce que la destruction cellulaire maximale soit mesurée à 36 heures. Les surnageants peuvent également être évalués par analyse immunoblot ou en mesurant la variation de l’intensité de la fluorescence T de la thioflavine due à des modifications de confirmation induites par la liaison amyloïde afin de déterminer la présence d’amyloïdes cytotoxiques dans les surnageants.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des surnageants cytotoxiques suite à l’infection des cellules endothéliales par citomonsis aeruginosa. De plus, vous devez bien connaître les types de tests nécessaires pour caractériser et analyser les cytotoxines présentes dans ces surnageants.