Pathogènes d’origine alimentaire préalable à l’aide de magnéto-fluorescent NANOCAPTEUR : Détection rapide d’e. Coli O157 : H7

L’objectif principal de ce protocole est de concevoir et de synthétiser des nanocapteurs dual-modaux capables de détecter des contaminants bactériens tels que E.coli O157 :H7. Les nanocapteurs magnéto-fluorescents sont synthétisés en fonctionnalisant des nanoparticules d’oxyde de fer via une procédure en deux étapes. Tout d’abord, les anticorps de ciblage sont conjugués à la surface de la nanoparticule.

Ensuite, un colorant fluorescent est chargé dans son codage. L’appariement de ces modalités permet une détection rapide et sensible des contaminants bactériens dans les solutions peu ou fortement concentrées. En présence d’une petite quantité de bactéries, les nanocapteurs essaimeront autour des bactéries en raison du ciblage des anticorps conjugués.

Cet essaimage modifie les interactions du noyau magnétique des nanocapteurs avec les protons de l’eau environnante, ce qui permet une détection sensible des changements dans les valeurs de relaxation magnétique. À mesure que la concentration de contaminants bactériens dans les solutions augmente, l’essaimage diminue et la capacité de la modalité magnétique à quantifier la contamination est réduite. Cependant, à mesure que la concentration bactérienne augmente, la soumission fluorescente des bionanocapteurs augmente également.

C’est pour cette raison que l’appariement des modalités magnétiques et fluorescentes est important. Cette combinaison a permis de détecter en quelques minutes aussi peu qu’une unité formant une colonie d’E. coli O157 :H7. La première étape du système de nanocapteurs magnéto-fluorescents est la préparation d’une solution de sel de fer composée à la fois de chlorure féreux et ferrique.

Le fer fournira aux nanocapteurs un noyau magnétique qui permet leur adaptabilité aux plateformes de relaxation magnétique. D’autres solutions sont l’acide polyacrylique et l’hydroxyde d’ammonium. L’acide chlorhydrique est introduit dans la solution de sel de fer, qui est ensuite ajoutée à la solution d’hydroxyde d’ammonium lors d’un vortex.

Enfin, la solution d’acide polyacrylique est ajoutée et le mélange résultant est vortex pendant une heure supplémentaire pendant que la réaction se poursuit. La solution résultante est centrifugée afin de précipiter les plus grosses molécules et d’isoler les nanoparticules de moins de 100 nanomètres. La solution est ensuite dialysée pendant la nuit pour la purification.

L’étape suivante est la conjugaison des anticorps ciblant l’acide polyacrylique codant pour les nanoparticules d’acide de fer nouvellement synthétisées. Le matériel nécessaire comprend le tampon MES, l’EDC, le NHS et les anticorps sélectionnés. L’EDC est d’abord ajouté à la solution de nanoparticules, puis au NHS et enfin à l’anticorps.

Le mélange est ensuite placé sur un mélangeur de table pendant trois heures pendant que la réaction se poursuit. La solution est purifiée à l’aide d’une colonne magnétique. La colonne aimantée capture les nanoparticules, ne laissant sortir que les anticorps flottant librement.

Ensuite, la colonne est lavée avec un tampon PBS et les nanocapteurs conjugués sont collectés. Les nanoparticules sont ensuite prêtes pour l’ajout d’un colorant fluorescent, fournissant la deuxième modalité clé utilisée pour la détection. L’une des caractéristiques les plus clés de notre nanocapteur est la combinaison des modalités magnétiques et fluorescentes, ce qui est important pour un certain nombre de raisons.

Tout d’abord, la combinaison des modalités permet à chacune de vérifier en quelque sorte l’autre, ce qui réduit considérablement le risque de faux positifs et de faux négatifs, ce qui est l’un des plus grands obstacles rencontrés par les différentes plateformes de diagnostic utilisées aujourd’hui. Et deuxièmement, la combinaison des modalités élargit considérablement la gamme à l’intérieur de laquelle nous pouvons non seulement détecter mais aussi quantifier la contamination bactérienne. La dernière étape de la préparation des nanocapteurs est l’encapsulation d’un colorant fluorescent dans le codage de la nanoparticule.

Ceci est simplement réalisé en ajoutant du colorant à la solution pendant le vortex, puis en laissant plus de temps au colorant pour se diffuser dans le codage du nanocapteur. Les nanocapteurs entièrement fonctionnalisés sont ensuite dialysés une dernière fois pour être purifiés. Afin de caractériser les nanocapteurs, la taille et la soumission fluorescente sont enregistrées à l’aide d’un zetasizer et d’un lecteur de plaques de fluorescence.

Un petit échantillon du nanocapteur est ajouté à une solution d’eau en cuvette et placé dans le zetasizer pour l’enregistrement de la taille. Pour l’analyse de fluorescence, un échantillon du nanocapteur est placé sur une plaque à 96 puits et inséré dans le lecteur de plaques de fluorescence. Idéalement, les nanocapteurs auront un diamètre d’environ 70 nanomètres et auront une soumission fluorescente de 575 nanomètres.

En plus de la synthèse des nanocapteurs, la culture des bactéries est nécessaire pour fournir les cibles bactériennes en laboratoire. Un stock de glycérol de bactéries est utilisé pour préparer une culture dans un bouillon nutritif. Cette solution est ensuite laissée à l’incuber.

Après la période d’incubation initiale, des dilutions en série sont effectuées afin d’obtenir une large gamme de concentrations bactériennes. Cent microlitres de chaque concentration sont plaqués sur une plaque de vis sans fin, puis incubés pendant 24 heures. Après cette incubation, les colonies sur chaque plaque sont comptées afin de déterminer l’unité formant la colonie, ou le nombre d’UFC par mil de chaque stock dilué.

Maintenant que les solutions mères bactériennes ont été préparées, elles peuvent être utilisées en conjonction avec les nanocapteurs préparés. Et un aspect important de ce sérotype particulier de la bactérie qui le distingue des autres sérotypes est que, supposons que si vous êtes infecté par les autres sérotypes, vous devez avoir de nombreuses unités formant des colonies pour contracter une infection. Mais dans ce cas particulier, E.coli 10 à 100 UFC ou unités formant colonies sont assez bons pour vous donner une infection.

Notre technologie est établie de telle manière que vous ne manquez même pas une seule colonie de contamination bactérienne. Afin de préparer les solutions pour la lecture dans le relaxomètre magnétique, 300 microlitres de PBS sont d’abord pipetés dans un tube Eppendorf. Ensuite, un échantillon de stock bactérien est ajouté, suivi de l’ajout de nanocapteurs.

La solution est ensuite transférée dans un tube de verre, et un morceau de parafilm est placé sur le dessus afin d’éviter l’évaporation. Le tube de verre est ensuite placé à l’intérieur d’un tube RMN plus grand et inséré dans le relaxomètre magnétique. Une solution de base ne contenant aucune bactérie et uniquement un nanocapteur et un PBS est utilisée pour obtenir une lecture de base de T2 comme indiqué.

Ensuite, des solutions contenant différentes concentrations de bactéries sont insérées dans le relaxomètre magnétique pour analyse, et les changements de valeurs T2 sont causés par la liaison entre les nanocapteurs et les bactéries. Comme nous l’avons vu, la présence d’aussi peu qu’une UFC bactérienne peut être détectée en quelques minutes en utilisant cette modalité. Cependant, à mesure que la concentration bactérienne augmente, les lectures MR sont moins quantifiables, c’est pourquoi l’utilisation de données de soumission fluorescente équivaut également à une quantification bactérienne précise.

Avant que les données de fluorescence puissent être collectées, l’échantillon doit d’abord être centrifugé. La solution est transférée du tube de verre vers un tube d’Eppendorf, puis centrifugée. Cela sépare les bactéries et les nanocapteurs qui y sont liés des nanocapteurs flottants en solution.

Le surnageant est jeté et la pastille bactérienne est remise en suspension dans du PBS. Enfin, l’échantillon peut être analysé par soumission fluorescente. L’intensité de l’émission sera relative à la quantité de nanocapteurs restant en solution, et donc aussi à la quantité de bactéries présentes.

Comme on peut le voir, la soumission fluorescente se renforce à mesure que la concentration bactérienne augmente, et elle devient également plus sensible. C’est pourquoi l’appariement des modalités magnétiques et fluorescentes permet de détecter et de quantifier la contamination bactérienne aux stades précoces et tardifs du développement. En plus de la détection de bactéries dans des solutions simples telles que le PBS, ces nanocapteurs possèdent également la capacité de fonctionner dans des milieux plus complexes, tels que l’eau de lac ou le lait.

De plus, ces nanocapteurs ont été testés pour leur spécificité en présence de bactéries non cibles et de bactéries cibles inactivées par la chaleur. Comme on l’a vu, les nanocapteurs magnétofluorescents ont peu ou pas de réaction avec les bactéries non ciblées ou non vivantes en raison de la spécificité des anticorps conjugués. Cela démontre leur efficacité pour la détection de bactéries spécifiques en présence d’autres espèces.

Enfin, il est également important de noter que ces nanocapteurs peuvent être facilement personnalisés pour la détection d’autres agents pathogènes. Vous pouvez synthétiser ou formuler ces nanocapteurs que nous avons réalisés dans notre laboratoire en un mois maintenant. Vous pouvez le faire en un mois, et ce mois de produit peut vous donner environ 10 ans d’application.