Outils d’édition de base médiés par CRISPR : une technique d’édition du génome pour induire une substitution de base ciblée

Pour l’édition du génome médiée par CRISPR, commencez par la culture HAP1-BE3, une lignée cellulaire haploïde avec un gène BE intégré codant pour une enzyme d’édition de base. À cette culture, ajoutez des vecteurs lentiviraux contenant le plasmide CRISPR-Cas9 conçu pour une cible spécifique telle que le gène du cancer du sein humain, BRCA1.

La particule de lentivirus fusionne avec la membrane de la cellule hôte, libérant le plasmide, qui s’intègre finalement dans le génome de la cellule hôte pour former les segments du gène CRISPR-Cas9-BE. Ces gènes génèrent un ARNg ciblant BRCA1, une endonucléase Cas9 et une BE-cytidine désaminase.

L’ARNg ciblant BRCA1 est un ARN qui fusionne avec Cas9 et dirige le complexe vers le locus du gène BRCA1. Près de ce gène, le locus est un motif adjacent protospacer, ou PAM, où l’BE peut s’amarrer de manière stable et se déplacer vers l’amont pour atteindre sa région catalytique active. Ici, le BE reconnaît une base de cytidine et la convertit en uridine.

Cette mutation de substitution de base déclenche la coupe du brin d’ADN non modifié par la nucléase Cas9. La rupture des brins d’ADN active des enzymes de réparation qui comblent la base manquante et convertissent l’uracile, une base non ADN, en thymine. Dans l’ensemble, ces processus génèrent une variante génétique.

Maintenant, incubez les cellules dans des conditions physiologiques et une sous-culture pour multiplier la variante du gène. Extrayez l’ADN génomique et séquencez-le pour analyser l’efficacité de l’édition de base médiée par CRISPR.

Ensemencez 5 x 10⁵ cellules HAP1-BE3 par puits dans des plaques de 24 puits un jour avant la transfection, et cultivez-les jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 % à 80 % de confluence pour la transfection. Transfect des ARN guides ciblant BRCA1 à l’aide des réactifs d’achat de transfection, selon le protocole du fabricant. Utilisez 1 microgramme d’ARN guides de ciblage BRCA1 pour induire la conversion CG en TA aux sites cibles de BRCA1. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et sous-cultivez tous les 3 à 4 jours. Récoltez les pastilles cellulaires 3, 10 et 24 jours après la transfection pour analyser l’efficacité de l’édition de base. Extrayez l’ADN génomique à l’aide du kit de purification d’ADN génomique.