Name: ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de BRCA1, BRCA2, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de lADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Découvrez une méthode d'enrichissement d'ADNg par technologie transposase-NGS pour séquencer 11 gènes de réparation de l'ADN. Ce protocole rapide permet d'analyser BRCA1, BRCA2 et neuf autres gènes en moins de deux semaines.

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Nous remercions la Ligue contre le Cancer de Côte d’Or et le Centre Georges-François Leclerc pour leur soutien financier. Nous remercions Philip Bastable pour l’édition du manuscrit.

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<li>Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li>
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<li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li>
<li>Risch, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+BRCA1+and+BRCA2+mutation+frequencies+and+cancer+penetrances%3A+a+kin-cohort+study+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).</li>
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<li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.O.P%22%5BJournal%5D)">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

L&#39;utilisation généralisée de dispositifs et de technologies de l&#39;END a offert de nouvelles possibilités dans l&#39;étude du cancer et des maladies génétiques. En plus de séquençage du génome entier ou le séquençage de l&#39;ARN, l&#39;analyse d&#39;une grande quantité de certaines séquences d&#39;ADNg de nombreux patients en même temps offre de grandes perspectives dans le diagnostic. Ici, nous avons développé une conception spécifique (disponible sur demande) en utilisant la technologie Nextera d&#39;étudier 11...

En 2010, près de 1,5 millions de personnes (essentiellement des femmes) ont développé un cancer du sein dans le monde entier. On estime que 5 à 10% de ces cas étaient héréditaires. Il ya près de 20 ans, BRCA1 et BRCA2 ont été identifiées comme impliquées dans héréditaire du sein et des ovaires 1. Depuis environ 15 ans, les régions codantes des gènes BRCA1 et BRCA2 ont été séquencés afin de déterminer la prédisposition génétique au cancer du sein et le cancer de l&#39;ovaire. Des altérations dans les gènes BRCA1 et BRCA2 sont détectés chez 10 à 20% de deux familles sélectionnées suggérant que l&#39;analyse de ces régions ne sont pas suffisantes pour le criblage efficace. Récemment, l&#39;analyse des séquences non codantes (promoteurs, introns, 3-&#39;UTR) de BRCA1 et BRCA2 mis en évidence que de nouvelles mutations / variations pourraient être liés à un risque accru de cancer du sein 6.3. protéines BRCA1 et BRCA2 sont impliqués dans la recombinaison homologue réparation (RHS), qui est complété par de nombreux partenaires 7. Bien que des altérations de BRCA1 ou BRCA2 induisent des défauts de réparation de l&#39;ADN, les autres partenaires peuvent également influer sur le risque de cancer du sein. Cette hypothèse semble avoir été validé depuis BRIP1 8 et 9 PALB2 avoir un impact avéré sur le cancer du col utérin et du sein, respectivement. En outre, deux autres gènes de prédisposition au cancer du sein &quot;à risque modéré», ATM et CHEK2, peuvent également être étudiées systématiquement 10. Suite à ces études, nous avons décidé de développer un protocole pour analyser 11 gènes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, et TP53) chez 24 patients en utilisant un très facile et relativement simultanément protocole rapide basé sur la technologie de la transposase, l&#39;enrichissement et le séquençage sur un dispositif de débit moyen. Mercicette technique, nous avons séquence des gènes complets à partir du début du promoteur à l&#39;extrémité 3&#39;-UTR de, à l&#39;exception de RAP80, pour lequel une région intronique de 2500 pb n&#39;est pas couverte (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Cela représente un total d&#39;environ 1.000.300 pb étudié avec 2734 sondes. Habituellement, BRCA1 et BRCA2 séquences exoniques sont analysés par séquençage de Sanger, qui a besoin de 1,5 mois de moins de 20 patients. Avec le présent protocole (figure 1), dans le même temps, les 11 gènes complets pour plus de 75 patients ont pu être analysés.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>Dispositif de séquençage/moyen débit</td></tr><tr><td>Nextera Kit d’enrichissement</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>Technologie basée sur la transposase</td></tr><tr><td>Cartouche 300 cycles</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>Perles AMPure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Perles de purification magnétique</td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits Life</td><td>Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MIDI Plaques à 96 puits</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>Ce joint n’est nécessaire que pour l’amplification par PCR. D’autres joints standard peuvent être utilisés tout au long de l’expérience</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Fourni avec le dispositif de séquençage Logiciel Experiment Manager Adresse Internet : http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Outil du site Web du fabricant</td></tr></tbody></table>

adng enrichissement par une technologie basée transposase-ngs analyse de la séquence plénier de brca1, brca2, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l'adn

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

L&#39;utilisation généralisée de séquençage de nouvelle génération a ouvert de nouvelles avenues pour la recherche sur le cancer et le diagnostic. NGS apportera d&#39;énormes quantités de données sur le cancer, et en particulier la génétique du cancer. Les connaissances actuelles et des découvertes futures, il sera nécessaire d&#39;étudier un grand nombre de gènes qui pourraient être impliqués dans une prédisposition génétique au cancer. À cet égard, nous avons développé une conception Nextera d&#39;étudier 11 gènes complets impliqués dans la réparation des dommages de l&#39;ADN. Ce protocole a été développé pour étudier en toute sécurité 11 gènes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, et TP53) de promoteur de 3&#39;-UTR chez 24 patients simultanément. Ce protocole, basé sur la technologie de transposase et enrichissement ADNg, donne un grand avantage en termes de temps pour le diagnostic génétique grâce à multiplexage déguster. Ce protocole peut être utilisé en toute sécurité avec ADNg de sang.

Exemple QC Résultats La capacité de cette méthode pour déterminer des séquences de gènes cibles est basée sur la qualité de l'ADNg (figure 2A) et la qualité de l'étape de tagmentation. Si le tagmentation n'est pas suffisante (Figure 2B, panneau supérieur), le séquençage ne ​​sera pas satisfaisante. Comme mentionné ci-dessus, après la purification de tagmentation, l'ADNg doit être tagmented en fragments de 150 pb à 1000 pb avec la majorité des fragments d'enviro...

l’enrichissement de l’ADNg pour le séquençage NGS est un outil simple et puissant pour l’étude des mutations constitutionnelles. Dans cet article, nous présentons la procédure pour analyser simplement la séquence complète de 11 gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN.

ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de BRCA1, BRCA2, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Le but de l’expérience suivante est d’analyser la séquence de 11 gènes simultanément avec un protocole très simple et relativement rapide basé sur la technologie basée sur la transposase. Ceci est réalisé par l’action d’une transposase pour obtenir 300 fragments d’ADN de paires de bases directement ligaturés avec des adaptateurs. La première capture à l’aide de sondes spécifiques, enrichit les échantillons dans les régions d’intérêt.Cette étape est répétée une fois de plus pour n’obtenir que les séquences cibles. Ensuite, l’amplification PCR est effectuée afin d’augmenter la quantité de matériaux pour séquencer les résultats obtenus qui montrent des variations génétiques dans les gènes sur la base de l’alignement des séquences et de l’analyse bioinformatique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le séquençage de Sanger, est sa grande capacité qui nous permet d’analyser 24 passions pour 11 gènes complets en moins de deux semaines.La démonstration de la procédure sera faite par Sandy, technicien pour mon laboratoire. Pour commencer, préparez tous les réactifs du kit d’enrichissement d’ADN. Lorsque vous êtes prêt, ajoutez environ 50 nanogrammes d’ADN génomique dans chaque puits d’une plaque de 96 puits en ajoutant 25 microlitres de tampon TD, puis cinq microlitres de TDE un tampon.Pour chaque puits, réglez une pipette à 50 microlitres et pipetez doucement tout le volume de haut en bas 10 fois. Centrifugez brièvement, puis placez la plaque dans un thermocycleur lorsque vous êtes prête. Vortex la solution ST et ajoutez 15 microlitres dans chaque puits contenant l’échantillon.Réglez la pipette à 65 microlitres et pipetez doucement tout le volume de haut en bas 10 fois, incubez pendant cinq minutes à température ambiante avant la centrifusion. Ensuite, ajoutez 52 microlitres de billes magnétiques de purification préalablement mélangées à chaque mélange de puits et incubez pendant 10 minutes à température ambiante avant de centrifuger. Après avoir lavé les billes à l’éthanol, retirez la plaque du support magnétique et ajoutez 22,5 microlitres de tampon RSB.Après avoir mélangé, placez la plaque sur le support magnétique et incubez pendant deux minutes. Assurez-vous que le surnageant semble complètement dégagé. Transférez doucement 20 microlitres de caisse claire dans une nouvelle plaque à 96 puits.Pour commencer le premier tour d’amplification PCR, ajoutez 20 microlitres de LP PMM et cinq microlitres d’indice un et d’indice deux à chacun. Bien mélanger et recouvrir la plaque d’un film adhésif Micros EAL. Après la centrifugation, placez la plaque dans le Thermocycleur et exécutez le programme One.Après avoir purifié et déterminé le rendement de la première série de PCR, commencez la première hybridation en prélevant jusqu’à 12 échantillons. Dans la nouvelle plaque à 96 puits en veillant à ce que le volume final de chaque piscine ne dépasse pas 40 microlitres, mélangez soigneusement le NCT une solution et ajoutez 50 microlitres à chaque puits. Après avoir ajouté 10 microlitres de CSO, mélangez et scellez la plaque.Après la centrifugation, placez la plaque dans un thermocycleur et programmez. Deux. Pour le premier lavage d’hybridation, retirez la plaque du thermocycleur et de la centrifugeuse. Retirez brièvement le couvercle adhésif avec beaucoup de précaution.Transférez 100 microlitres de mélange réactionnel de la plaque vers une nouvelle plaque à puits MIDI 96 et ajoutez 250 microlitres de solution Vortex SMB. Mélangez et fermez la plaque avant de l’incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Après avoir lavé et jeté la supena, ajoutez 200 microlitres de solution WS two bien mélangée dans des puits contenant des billes et mélangez soigneusement transférez tout le volume dans une nouvelle plaque à 96 puits.Fermez la plaque et placez-la dans un thermocycleur. Lancez le thermocycleur à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois terminé, placez immédiatement la plaque sur le support magnétique pendant deux minutes.Assurez-vous que le surnageant semble complètement dégagé. Retirez le sceau et jetez immédiatement tout le surnageant. Retirez la plaque du support magnétique.Ajoutez 200 microlitres de solution Ws three bien mélangée dans des puits contenant des billes et mélangez soigneusement. Après avoir lavé et retiré le supinate, scellez la plaque et centrifugez-la brièvement pour éliminer le résidu de supinate. Placez la plaque sur le support magnétique pendant deux minutes.Jetez le supinate résiduel. Ensuite, retirez la plaque du support magnétique. Ajouter 23 microlitres de mélange préalablement préparé.Après avoir mélangé, fermez la plaque et laissez reposer cinq minutes à température ambiante avant de centrifuger. Après avoir transféré 21 microlitres de sate dans une nouvelle plaque à 96 puits, ajoutez quatre microlitres d’ET, deux solutions à chacune. Bien mélanger et sceller la plaque avant la centrifusion.Pour commencer la deuxième hybridation, retirez le film adhésif et ajoutez 50 microlitres de NCT, 10 microlitres de CSO et 15 microlitres d’eau de qualité PCR aux 25 microlitres de bibliothèque. Après la centrifugation, placez la plaque dans un thermocycleur et exécutez le programme. Deux. Dans une nouvelle plaque de 96 puits mélangé 20 microlitres d’évolution de l’étape précédente.Avec 25 microlitres de T-C-P-M-M et cinq microlitres de PPC, scellez la plaque après mélange et centrifugation. Ensuite, placez la plaque dans un thermocycleur et exécutez le troisième programme le lendemain, centrifugez la plaque et lavez les billes avec de l’éthanol. Retirez la plaque du support magnétique et ajoutez 30 microlitres de tampon RSB.Mélangez et incubez l’assiette pendant deux minutes. À température ambiante, placez la plaque à 96 puits sur le support magnétique et incubez pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que le surnageant S apparaisse complètement clair. Transférez doucement 28 microlitres de snat dans une nouvelle plaque à 96 puits.La dernière étape consiste à déterminer la qualité de la bibliothèque à l’aide d’un analyseur de fragments ou QPCR. Pendant l’exploitation, la densité du cluster doit être comprise entre 801 000 K par millimètre carré. Différentes images correspondent à une faible densité, une haute densité et une densité parfaite.Les résultats obtenus avec cette technologie sont très faciles à interpréter comme des mutations ponctuelles ou indel à l’aide de la bioinformatique. Le changement de base est indiqué et la séquence supprimée ou insérée est directement identifiée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois jours si elle est exécutée correctement.

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