Name: Silence de BRCA2 Didentifier les fonctions biologiques de BRCA2 réglementés nouveaux dans les cellules humaines en culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Apprenez le silence de BRCA2 par transfection d'ARNsi dans des lignées cellulaires humaines. Cette méthode optimise la détection des protéines de haut poids moléculaire pour la recherche en biologie du cancer.

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Ce travail a été soutenu par les subventions FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 et RBNE08HWLZ_012, et le ministère italien de l’Économie et des Finances au CNR pour le projet « FaReBio di Qualità ».

1. Préparer des solutions siARN <ol><li> Remettre en suspension 5 nmol de brouillés (Ctrl) et 5 nmol de pastilles séchées BRCA2 siRNA dans 100 ul d&#39;eau exempte de RNase (concentration finale de siRNA: 50 um). Ceci est le stock siRNA et doit être stocké à -20 ° C en 10 aliquotes. </li><li> Prendre une aliquote de 10 pi de stock siRNA et ajouter 40 ul d&#39;eau sans RNase pour obtenir la solution de travail 10 uM siRNA. Cette dilution doit être conservé à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. NOTE: La solution de travail siRNA ne doivent pas subir de congélation / décongélation plus de 3 fois. </li></ol> 2. Ensemencement des lignées cellulaires épithéliales humaines <ol><li> Retirer le moyen de lignées cellulaires epitheliales humaines en croissance sous forme de monocouches de cellules dans des plaques de culture tissulaire dans un incubateur humidifié de croissance à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Laver les cellules dans la plaque une fois avec du PBS (RT 10 ml de PBS pour une plaque de 100 mm). </li><li> Pour détacher les cellules de la plaque,ajouter 2 ml de trypsine à 0,25% / solution 0,53 mM d&#39;EDTA et incuber 3-5 min en fonction du type de cellule. </li><li> Avant de collecter les cellules détachées, neutraliser la trypsine par addition de 2 ml de milieu de croissance complet contenant 10% de sérum bovin foetal. </li><li> Transférer les cellules dans un tube de 15 ml. </li><li> Centrifuger les cellules à 320 à 330 g pendant 3 min à 4 ° C dans un rotor à godets oscillants. </li><li> Remettre en suspension les culots cellulaires dans 5 ml de milieu sans antibiotiques. </li><li> Compter les cellules au microscope dans une chambre Burker ou en utilisant un système de comptage automatique selon les instructions du fabricant. </li><li> Ensemencer les cellules dans des plaques de 6 puits à environ 80% de confluence après 24 h (0,5-1 x10 6 cellules dans 2 ml de milieu de chaque puits). Le nombre de cellules optimal à être ensemencée peut varier en fonction des lignées cellulaires spécifiques et le taux de croissance. NOTE: Ne pas ajouter des antibiotiques dans le milieu à ce point parce que les antibiotiques vont interférer négativement avec l&#39;efficacité de transfection. Il est très important que les cellules sont à passages en culture faible (&lt;10) pour atteindre la haute efficacité de transfection de siRNA BRCA2. </li></ol> 3. transfecter des cellules avec un siRNA <ol><li> Vingt-quatre heures après l&#39;étalement des cellules, procéder à la première ronde de la transfection. <ol><li> Diluer 6 pi de 10 réactif de transfection de siRNA spécifique à base de lipides dans 130 ul de milieu de sérum réduit. </li><li> Diluer 3 pi de 10 pM de siRNA (30 pmoles) dans 130 ul de milieu de sérum réduit. </li><li> Moissonneuse le siRNA dilué avec le réactif de transfection dilué et incuber pendant 5-10 min à température ambiante. </li><li> Pendant l&#39;incubation, éliminer le milieu à partir des cellules et ajouter 2 ml de milieu frais préchauffé à 37 ° C (sans antibiotiques). </li><li> Ajouter 250 ul de complexes réactif de transfection-ARNsi aux cellules (cette quantité est d&#39;un seul puits d&#39;une plaque à 6 puits). </li><li> Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C76; C avec 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Après 24 h, passer à la deuxième ronde de la transfection en répétant les étapes 3.1.1-3.1.5 avec la modification suivante pour l&#39;étape 3.1.2: diluer 5 pi de 10 uM siRNA (50 pmol) dans 130 pi de milieu sérique réduite. <ol><li> Incuber les cellules pendant 1-2 jours à 37 ° C avant analyse. REMARQUE: Deux séries de transfections et utilisation d&#39;un rapport de réactif haute siRNA / de transfection au second tour sont essentiels pour obtenir un rendement élevé de BRCA2 silencieux. </li></ol></li></ol> 4. Lyse des cellules pour l&#39;analyse d&#39;immunotransfert <ol><li> Préparer du tampon de lyse douce avec du PBS (pH 7,4) contenant 1% de la non-ioniques, non dénaturant détergent octylphénoxypolyéthoxyéthanol, le pyrophosphate de sodium 5 mM, orthovanadate de sodium 1 mM, fluorure de sodium 10 mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 2 mM, 10 ug / ml de leupeptine, 10 ug / ml d&#39;aprotinine. Gardez-le sur la glace. </li><li> Enlever le milieu à partir des cellules et wles cendres une fois avec du PBS froid (2 ml / puits) dans la plaque. Pour éviter tout report PBS, retirer complètement de la plaque. </li><li> Ajouter 200 ul de tampon de lyse dans chaque puits. REMARQUE: si les cellules doivent être utilisés aussi pour d&#39;autres dosages, trypsiniser les cellules comme décrit dans l&#39;étape 2/1 à 2/6 et remettre en suspension les cellules dans du tampon / milieu approprié selon l&#39;application à utiliser. </li><li> Faire tourner doucement la plaque pour distribuer uniformément le tampon de lyse et incuber pendant 15 min à 4 ° C sur un agitateur. </li><li> Recueillir le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse sur de la glace en utilisant un grattoir à cellules. </li><li> Centrifuger à 17 900 g pendant 25 min à 4 ° C et recueillir le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Mesurer la concentration de protéine en utilisant un dosage de protéine disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant. </li></ol> Analyse d&#39;immunotransfert 5. BRCA2 <ol><li> Préparer le tampon de migration en diluant 50 ml de 20x Tris-Acétate SDS b couriruffer (mM Tricine 50, 50 mM Tris base, 0,1% de SDS, pH 8,24) avec 950 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Préparer l&#39;échantillon comme suit: ajouter 15 pg de lysat de cellules totales, 5 ul de tampon d&#39;échantillon 4x contenant dodécylsulfate de lithium à un pH de 8,4, 2 pl de 10x échantillon agent réducteur (0,5 M DTT), et un tampon de lyse jusqu&#39;à un volume final de 20 ul. NOTE: Ce protocole permet la détection de BRCA2 dans des lignées cellulaires normales aussi lors de l&#39;utilisation d&#39;une plus faible quantité de protéines totales (en bas à 5 ug). </li><li> Dénaturer les échantillons à 55 ° C pendant 10 min. NOTE: Il est crucial d&#39;utiliser 55 ° C. Depuis protéine BRCA2 est thermosensible 11, la hausse des températures de dénaturation se traduisent par la perte constante de pleine longueur intacte (390 kDa) des protéines BRCA2. </li><li> Mettre en place la chambre électrophorétique selon les instructions du fabricant. </li><li> Charger les échantillons et 10 pi de haut poids moléculaire pré-coloré protéine standard sur un gel precasted (Tris-Acétate 3-8%) et de fonctionner à 120 V pour abà 2 h 12. Arrêter la course électrophorétique avant la kDa marqueur bleu 55 laisse le gel precasted. </li><li> Préparer le tampon de transfert avec 50 ml de tampon de transfert 20 fois, 100 ml de methanol à 100% et 850 ml d&#39;eau. </li><li> Activer membrane de PVDF (0,45 um de taille de pore) par trempage dans 100% de methanol pendant 5 minutes, rincer à l&#39;eau distillée et équilibrer dans du tampon de transfert au moins pendant 5 minutes. Faire tremper les éponges de l&#39;appareil de transfert dans un tampon de transfert à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Lorsque la course électrophorétique est terminée, assembler le sandwich dans la pile de transfert dans l&#39;ordre suivant (bottom-up): trois éponges saturées dans un tampon de transfert, un 3MM feuille de papier de qualité saturée dans un tampon de transfert, le gel, la membrane de PVDF activé, un 3MM Note feuille de papier saturée dans un tampon de transfert, trois éponges saturée dans un tampon de transfert 13,14. Placez la pile dans les protéines de l&#39;appareil et de transfert à 350 mA pendant 4 heures à 4 ° C ou à 180 mA pendant une nuit à 4 ° C. NOTE: Etre BRCA2 une très grosse protéine, il est crucial d&#39;étendre le temps de transfert de 1 h (comme suggéré par le fabricant et la plupart des protocoles de transfert) à 4 h ou toute la nuit pour assurer le transfert complet des protéines de haut poids moléculaire. En outre, en raison de la longue période de transfert, il est essentiel d&#39;effectuer le buvard dans une chambre froide à 4 ° C pour minimiser la surchauffe et de faciliter le démontage en sandwich. Systèmes de transfert semi-sèches ne sont pas bonnes pour transférer de grandes protéines. </li><li> Après le transfert, laver la membrane avec le SCT, bloquer pendant 1 heure à température ambiante dans du TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contenant du lait en poudre de 5% sans matières grasses et de la sonde pendant la nuit à 4 ° C avec un anticorps polyclonal de lapin 30 pi anti-BRCA2 ( 200 ug / ml), dilué dans 9 ml de TBS-T + 5% de lait écrémé sec [1: 300 (v / v)] dilution. </li><li> Laver la membrane trois fois (10 minutes à chaque fois) avec du TBS-T, puis incuber le filtre pendant 1 heure avec 1 pi d&#39;anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort anti-lapin dilué dans 10 ml de TBS-T + 5% de lait écrémé sec. Par la suite, laver la membrane trois fois (10 minutes chacun) avec TBS-T. </li><li> Effectuer immunodétection par ECL pour révéler la protéine BRCA2 utilisant la chimioluminescence amplifiée (ECL) Western Blot réactif de détection, en suivant les instructions du fabricant. Visualiser les bandes immunochemiluminescent sur haute résolution ECL films. </li><li> Effectuer immunodétection avec un anticorps pour un gène de ménage, comme β-tubuline (55 kDa), sur le même filtre que le contrôle de chargement en utilisant un anticorps monoclonal à β-tubuline dilué à 1: 1000 (10 ul d&#39;anticorps anti-tubuline en 10 ml TBS-T + 5% de lait sec non gras) pendant 1 heure à température ambiante. Laver et incuber l&#39;anticorps secondaire tel que décrit pour BRCA2 (5.10 à 5.11), à l&#39;exception de l&#39;utilisation de la peroxydase de raifort anti-souris conjuguée à la place de l&#39;anticorps secondaire anti-lapin. </li><li> Acquérir une image numérique de films impressionnés par bandes de immunochemiluminescent et analyser l&#39;intensité de la bande par un logiciel d&#39;analyse d&#39;image spécialisé (par exemple,., ImageJ). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Parce que les mutations de la lignée germinale de la sonde du gène BRCA2 à un risque accru de plusieurs types de cancer, notamment le cancer femelle et mâle du sein, du cancer de l&#39;ovaire, le cancer de la prostate, le cancer du pancréas et le mélanome 3,4, un certain nombre d&#39;études ont été entreprises pour comprendre la fonction biologique de la protéine BRCA2. La plupart de ces études sont d&#39;origine génétique basée principalement en raison de difficultés techniques dans l&#39;analyse d&...

Le gène BRCA2 (BReast susceptibilité au cancer gène-2) code pour une protéine suppresseur de tumeur qui joue un rôle crucial dans la réparation des cassures double-brin par régulation de la fonction de l&#39;enzyme recombinase Rad51 1. BRCA2 a également été impliquée dans la modulation de la transcription dans la cellule et le contrôle du cycle 2. Les mutations germinales dans le gène BRCA2 induisent un mode autosomique dominant la susceptibilité au cancer du sein et le cancer de l&#39;ovaire chez les femmes et le cancer de la prostate chez les hommes, ainsi que la prédisposition à d&#39;autres types de cancer 3,4. Cependant, en dépit de l&#39;augmentation du risque dans le développement de cancers, des mutations de BRCA2 qui suppriment ou réduisent fonction de BRCA2 peut rendre les cellules cancéreuses plus vulnérables aux agents chimiothérapeutiques qui causent des dommages de l&#39;ADN 5-7. Cancers sporadiques présentent un taux de mutations BRCA2 (&lt;3%) bien que des niveaux réduits de protéine BRCA2 ont été détectés dans certains types de cancers faible, ce qui suggère que la protéine BRCA2peut être perdue lors de la tumorigenèse dans les cancers sporadiques à travers des mécanismes non-mutation-dépendantes 7,8. Ainsi, il est important de bien comprendre les fonctions de BRCA2 dans le cadre de la biologie du cancer ainsi que dans d&#39;autres milieux biologiques. Un outil puissant utilisé pour identifier de nouvelles fonctions d&#39;un gène dans des cellules de mammifères est de réduire au silence l&#39;expression. A titre d&#39;exemple, réduire au silence l&#39;expression de BRCA2 dans une variété de cellules epitheliales normales a récemment conduit à l&#39;identification d&#39;une nouvelle fonction de BRCA2 en tant que régulateur de la résistance de anoikis, une étape importante lors de l&#39;acquisition de cellule cancéreuse capacité invasive et métastatique 9. Gene silencing peut être réalisé en introduisant dans les cellules soit faible interférence (si) ARN court en épingle à cheveux ou (sh) des molécules d&#39;ARN ciblant le gène spécifique. La puissance élevée de siRNA et sa facilité d&#39;utilisation en font un outil privilégié pour faire taire des expériences visant à acquérir de nouvelles connaissances sur les processus biologiques critiques, une pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant, knockdown efficace de l&#39;expression génique peut ne pas être facilement réalisable pour tous les gènes et peut être très variable en fonction du type de cellule. Parce qu&#39;une diminution des niveaux de protéines intracellulaires est le phénotype le plus pertinent à l&#39;étude, il est crucial de quantifier l&#39;inactivation génique analyse par immunotransfert du produit de gène. Avec cet égard, la protéine BRCA2 présente une autre difficulté: être d&#39;une grande protéine (environ 390 kDa), des difficultés techniques existent pour l&#39;analyse biochimique classique, y compris immunotransfert. Nous rapportons ici un protocole optimisé pour une inactivation efficace de BRCA2 dans des lignées cellulaires epitheliales humaines et pour la détection rapide et efficace de la protéine BRCA2 knockdown analyse par immunotransfert.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool : ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&nbsp ; D-001810-10-05</td> Réactif d’ARNiMAX <td>de lipofectamine non ciblée ON-TARGETplus</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Sérum réduit Medium Life</td><td>Technologies</td><td>31985-070</td><td>Milieu pour procédure de transfection</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acétate 3-8 % 1,5 mm Gel préfabriqué</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel pour électrophorèse des protéines</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampon d’échantillons&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Réactif pour électrophorèse protéique</td></tr><tr><td>NuPAGE Agent réducteur d’échantillon (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Réactif pour électrophorèse protéique</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Réactif pour électrophorèse protéique</td></tr><tr><td>HiMark Étalon protéique pré-coloré</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Marqueur précoloré pour gel électrophorèse</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&nbsp ; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Équipement pour l’électrophorèse/transfert de protéines</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acétate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Réactif pour Western blot</td></tr><tr><td>membrane PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Réactif pour Western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Réactif pour Western blot</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 Anticorps polyclonal de lapin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>dilution 1:300</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal bêta-tubuline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Réactif pour transfert Western</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Réactif pour transfert Western</td></tr><tr><td>Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico/Femto</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Système de chimiluminescence</td></tr><tr><td>Cellules PNT1A</td><td>SIGMA Aldrich (pour ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A humain, épithélium normal de la prostate immortalisé avec des cellules Nthy SV40</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA Aldrich (pour ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Cell Line Cellules épithéliales folliculaires thyroïdiennes humaines</td></tr><tr><td>Prolifération cellulaire Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit pour les tests de prolifération cellulaire</td></tr></tbody></table>

silence de<em&gt; brca2</em&gt; d&#39;identifier les fonctions biologiques de brca2 réglementés nouveaux dans les cellules humaines en culture

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silence de la protéine suppresseur de tumeur BRCA2 et sa détection par des analyses biochimiques classiques représentent un grand défi technique en raison de la grande taille de la protéine BRCA2 humain (environ 390 kDa). Nous rapportons modifications des protocoles standard de transfection et de réduire au silence immunoblotting siARN BRCA2 humain endogène et détecter la protéine BRCA2, respectivement, dans des lignées cellulaires epitheliales humaines. Les étapes clés comprennent une forte siRNA transfection ratio de réactif et de deux rondes subséquentes de transfection de siRNA dans la même expérience. L&#39;utilisation de ces et d&#39;autres modifications au protocole standard, nous réalisons systématiquement plus de 70% le silençage du gène BRCA2 humain tel que jugé par une analyse immunoblot avec des anticorps anti-BRCA2. En outre, la dénaturation des lysats de cellules à 55 ° C au lieu de la classique de 70 à 100 ° C et d&#39;autres techniques d&#39;optimisation de la procédure d&#39;immuno-empreinte permet la détection de la protéine BRCA2 intact même when très faibles quantités de matière de départ sont disponibles ou lorsque les niveaux d&#39;expression de protéine BRCA2 sont très faibles. Silençage efficace de BRCA2 dans les cellules humaines propose une stratégie utile pour perturber la fonction de BRCA2 dans les cellules avec BRCA2 intacte, y compris les cellules tumorales, à examiner de nouvelles voies moléculaires et les fonctions cellulaires qui peuvent être affectés par des mutations de BRCA2 pathogènes dans les tumeurs. Adaptation de ce protocole pour le silençage et l&#39;analyse d&#39;autres protéines «grands» comme BRCA2 efficace devrait être facilement réalisable.

Avant de procéder à un dosage biologique / biochimique pour examiner l&#39;effet de BRCA2 silence sur les fonctions des cellules, la première étape consiste à vérifier la spécificité de l&#39;inactivation à l&#39;aide d&#39;un ARNsi crypté (non-ciblage siRNA) côte à côte avec BRCA2 siRNA (figure 1A ). Il est important d&#39;effectuer un deuxième tour de transfection de siRNA avec un ratio élevé siRNA / transfection pour obtenir un rendement élevé de BRCA2 silencieux. En effet, effectue...

Le silençage génique par siRNA représente une stratégie expérimentale commode pour analyser les fonctions biologiques dépendantes de BRCA2 avec des implications immédiates pour mieux comprendre la biologie du cancer. Une méthode permettant de réduire efficacement au silence BRCA2, ainsi que la procédure expérimentale visant à détecter et à quantifier les changements dans l’expression de la protéine BRCA2 par immunotransfert dans des lignées cellulaires humaines, sont présentées.

Silence de<em&gt; BRCA2</em&gt; D&#39;identifier les fonctions biologiques de BRCA2 réglementés nouveaux dans les cellules humaines en culture

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

L'objectif général de cette procédure est de silencer l'expression de B RCA two par transfection de SIR A. Cela est réalisé en préparant d'abord les complexes de réactif de transfection SIR a. Ensuite, un premier cycle de transfection est effectué en ajoutant les complexes goutte à goutte sur une monocouche de cellules ayant atteint une confluence de 80 %. Puis, un second cycle de transfection SIR a est réalisé en utilisant un rapport plus élevé entre SIR A et le réactif de transfection.Enfin, les monocouches cellulaires sont lavées avec du PBS glacé et les cellules sont lysées à quatre degrés Celsius à l’aide d’un tampon de lyse contenant un détergent. En définitive, une analyse par immunotransfert est utilisée pour démontrer la suppression de B RCA A deux au niveau protéique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet une inhibition efficace des gènes ainsi qu’une détection optimale des protéines de haut poids moléculaire, telles que le suppresseur de tumeur B RCA deux. Pour commencer, après avoir cultivé des monocouches de cellules épithéliales humaines à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une enceinte humidifiée, retirez le milieu de croissance et utilisez du PBS à température ambiante pour laver les cellules.Pour détacher les cellules de la plaque, ajouter deux millilitres de solution de trypsine 0,25 % contenant 0,53 millimolaire de EDTA et incuber de trois à cinq minutes selon le type cellulaire. Neutraliser la trypsine en ajoutant deux millilitres de milieu de croissance complet contenant 10 % de FBS avant de transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres. Placer les tubes dans un rotor à godets oscillants et centrifuger à 320 à 330 Gs et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.Utilisez cinq millilitres de milieu sans antibiotique pour resuspendre les culots avant de compter les cellules à l’aide d’une chambre de Burker ou d’un système de comptage automatisé. Ensuite, semez environ 0,5 à 1 × 10⁶ cellules dans deux millilitres de milieu sans antibiotique par puits de plaques à six puits, puis incubez pendant 24 heures jusqu’à une confluence de 80 %. Après l’incubation, procédez à un premier cycle de transfection en diluant six microlitres de réactif de transfection spécifique d’ARNi de type lipidique dans 130 microlitres de milieu à faible teneur en sérum.Diluez trois microlitres d'ARNi à 10 micromolaire dans 130 microlitres de milieu à faible sérum. Mélangez l'ARNi dilué avec un réactif de transfection dilué et incubez de cinq à 10 minutes à température ambiante. Pendant l'incubation, retirez le milieu des cellules et ajoutez deux millilitres de milieu frais sans antibiotiques.Préchauffer à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajouter 250 microlitres des complexes de réactif de transfection d'ARNsi dans chaque puits de cellules placées dans une plaque à six puits. Puis incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Après 24 heures, diluez cinq microlitres d'ARNi à 10 micromolaire dans 130 microlitres de milieu à faible sérum et procédez à un deuxième cycle de transfection, comme vient d'être indiqué. La forte concentration d'ARNi lors du deuxième cycle est essentielle pour obtenir une efficacité élevée de l'extinction de BRCA2.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours avant l'analyse afin de préparer le lysat cellulaire pour une analyse par immunoblot. Préparer un tampon de lyse frais selon la recette indiquée ici. Retirer le milieu des cellules et ajouter deux millilitres par puits de PBS glacé pour laver les cellules.Ensuite, retirez complètement le PBS de la plaque et ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse glacé à chacun. Agitez doucement la plaque en la faisant tourner uniformément afin de répartir le tampon de lyse, puis incubez-la sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Puis, à l’aide d’un grattoir à cellules.Recueillir le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse sur glace, centrifuger à 17 900 G et à quatre degrés Celsius pendant 25 minutes, puis récupérer le surnageant pour réaliser une analyse par immunoblot. Préparer le tampon de migration en diluant 50 millilitres de tampon de migration SDS-tris acétate 20 x avec 950 millilitres d'eau distillée. Préparer l'échantillon comme suit.Ajouter 15 microgrammes de lysat cellulaire total. Cinq microlitres de tampon d'échantillonnage 4 x contenant du sulfate de lithium ESAL, pH 8,42, deux microlitres de DTT 0,5 molaire et du tampon de lyse, pour un volume total de 20 microlitres. Dénaturer les échantillons à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes.Il est essentiel d'utiliser cette température, car la protéine b RCA deux est thermosensible. Ensuite, préparez la chambre électrophorétique conformément aux instructions du fabricant. Puis chargez les échantillons avec 10 microlitres d'un standard protéique de haut poids moléculaire sur un gel préfabriqué et faites-les migrer à 120 volts pendant environ deux heures.Entre-temps, préparez le tampon de transfert avec 50 millilitres de tampon de transfert 20 x, 100 millilitres de méthanol à 100 % et 850 millilitres d'eau. Activez la membrane PVDF en la trempant dans du méthanol à 100 % pendant cinq minutes. Rincez à l'eau distillée et équilibrez dans le tampon de transfert pendant au moins cinq minutes.Imprégnez les éponges de l'appareil de transfert de tampon de transfert à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation. Arrêtez la course avant que le marqueur bleu de 55 kilodaltons ne quitte le gel préformé et assemblez le sandwich en commençant par trois éponges imbibées de tampon de transfert, puis un papier de trois mm saturé de tampon de transfert.Ensuite, ajoutez le gel, puis la membrane en PVDF activée, suivie d'une feuille de papier 3M imprégnée de tampon et enfin de trois éponges imprégnées. Placez l'empilement dans l'appareil et transférez les protéines à 350 milliampères pendant quatre heures à quatre degrés Celsius ou à 180 milliampères à quatre degrés Celsius toute la nuit. Après le transfert, utilisez du TBS pour laver la membrane et bloquez pendant une heure avec du TBST et du lait écrémé en poudre à 5 %.Ensuite, remplacer le tampon par neuf millilitres de tampon TBST contenant du lait et 30 microlitres d'anticorps polyclonal de lapin anti-BCA2, puis incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit. Après avoir lavé la membrane trois fois avec du TBST pendant dix minutes chacun, incuber le filtre pendant une heure avec un microlitre d'anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort, dilué dans 10 millilitres de tampon TBST contenant du lait. Après avoir lavé la membrane trois fois, effectuer la détection immunologique par chimiluminescence ECL selon les instructions du fabricant.Visualisez les bandes sur des films ECL haute résolution afin de confirmer la spécificité de l'ARNi contre BRCA1. Un ARNi désordonné a été utilisé en parallèle avec l'ARNi contre BRCA1, comme indiqué ici. Comme mentionné précédemment, il est important d'effectuer un deuxième cycle de transfection d'ARNi avec un rapport élevé entre l'ARNi et le réactif de transfection pour obtenir une forte efficacité de silençage de BRCA1.Les résultats présentés ici montrent la différence d'efficacité d'extinction entre l'utilisation d'un faible et d'un fort rapport siARN/transfection selon le type cellulaire. Le temps minimal optimal pour obtenir le niveau le plus élevé de silençage génique peut varier après le deuxième cycle de transfection d'ARNi ; par exemple, comme illustré sur cette figure, 24 heures suffisent pour les cellules thyroïdiennes NTHY, mais jusqu'à 48 heures sont nécessaires pour un extinction efficace de B RCA A two dans les cellules prostatiques PNT one A. L'extinction de b RCA two reste assez stable jusqu'au septième jour après le deuxième cycle de transfection. Comme mentionné précédemment, la dénaturation des lysats cellulaires à une température supérieure à 55 degrés Celsius entraîne une perte allant jusqu'à 50 % de la protéine B RCA A two.Dans cette expérience, la sensibilité des cellules PNT1A avec ARNc B RCA A deux fois silencé au rucaparib, un inhibiteur de la PARP, a été examinée après un traitement de 24 heures avec le médicament. Une diminution dépendante du temps de la prolifération cellulaire a été observée dans les cellules PNT1A appauvries en B RCA deux par rapport aux témoins. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait bien comprendre comment silencer des gènes codant pour de longues protéines à l’aide d’un ARNc et comment détecter efficacement leur produit protéique grâce à une procédure d’immunoblocage optimisée, outre BRC deux.Ce procédé peut être appliqué à de nombreuses autres protéines volumineuses difficiles à manipuler, en particulier lorsqu'elles sont exprimées à des niveaux très faibles dans les cellules.

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