Silence de

L'objectif général de cette procédure est de silencer l'expression de B RCA two par transfection de SIR A. Cela est réalisé en préparant d'abord les complexes de réactif de transfection SIR a. Ensuite, un premier cycle de transfection est effectué en ajoutant les complexes goutte à goutte sur une monocouche de cellules ayant atteint une confluence de 80 %. Puis, un second cycle de transfection SIR a est réalisé en utilisant un rapport plus élevé entre SIR A et le réactif de transfection.

Enfin, les monocouches cellulaires sont lavées avec du PBS glacé et les cellules sont lysées à quatre degrés Celsius à l’aide d’un tampon de lyse contenant un détergent. En définitive, une analyse par immunotransfert est utilisée pour démontrer la suppression de B RCA A deux au niveau protéique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet une inhibition efficace des gènes ainsi qu’une détection optimale des protéines de haut poids moléculaire, telles que le suppresseur de tumeur B RCA deux. Pour commencer, après avoir cultivé des monocouches de cellules épithéliales humaines à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une enceinte humidifiée, retirez le milieu de croissance et utilisez du PBS à température ambiante pour laver les cellules.

Pour détacher les cellules de la plaque, ajouter deux millilitres de solution de trypsine 0,25 % contenant 0,53 millimolaire de EDTA et incuber de trois à cinq minutes selon le type cellulaire. Neutraliser la trypsine en ajoutant deux millilitres de milieu de croissance complet contenant 10 % de FBS avant de transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres. Placer les tubes dans un rotor à godets oscillants et centrifuger à 320 à 330 Gs et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Utilisez cinq millilitres de milieu sans antibiotique pour resuspendre les culots avant de compter les cellules à l’aide d’une chambre de Burker ou d’un système de comptage automatisé. Ensuite, semez environ 0,5 à 1 × 10⁶ cellules dans deux millilitres de milieu sans antibiotique par puits de plaques à six puits, puis incubez pendant 24 heures jusqu’à une confluence de 80 %. Après l’incubation, procédez à un premier cycle de transfection en diluant six microlitres de réactif de transfection spécifique d’ARNi de type lipidique dans 130 microlitres de milieu à faible teneur en sérum.

Diluez trois microlitres d'ARNi à 10 micromolaire dans 130 microlitres de milieu à faible sérum. Mélangez l'ARNi dilué avec un réactif de transfection dilué et incubez de cinq à 10 minutes à température ambiante. Pendant l'incubation, retirez le milieu des cellules et ajoutez deux millilitres de milieu frais sans antibiotiques.

Préchauffer à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajouter 250 microlitres des complexes de réactif de transfection d'ARNsi dans chaque puits de cellules placées dans une plaque à six puits. Puis incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après 24 heures, diluez cinq microlitres d'ARNi à 10 micromolaire dans 130 microlitres de milieu à faible sérum et procédez à un deuxième cycle de transfection, comme vient d'être indiqué. La forte concentration d'ARNi lors du deuxième cycle est essentielle pour obtenir une efficacité élevée de l'extinction de BRCA2.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours avant l'analyse afin de préparer le lysat cellulaire pour une analyse par immunoblot. Préparer un tampon de lyse frais selon la recette indiquée ici. Retirer le milieu des cellules et ajouter deux millilitres par puits de PBS glacé pour laver les cellules.

Ensuite, retirez complètement le PBS de la plaque et ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse glacé à chacun. Agitez doucement la plaque en la faisant tourner uniformément afin de répartir le tampon de lyse, puis incubez-la sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Puis, à l’aide d’un grattoir à cellules.

Recueillir le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse sur glace, centrifuger à 17 900 G et à quatre degrés Celsius pendant 25 minutes, puis récupérer le surnageant pour réaliser une analyse par immunoblot. Préparer le tampon de migration en diluant 50 millilitres de tampon de migration SDS-tris acétate 20 x avec 950 millilitres d'eau distillée. Préparer l'échantillon comme suit.

Ajouter 15 microgrammes de lysat cellulaire total. Cinq microlitres de tampon d'échantillonnage 4 x contenant du sulfate de lithium ESAL, pH 8,42, deux microlitres de DTT 0,5 molaire et du tampon de lyse, pour un volume total de 20 microlitres. Dénaturer les échantillons à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Il est essentiel d'utiliser cette température, car la protéine b RCA deux est thermosensible. Ensuite, préparez la chambre électrophorétique conformément aux instructions du fabricant. Puis chargez les échantillons avec 10 microlitres d'un standard protéique de haut poids moléculaire sur un gel préfabriqué et faites-les migrer à 120 volts pendant environ deux heures.

Entre-temps, préparez le tampon de transfert avec 50 millilitres de tampon de transfert 20 x, 100 millilitres de méthanol à 100 % et 850 millilitres d'eau. Activez la membrane PVDF en la trempant dans du méthanol à 100 % pendant cinq minutes. Rincez à l'eau distillée et équilibrez dans le tampon de transfert pendant au moins cinq minutes.

Imprégnez les éponges de l'appareil de transfert de tampon de transfert à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation. Arrêtez la course avant que le marqueur bleu de 55 kilodaltons ne quitte le gel préformé et assemblez le sandwich en commençant par trois éponges imbibées de tampon de transfert, puis un papier de trois mm saturé de tampon de transfert.

Ensuite, ajoutez le gel, puis la membrane en PVDF activée, suivie d'une feuille de papier 3M imprégnée de tampon et enfin de trois éponges imprégnées. Placez l'empilement dans l'appareil et transférez les protéines à 350 milliampères pendant quatre heures à quatre degrés Celsius ou à 180 milliampères à quatre degrés Celsius toute la nuit. Après le transfert, utilisez du TBS pour laver la membrane et bloquez pendant une heure avec du TBST et du lait écrémé en poudre à 5 %.

Ensuite, remplacer le tampon par neuf millilitres de tampon TBST contenant du lait et 30 microlitres d'anticorps polyclonal de lapin anti-BCA2, puis incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit. Après avoir lavé la membrane trois fois avec du TBST pendant dix minutes chacun, incuber le filtre pendant une heure avec un microlitre d'anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort, dilué dans 10 millilitres de tampon TBST contenant du lait. Après avoir lavé la membrane trois fois, effectuer la détection immunologique par chimiluminescence ECL selon les instructions du fabricant.

Visualisez les bandes sur des films ECL haute résolution afin de confirmer la spécificité de l'ARNi contre BRCA1. Un ARNi désordonné a été utilisé en parallèle avec l'ARNi contre BRCA1, comme indiqué ici. Comme mentionné précédemment, il est important d'effectuer un deuxième cycle de transfection d'ARNi avec un rapport élevé entre l'ARNi et le réactif de transfection pour obtenir une forte efficacité de silençage de BRCA1.

Les résultats présentés ici montrent la différence d'efficacité d'extinction entre l'utilisation d'un faible et d'un fort rapport siARN/transfection selon le type cellulaire. Le temps minimal optimal pour obtenir le niveau le plus élevé de silençage génique peut varier après le deuxième cycle de transfection d'ARNi ; par exemple, comme illustré sur cette figure, 24 heures suffisent pour les cellules thyroïdiennes NTHY, mais jusqu'à 48 heures sont nécessaires pour un extinction efficace de B RCA A two dans les cellules prostatiques PNT one A. L'extinction de b RCA two reste assez stable jusqu'au septième jour après le deuxième cycle de transfection. Comme mentionné précédemment, la dénaturation des lysats cellulaires à une température supérieure à 55 degrés Celsius entraîne une perte allant jusqu'à 50 % de la protéine B RCA A two.

Dans cette expérience, la sensibilité des cellules PNT1A avec ARNc B RCA A deux fois silencé au rucaparib, un inhibiteur de la PARP, a été examinée après un traitement de 24 heures avec le médicament. Une diminution dépendante du temps de la prolifération cellulaire a été observée dans les cellules PNT1A appauvries en B RCA deux par rapport aux témoins. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait bien comprendre comment silencer des gènes codant pour de longues protéines à l’aide d’un ARNc et comment détecter efficacement leur produit protéique grâce à une procédure d’immunoblocage optimisée, outre BRC deux.

Ce procédé peut être appliqué à de nombreuses autres protéines volumineuses difficiles à manipuler, en particulier lorsqu'elles sont exprimées à des niveaux très faibles dans les cellules.