Silence de BRCA2 D'identifier les fonctions biologiques de BRCA2 réglementés nouveaux dans les cellules humaines en culture

L’objectif global de cette procédure est de réduire au silence l’expression de B RCA deux par transfection de SIR A. Ceci est accompli en préparant d’abord les complexes de réactifs de transfection SIR a. Ensuite, un premier tour de transfection est effectué en ajoutant des complexes goutte à goutte à une monocouche de cellules dont la fluidité est de 80 %. Ensuite, une deuxième série de SIR a transfection est effectuée en utilisant un rapport SIR, A/réactif de transfection plus élevé.

Enfin, les monocouches cellulaires sont lavées avec du PBS glacé et les cellules sont lysées à quatre degrés Celsius avec un tampon de lyse à base de détergent. En fin de compte, l’analyse par transfert Western est utilisée pour montrer le silençage de B RCA A deux au niveau de la protéine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet un silençage génique efficace ainsi qu’une détection optimale des protéines de haut poids moléculaire comme le suppresseur de tumeur B RCA deux Pour commencer après avoir cultivé des monocouches de cellules épithéliales humaines à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une chambre humidifiée, retirez le milieu de croissance et utilisez du PBS à température ambiante pour laver les cellules.

Pour détacher les cellules de la plaque, ajoutez deux millilitres de solution EDTA à 0,25 % de trypsine et 0,53 millimolaire et incubez pendant trois à cinq minutes selon le type de cellule. Neutralisez la trypsine en ajoutant deux millilitres de milieu de croissance complet contenant 10 % de FBS avant de transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres. Placez les tubes dans un rotor à godets oscillants et centrifugez-les à 320 à 330 G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Utilisez cinq millilitres de milieu sans antibiotique pour remettre les granules en suspension avant d’utiliser une chambre de burker ou un système de comptage automatisé pour compter les cellules. Ensuite, placez environ 0,5 à une fois 10 à six cellules dans deux millilitres de milieu sans antibiotique dans chaque puits de six plaques de puits et incubez pendant 24 heures jusqu’à 80 % de fluidité. Après l’incubation, procédez à un premier cycle de transfection en diluant six microlitres de réactif de transfection spécifique de l’ARNi à base de lipides dans 130 microlitres de milieu sérique réduit.

Diluer trois microlitres de 10 micromolaires de S irna dans 130 microlitres de milieu sérique réduit. Combinez l’ARNi dilué avec un réactif de transfection dilué et incubez pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, retirez le milieu des cellules et ajoutez deux millilitres de milieu frais sans antibiotiques.

Préchauffer à 37 degrés Celsius. Ensuite, à 250 microlitres des complexes de réactifs de transfection siRNA dans chaque puits de cellules dans une plaque à six puits. Ensuite, incubez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après 24 heures, diluez cinq microlitres de 10 micromolaires d’ARNi dans 130 microlitres de sérum réduit et procédez à un deuxième cycle de transfection est juste démontré. La forte concentration de sarna dans le second tour est essentielle pour obtenir une efficacité élevée de B rca. Un silence à deux.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours avant l’analyse afin de préparer le lysat cellulaire pour l’analyse par immuno-transfert. Préparez un tampon de lyse fraîche selon la recette indiquée ici. Retirez le milieu des cellules et ajoutez deux millilitres par puits de PBS glacé pour laver les cellules.

Une fois ensuite, retirez complètement le PBS de la plaque et ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse glacé à chacune. Eh bien, tournez doucement la plaque pour répartir uniformément le tampon de lyse et incubez sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Puis à l’aide d’un grattoir cellulaire.

Recueillir le lysat cellulaire dans un microtube de centrifugation sur une centrifugeuse à glace à 17 900 G et quatre degrés Celsius pendant 25 minutes et recueillir le surnaturel pour effectuer une analyse immuno-buvard. Préparez le tampon de coulée en diluant 50 millilitres de 20 x tampon de coulée SDS en tris-acétate avec 950 millilitres d’eau distillée. Préparez l’échantillon comme suit.

Ajouter 15 microgrammes de lysat cellulaire total. Cinq microlitres de quatre tampons d’échantillon contenant du sulfate de lithium ESAL, un pH de 8,42 microlitres de DTT de 0,5 molaire et un tampon de lyse pour un volume total de 20 microlitres. Dénaturez les échantillons à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Il est crucial d’utiliser cette température car la protéine b RCA two est thermosensible. Ensuite, installez la chambre électrophorétique selon les instructions du fabricant. Ensuite, chargez les échantillons dans 10 microlitres d’un étalon de protéine de recoloration de haut poids moléculaire sur un gel préfabriqué et faites fonctionner à 120 volts pendant environ deux heures.

Pendant ce temps, préparez le tampon de transfert avec 50 millilitres de 20 x tampon de transfert, 100 millilitres de 100 % de méthanol et 850 millilitres d’eau. Activez la membrane PVDF en l’trempant dans du méthanol à 100 % pendant cinq minutes. Rincer à l’eau distillée et équilibrer dans le tampon de transfert pendant au moins cinq minutes.

Faites tremper les éponges de l’appareil de transfert dans un tampon de transfert à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Arrêtez la course avant que le marqueur bleu de 55 kilodaltons ne quitte le gel préfabriqué et assemblez le sandwich en commençant par trois éponges imbibées de tampon de transfert. Puis un papier de trois mm saturé de tampon de transfert.

Ensuite, ajoutez le gel, puis la membrane PVDF activée, suivie d’un papier de qualité 3M imbibé de tampon et enfin de trois éponges imbibées. Placez la pile dans l’appareil et transférez les protéines à 350 milliampères pendant quatre heures et quatre degrés Celsius ou à 180 milliampères et quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après le transfert, utilisez TBS pour laver la membrane et bloquer pendant une heure avec du TBST et 5 % de lait écrémé en poudre.

Remplacez ensuite le tampon par neuf millilitres de tampon de lait TBST contenant 30 microlitres d’anticorps polyclonaux anti-BCA et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir utilisé TBST pour laver la membrane trois fois pendant 10 minutes chacune, incubez le filtre pendant une heure avec un microlitre d’anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort dilué dans 10 millilitres de tampon de lait TBST. Après avoir lavé la membrane trois fois, effectuez l’immunodétection par luminescence KEMMA en suivant les instructions du fabricant.

Visualisez les bandes sur des films ECL haute résolution pour confirmer la spécificité de B rca. Un silence à deux. Un irna brouillé a été utilisé côte à côte avec B RCA deux irna comme indiqué ici comme mentionné précédemment, il est important d’effectuer un deuxième tour de transfection d’irna avec un rapport irna à transfection élevé pour obtenir une efficacité élevée de B RCA A deux silence.

Les résultats montrent ici la différence d’efficacité de knockdown entre l’utilisation d’un rapport siRNA/transfection faible et élevé selon le type de cellule. Le temps minimum optimal pour obtenir le niveau le plus élevé de silençage génique peut varier après le deuxième tour de transfection de siRNA, par exemple, comme le montre cette figure, 24 heures sont suffisantes pour les cellules thyroïdiennes NTHY, mais jusqu’à 48 heures sont nécessaires pour une efficacité B RCA A deux knockdown dans PNT un A cellules de la prostate b RCA deux silençage est assez stable jusqu’au septième jour après le deuxième tour de transfection. Comme mentionné précédemment, la dénaturation des lysats cellulaires à une température supérieure à 55 degrés Celsius entraîne jusqu’à 50 % de perte de protéine B RCA A deux.

Dans cette expérience, la sensibilité de B RCA A deux cellules PNT silencieuses une cellule A à l’inhibiteur de PARP rucaparib a été examinée après un traitement de 24 heures avec le médicament. Une diminution de la prolifération cellulaire en fonction du temps a été observée dans les cellules B RCA, deux cellules PNT appauvries et une cellule A par rapport aux témoins. Après avoir regardé cette vidéo, il devrait avoir une bonne compréhension de la façon de réduire au silence les gènes codant pour les protéines longues par un ARNC et comment détecter efficacement leur produit protéique grâce à une procédure d’immunoblocage optimisée en plus de BRC deux.

Cette matière peut être appliquée à de nombreuses autres grandes protéines difficiles, en particulier lorsqu’elles sont exprimées à de très faibles niveaux dans les cellules.