Évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base à base de CRISPR

En induisant efficacement des mutations ponctuelles à l’aide de l’éditeur de bases de cytosine à base CRISPR, la fonctionnalité des variantes BRCA1, qui est importante pour la prévention et le diagnostic des maladies, peut être identifiée. L’avantage de cette technique est qu’elle mute directement brca1 exprimé endogènement, qui surmonte la limitation de l’évaluation fonctionnelle utilisant BRCA1 exogènement exprimé. L’identification de la perte des mutations de fonction de BRCA1 peut être employée pour prévoir le risque de développer des cancers liés aux mutations brca1, telles que des cancers du sein, de l’ovaire, de la prostate, et du pancréas.

Il peut également être utilisé pour trouver des cibles médicament potentielles en recherchant des gènes essentiels dont la viabilité est réduite par épuisement fonctionnel. Pour commencer, obtenez la séquence du génome BRCA1 de GenBank à NCBI et recherchez les 20 sites cibles de la paire de base avec la séquence de motifs adjacents protospacer, NGGNCCN, autour de la mutation d’intérêt. La mutation d’intérêt devrait être située dans quatre à huit nucléotides dans l’extrémité PAM-distal des séquences cibles d’ARN guide.

Commandez deux oligonucléotides gratuits par ARN guide. Pour les oligonucléotides avant, ajouter CACCG à la 5'end de la séquence de guide et pour les oligonucléotides inverses, ajouter AAC à la 5'end et C à la 3'end. Après avoir reçu les oligonucléotides, les resuspendre dans de l’eau distillée à une concentration finale de 100 micromolaires.

Mélanger les deux oligonucléotides gratuits à une concentration finale de 10 micromolaires avec tampon de ligature T4 et les chauffer à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis les refroidir à température ambiante pour l’annealage. Digérer le pRG2 à l’aide de l’enzyme de restriction Bsa1 pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis faire fonctionner le produit digéré sur un gel agarose de 1 % et purifier la bande de taille appropriée. Ligate le duplex oligonucléotide annealed à l’ADN vectoriel en utilisant la ligase d’ADN acheté selon le protocole du fabricant et les transformer en cellules DH5-alpha compétentes.

Ajouter les transformateurs à une plaque d’agar contenant 100 microgrammes par ampicilline millilitre et incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Purifier l’ADN plasmatique de plusieurs transformateurs et analyser leurs séquences d’ARN guide par séquençage Sanger avec des amorces qui priment au promoteur U6. Graine cinq fois 10 à la cinquième cellules HAP1-BE3 par puits dans des plaques de 24 puits un jour avant la transfection et leur culture pour atteindre 70 à 80% de confluence pour la transfection.

Transfect BRCA1 guide de ciblage des ARN à l’aide des reagents de transfection achetés selon le protocole du fabricant. Utilisez un microgramme d’ARN guide de ciblage BRCA1 pour inciter le CG à la conversion ta aux sites cibles BRCA1, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius et la sous-culture tous les trois à quatre jours. Récoltez les granulés cellulaires trois, 10 et 24 jours après la transfection pour analyser l’efficacité de l’édition de base.

Extraire l’ADN génomique à l’aide du kit de purification de l’ADN génomique. Concevoir les premières amorces PCR pour amplifier les sites cibles BRCA1. Bien qu’il n’y ait aucune restriction quant à la taille du premier produit PCR, il est recommandé d’utiliser une taille de produit inférieure à un kilobase pour amplifier efficacement une région spécifique.

Concevoir les deuxièmes amorces PCR situées à l’intérieur du premier produit PCR, en tenant compte de la taille de l’amplicon selon la longueur de lecture NGS. Afin d’attacher des séquences essentielles pour l’analyse NGS, ajouter des séquences supplémentaires aux 5'ends des deuxièmes amorces PCR. Amplifiez les sites cibles BRCA1 sur l’ADN génomique obtenu à partir des trois points de temps à l’aide de polymése haute fidélité.

Pour la première réaction pcr, utilisez 100 nanogrammes d’ADN génomique pour l’amplification sur 15 cycles. Pour la deuxième réaction PCR, utilisez un microlitre du premier produit PCR pour l’amplification sur 20 cycles. Exécutez cinq microlitres du deuxième produit PCR sur du gel agarose de 2 % et confirmez la taille.

Ensuite, fixez les séquences essentielles pour l’analyse NGS en amplifiant le deuxième produit PCR à l’aide des amorces énumérées dans le manuscrit du texte. Amplifiez chaque échantillon à l’aide d’ensembles d’amorce différents. Utilisez un microlitre du deuxième produit PCR pour un jusqu’à 30 cycles d’amplification avec une polymése haute fidélité.

Exécutez cinq microlitres du produit PCR sur du gel agarose de 2 % pour confirmer la taille et purifier l’amplicon à l’aide d’un kit commercial de nettoyage PCR. Mélangez chaque échantillon en quantités égales pour créer une bibliothèque NGS. Quantifier la bibliothèque NGS à l’aide d’un spectrophotomètre et la diluer à une concentration d’un nanomolaire à l’aide d’un tampon de resuspension ou de 10 millimolaires Tris-HCl au pH 8,5.

Préparer 100 microlitres de la bibliothèque dilués à la concentration de chargement appropriée. Comme un contrôle combiné PhiX avec l’échantillon dilué. Chargez la bibliothèque sur la cartouche et exécutez ngs selon le protocole du fabricant.

Obtenez plus de 10 000 lectures par amplicon cible pour une analyse approfondie de l’efficacité de l’édition de base. Ce protocole a été utilisé pour effectuer une évaluation fonctionnelle des variantes endogènes BRCA1 générées par les éditeurs de base de cytosine à base de CRISPR. Cas-9 et RNAs de guide ont été transfectés dans les lignes cellulaires HAP1 pour perturber BRCA1, et des fréquences de mutation ont été analysées.

Les fréquences de mutation ont diminué de façon significative au fil du temps dans les lignées cellulaires HAP1, ce qui indique que BRCA1 est un gène essentiel à la viabilité cellulaire de ces cellules. Pour étudier si les variantes substituées de CG à TA affectent la fonction de BRCA1, les plasmides d’ADN et les ARN de guide de codage qui pourraient induire chaque mutation ont été transfected pour avoir des lignes cellulaires HAP1-BE3. Et les fréquences de substitution ont été analysées.

Les fréquences de substitution relative de 3598C à T, une variante pathogène qui induit une mutation absurde, ont considérablement diminué. Alors que ceux de 4527C à T, une variante bénigne qui induit une mutation absurde, sont restés similaires avec le temps. On a constaté que les fréquences de substitution de nucléotide de ces trois variantes ont diminué d’une manière dépendante du temps.

Puisqu’il est nécessaire d’obtenir une fréquence initiale élevée de mutation afin de reconnaître clairement le changement dans la viabilité cellulaire avec le passage de la date, il est une priorité d’établir des conditions optimisées de transfection. Cette procédure peut être appliquée pour vérifier d’autres variantes génétiques inconnues telles que BRCA VUS. Il peut fournir des indices sur la pathopérité des variantes inconnues dérivées du patient et leur traitement.