Name: Évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base à base de CRISPR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Découvrez l'évaluation fonctionnelle des variants BRCA1 par édition de bases CRISPR dans des cellules vivantes. Cette méthode permet de prédire les risques de cancer et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

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Ces travaux ont été soutenus par la National Research Foundation of Korea (subventions 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637, et 2018R1A5A2020732 à Y.K.).

<ol><li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li>
<li>Kuchenbaecker, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+of+Breast%2C+Ovarian%2C+and+Contralateral+Breast+Cancer+for+BRCA1+and+BRCA2+Mutation+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers.</a> Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).</li>
<li>Millot, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+for+functional+analysis+of+BRCA1+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance.</a> Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).</li>
<li>Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+evaluation+of+BRCA1+and+BRCA2+unclassified+variants+identified+in+Portuguese+breast%2Fovarian+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).</li>
<li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiplex+Homology-Directed+DNA+Repair+Assay+Reveals+the+Impact+of+More+Than+1%2C000+BRCA1+Missense+Substitution+Variants+on+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function.</a> American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).</li>
<li>Anantha, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+mutational+landscapes+of+BRCA1+for+homology-directed+repair+and+therapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transience+of+transient+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li>
<li>Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+BRCA1+through+its+coding+sequence+by+the+miR-15%2F107+group+of+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs.</a> Frontiers in Genetics. 6, 242(2015).</li>
<li>Saunus, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+breast+cancer+susceptibility+gene+BRCA1+by+the+RNA+binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR.</a> Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).</li>
<li>Knott1, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361, 866-869 (2018).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Hess, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+using+dCas9-targeted+somatic+hypermutation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
<li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Base+Editing+via+RNA-Guided+Cytidine+Deaminases+in+Xenopus+laevis+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos.</a> Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).</li>
<li>Kweon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-based+base-editing+screen+for+the+functional+assessment+of+BRCA1+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants.</a> Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+classification+of+BRCA1+variants+with+saturation+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing.</a> Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).</li>
<li>Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas-based+customization+of+pooled+CRISPR+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries.</a> PLoS One. 13 (6), 0199473(2018).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).</li>
<li>Sayers, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).</li>
<li>Hwang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+design+and+analysis+tools+for+CRISPR+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 542(2018).</li>
<li>Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+target+specificity+of+CRISPR+RNA-guided+adenine+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors.</a> Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).</li>
<li>Clement, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPResso2+provides+accurate+and+rapid+genome+editing+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. , (2020).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+target+specificities+of+CRISPR+RNA-guided+programmable+deaminases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+base+editor+generates+substantial+off-target+single-nucleotide+variants+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos.</a> Science. 364 (6437), 289-292 (2019).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine%2C+but+not+adenine%2C+base+editors+induce+genome-wide+off-target+mutations+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.</a> Science. 364 (6437), 292-295 (2019).</li>
<li>Grunewald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+off-target+RNA+editing+induced+by+CRISPR-guided+DNA+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors.</a> Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).</li>
<li>Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+minimization+of+Cas9-independent+off-target+DNA+editing+by+cytosine+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+A%2AT+to+G%2AC+in+genomic+DNA+without+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage.</a> Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit une méthode simple pour les évaluations fonctionnelles des variantes BRCA1 à l’aide de l’éditeur de base de cytosine médité par CRISPR. Le protocole décrit les méthodes de conception des ARN à locus cible et de construction des ADN plasmides à partir de laquelle ils sont exprimés. Les éditeurs de base de cytosine induisent la conversion nucléotide dans une fenêtre active (en cas de BE3, nucléotides 4-8 dans l’extrémité PAM-distal des séquences cibles de gRNA). Le chercheur doit choisir soigne...

Le gène de susceptibilité de type 1 du cancer du sein (BRCA1) est un gène suppresseur de tumeur largement connu. Puisque le gène BRCA1 est lié à la réparation des dommages d’ADN, les mutations dans ce gène conduirait à un plus grand risque de développement de cancer dans unindividu 1. Les cancers du sein, de l’ovaire, de la prostate et du pancréas sont liés à des mutations héréditaires de perte de fonction (LOF) du gène BRCA1 2. L’évaluation fonctionnelle et l’identification des variantes BRCA1 peuvent aider à prévenir et à diagnostiquer les diverses maladies. Pour répondre à la fonction des variantes BRCA1, plusieurs méthodes ont été développées et largement utilisées pour étudier la pathogénie des variantes BRCA1 telles que les essais de viabilité des cellules souches embryonnaires, les essais de reporter fluorescent et les essais thérapeutiques de sensibilité à base demédicaments 3,4,5,6. Bien que ces méthodes aient évalué la fonction d’un grand nombre de variantes BRCA1, les méthodes impliquant des variantes BRCA1 exprimées exogènement posent des limites en termes de surexpression qui pourraient affecter la régulation en aval, la posologie des gènes et le pliage desprotéines 7. En outre, ces analyses ne peuvent pas être exploitées au règlement posttranscriptionnel tel que l’épissage d’ARNm, la stabilité de transcription, et l’effet de la régionnon traduite 8,9.
Le système CRISPR-Cas9 permet l’édition ciblée du génome dans les cellules vivantes et lesorganismes 10. Grâce à un ARN à guide unique, Cas9 peut induire des ruptures à double brin (DSB) dans l’ADN chromosomique à des loci génomiques spécifiques afin d’activer deux voies de réparation de l’ADN : la voie de jointage final non homologue sujette aux erreurs (NHEJ) et la voie de réparation dirigée par homologie sans erreur (HDR)11. HDR est un mécanisme de réparation précis; cependant, les DSBs induits par la nucléase de Cas9 pour HDR ont souvent comme conséquence l’insertion et la mutation non désirées d’insertion et de suppression (indélébile). En outre, il a besoin de modèles d’ADN de donneur homologue pour réparer les dommages causés par l’ADN et a une efficacité relativement faible. Récemment, Cas9 nickase (nCas9) ont été fusionnés avec des domaines deaminase de cytidine pour cibler les substitutions C:G à T:A, sans avoir besoin de modèles d’ADN homologues et de ruptures de double brin d’ADN12,13,14,15. En utilisant l’éditeur de base de cytosine, nous avons développé une nouvelle méthode pour l’analyse fonctionnelle des variantes BRCA116.
Dans cette étude, nous avons utilisé l’éditeur de base de cytosine crispr-négocié, BE314, qui induit des mutations efficaces de C:G à T:A point, pour mettre en œuvre l’évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 et a identifié avec succès les fonctions de plusieurs variantes BRCA1 (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig01.jpg"> Figure 1 : Aperçu du flux de travail pour l’évaluation fonctionnelle. (A) Schéma montrant l’évaluation fonctionnelle de BRCA1. Puisque le LOF de BRCA1 affecte la viabilité cellulaire, quand la mutation BRCA1 est pathogène, les cellules meurent pendant que le nombre de passage augmente. (B) Étapes de l’évaluation fonctionnelle de BRCA1. La boîte pointillée est facultative. Il peut être remplacé par la co-transfection de l’expression de l’ARN g et be3 exprimant l’ADN des plasmides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>Blasticidine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113903</td><td>Médicament pour la sélection des cellules transduites</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de tissus</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Kit de préparation de l’ADN génomique</td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Medium pour HEK293T/17 cellules</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td>Supplemetal pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>FuGENE HD Réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Gibson kit de montage</td></tr><tr><td>Iscove' s modifié Dulbecco' s milieu</td><td>Gibco</td><td>12440046</td><td>Milieu pour cellules HAP1</td></tr><tr><td>lentiCas9-Blast</td><td>Addgene</td><td>52962</td><td>Plasmides ADN pour clonage lentiBE3</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco 31985070</td><td></td><td>Matériaux de transfection</td></tr><tr><td>pCMV-BE3</td><td>Addgene</td><td>73021</td><td>Plasmides ADN pour lentiBE3 clonage</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Supplemetal pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Phusion ADN haute fidélité polymérase</td><td>NEB</td><td>M0530SQ</td><td>Polymérase haute fidélité</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Plasmides ADN pour la préparation du virus.</td></tr><tr><td>pRG2</td><td>Addgene</td><td>104174</td><td>vecteur de clonage d’ARNg</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>ADN plasmidique pour la préparation du virus.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Kit de préparation de l’ADN plasmidique</td></tr><tr><td>QIAquick Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Kit d’extraction de gel</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purification</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Kit de préparation de produit PCR</td></tr><tr><td>Quick Ligation</td><td>Kit NEB</td><td>M2200</td><td>Ligase pour clonage d’ARNg</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Matériaux pour le dosage T7E1</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td>Enzyme de restriction</td></tr></tbody></table>

Évaluation fonctionnelle des variantes brca1 à l’aide d’éditeurs de base à base de crispr

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Des études récentes ont étudié les risques associés aux mutations du gène BRCA1 à l’aide de diverses méthodes d’évaluation fonctionnelles telles que les essais de reporter fluorescent, les essais de viabilité des cellules souches embryonnaires et les tests thérapeutiques de sensibilité à base de médicaments. Bien qu’ils aient clarifié beaucoup de variantes BRCA1, ces analyses impliquant l’utilisation de variantes BRCA1 exprimées exogènement sont associées à des problèmes de surexpression et ne peuvent pas être appliquées à la régulation post-transcriptionnelle. Pour résoudre ces limitations, nous avons précédemment rapporté une méthode pour l’analyse fonctionnelle des variantes BRCA1 par l’intermédiaire de l’éditeur de base de cytosine CRISPR-mentté qui induisent la substitution ciblée de nucléotide dans les cellules vivantes. En utilisant cette méthode, nous avons identifié des variantes dont les fonctions restent ambiguës, y compris c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T, et c.4986+5G>A, et a confirmé que les éditeurs de base crispr-médiatisés sont des outils utiles pour reclassifier les variantes d’importance incertaine dans BRCA1. Ici, nous décrivons un protocole pour l’analyse fonctionnelle des variantes BRCA1 utilisant l’éditeur de base de cytosine crispr-basé. Ce protocole fournit des lignes directrices pour la sélection des sites cibles, l’analyse fonctionnelle et l’évaluation des variantes BRCA1.

Les approches expérimentales décrites dans ce protocole permettent l’évaluation fonctionnelle des variantes endogènes brca1 générées par les éditeurs de base de cytosine à base de CRISPR. Pour sélectionner les lignées cellulaires appropriées pour l’évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1, les chercheurs devraient confirmer que BRCA1 est un gène essentiel dans les lignées cellulaires ciblées. Par exemple, nous avons d’abord transfecté cas9 et gARN en lignées cellulaires HAP1 pour perturber ...

Les personnes atteintes de mutations BRCA1 ont un risque plus élevé de développer un cancer, ce qui justifie une évaluation précise de la fonction des variantes BRCA1. Ci-après, nous avons décrit un protocole pour l’évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base de cytosine à base crispr- médiatisés qui permettent la conversion ciblée de C:G à T:A dans les cellules vivantes.

Évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base à base de CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

En induisant efficacement des mutations ponctuelles à l’aide de l’éditeur de bases de cytosine à base CRISPR, la fonctionnalité des variantes BRCA1, qui est importante pour la prévention et le diagnostic des maladies, peut être identifiée. L’avantage de cette technique est qu’elle mute directement brca1 exprimé endogènement, qui surmonte la limitation de l’évaluation fonctionnelle utilisant BRCA1 exogènement exprimé. L’identification de la perte des mutations de fonction de BRCA1 peut être employée pour prévoir le risque de développer des cancers liés aux mutations brca1, telles que des cancers du sein, de l’ovaire, de la prostate, et du pancréas.Il peut également être utilisé pour trouver des cibles médicament potentielles en recherchant des gènes essentiels dont la viabilité est réduite par épuisement fonctionnel. Pour commencer, obtenez la séquence du génome BRCA1 de GenBank à NCBI et recherchez les 20 sites cibles de la paire de base avec la séquence de motifs adjacents protospacer, NGGNCCN, autour de la mutation d’intérêt. La mutation d’intérêt devrait être située dans quatre à huit nucléotides dans l’extrémité PAM-distal des séquences cibles d’ARN guide.Commandez deux oligonu

functional-assessment-brca1-variants-using-crispr-mediated-base

Research

Recherche

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Recherche sur le cancer

Nous fournissons une méthode pour tester des variantes du gène BRCA1 dans un essai de culture de tissus basées pour la réparation recombinaison homologue des dommages à l'ADN en appauvrissant protéine BRCA1 endogène à partir d'une cellule à l'aide d'ARNi et le remplacer par un mutant BRCA1 points qui contient un changement de codage.

Identifier les effets des mutations du gène BRCA1 sur la recombinaison homologue en utilisant les cellules qui expriment endogène de type sauvage du gène BRCA1

Cette vidéo décrit une méthode de criblage pour identifier les mouches Drosophila transgéniques, dont le génome a été modifié à l’aide de CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 est un puissant outil d'édition du génome qui a révolutionné la façon dont les scientifiques peuvent manipuler le génome d'un organisme. Dans l’exemple de protocole, nous verrons comment identifier les mutants générés par CRISPR, dans lesquels l’insertion d’une séquence de transactivation remplace le premier exon du gène sans branche...

Dépistage des modifications génomiques : une méthode pour identifier les mutants générés par CRISPR chez la drosophile

Cette vidéo explique le concept des éditeurs de bases de cytosine médiés par CRISPR pour induire une substitution nucléotidique ciblée.

Outils d’édition de base médiés par CRISPR : une technique d’édition du génome pour induire une substitution de base ciblée

l’enrichissement de l’ADNg pour le séquençage NGS est un outil simple et puissant pour l’étude des mutations constitutionnelles. Dans cet article, nous présentons la procédure pour analyser simplement la séquence complète de 11 gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN.

ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de BRCA1, BRCA2, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN

SAE-CRISPR est une technologie puissante à l’ingénieur les génomes complexes de plantes et d’animaux. Ici, nous détaillons un protocole pour modifier efficacement le génome humain endonucléases de Cas différents. Nous mettons en évidence les considérations importantes et des paramètres de conception pour optimiser l’efficacité édition.

Modification du génome dans des lignées de cellules mammifères à l’aide de CRISPR-Cas

L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.

CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

Ce protocole décrit un flux de travail d’édition de gènes CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) à haut débit pour l’analyse de réseaux de microARN qui permet la génération rapide d’un panel de lignées cellulaires génétiquement modifiées portant des combinaisons uniques de délétion de membres de clusters de miARN allant jusqu’à 35 kb dans une seule expérience.

Outil d’édition de gènes CRISPR pour l’analyse de réseaux de microARN

Ce protocole décrit comment effectuer une édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM pour construire un modèle précis de maladie du poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e.

Édition de base efficace sans PAM pour la modélisation des maladies génétiques humaines chez le poisson zèbre avec zSpRY-ABE8e

Un obstacle important aux technologies comme CRISPR est les événements hors cible qui peuvent perturber les gènes vitaux. La « circularisation pour la notification in vitro des effets de clivage par séquençage » (CIRCLE-seq) est une technique conçue pour identifier les sites de clivage non intentionnels. Cette méthode cartographie l’activité à l’échelle du génome de CRISPR-Cas9 avec une sensibilité élevée et sans biais.

CIRCLE-Seq pour l’interrogation de l’édition de gènes hors cible

La délivrance des éditeurs génomiques sous forme d’ARN est un moyen particulièrement puissant de modifier les génomes des cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères. L’objectif de ce protocole est de délivrer des éditeurs de génome sous forme d’ARNm dans les cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères, suivis d’un séquençage ciblé Illumina et d’une analyse afin de quantifier les résultats d’édition.

Édition génomique dans les cellules primaires de mammifères via électroporation de l’ARN éditeur

Découvrez l'évaluation fonctionnelle des variants BRCA1 par édition de bases CRISPR dans des cellules vivantes. Cette méthode permet de prédire les risques de cancer et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base à base de CRISPR

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