Dosage de l’absorption des vésicules extracellulaires : méthode de visualisation et de quantification de l’absorption cellulaire des vésicules extracellulaires à l’aide d’une technique d’imagerie par fluorescence 3D

Pour faciliter la communication cellulaire, les cellules sécrètent des vésicules extracellulaires, des VE - des structures de taille nanométrique entourées d’une membrane lipidique. Les VE transportent diverses cargaisons biologiques, y compris des macromolécules et des métabolites, pour les livrer aux cellules réceptrices.

Pour visualiser l’absorption des VE par les cellules à l’aide de la microscopie confocale, prenez d’abord des VE fraîchement isolés. Ces VE sont pré-marqués avec des anticorps liés à une sonde fluorescente pour une visualisation ultérieure facile.

Ajoutez un volume adéquat de VE marqués par fluorescence à une culture cellulaire réceptrice adhérente. Incuber pendant la période souhaitée. Au cours de l’incubation, une sous-population des VE marqués se fixe superficiellement à la surface de la cellule, tandis que d’autres VE sont internalisés.

Ajoutez un colorant fluorescent différent pour marquer le cytoplasme cellulaire, ce qui permet de distinguer les VE internalisées de celles qui adhèrent à la cellule réceptrice. Placez les cellules sous un microscope confocal et imagez à différents plans focaux le long de l’axe z, en acquérant une série de sections optiques sur l’épaisseur de l’échantillon.

Compilez cette collection de sections optiques - une pile z - pour former une image d’échantillon tridimensionnelle haute résolution. Appliquez un rendu virtuel - un processus de post-imagerie - pour reconstruire les surfaces cellulaires.

Pour différencier les VE superficiellement adhérents des VE internalisés, rends-les sous forme de points de teintes différentes. Calculez le volume cellulaire et le nombre de VE qu’elles internalisent, en quantifiant l’absorption de VE par cellule.

Semez 4 x 10 cellules PC3 dans une boîte de 35 millilitres avec un milieu de 1 millilitre. Laissez les cellules adhérer pendant la nuit dans des conditions optimales de culture cellulaire. Le lendemain, lavez deux fois les cellules adhérentes avec un milieu appauvri en exosomes.

Après avoir dilué les VE marquées par fluorescence à la concentration appropriée à l’aide d’un milieu appauvri en exosomes, ajoutez les VE diluées aux cellules cibles adhérées et incubez pendant la durée expérimentale souhaitée. Après avoir éliminé les VE non internalisés en lavant les cellules trois fois avec un milieu exempt d’exosomes, marquez le cytoplasme des cellules adhérentes avec 1 μg/mL de CMTMR et incubez dans des conditions de culture cellulaire optimales.

Pour l’imagerie de cellules vivantes, placez les cellules préparées dans l’incubateur sur scène. Après avoir défini les paramètres d’imagerie en fonction des échantillons de contrôle, déterminez la profondeur des cellules cibles et la plage de taille d’empilement dans la direction z pour acquérir des images confocales 3D. Ensuite, réglez l’acquisition d’images sur plusieurs images empilées z de colorant spécifique à la cellule et de colorant spécifique à EV simultanément.

Pour le traitement d’image, utilisez un logiciel de traitement d’image automatique.

Pour construire des surfaces virtuelles des cellules, cliquez sur « Ajouter de nouvelles surfaces ». Pour configurer les surfaces de cellules virtuelles, cliquez sur le bouton « + Ajouter » et sélectionnez « Qualité » comme « Type de filtre ». Fixez le seuil de la valeur appropriée pour la limite inférieure par inspection visuelle, définissez la valeur maximale pour la limite supérieure et cliquez sur le bouton « Terminer ».

Ensuite, pour construire les points virtuels des VE, cliquez sur le bouton « Ajouter de nouveaux spots ». Sous « Paramètres de l’algorithme », sélectionnez « Différentes tailles de spot » et « Calcul de la distance la plus courte ». Ensuite, cliquez sur « Suivant » et sélectionnez « Canal 1 - Alexa Fluor 488 » comme « Canal source ». Entrez la valeur appropriée pour le « Diamètre XY estimé » sous « Détection ponctuelle » et cliquez sur « Suivant ».

Pour configurer les points EV virtuels, cliquez sur le bouton « + Ajouter » et sélectionnez « Qualité » comme « Type de filtre ». Réglez le « seuil inférieur » par une inspection visuelle et cliquez sur « Suivant ». Pour le « Type de régions ponctuelles », sélectionnez « Intensité absolue », puis cliquez sur « Suivant ».

Pour établir le seuil de la région des points EV, entrez la valeur appropriée pour « Seuil de région » par inspection visuelle. Sélectionnez « Diamètre de » sous « Volume de région » et cliquez sur « Terminer ».

Pour diviser les points groupés à l’intérieur de la surface construite, cliquez sur les « Spots » construits et allez dans « Filtres ». Ensuite, cliquez sur le bouton « Ajouter » et sélectionnez « Distance la plus courte par rapport aux surfaces Surfaces = Surface 1 » comme « Type de filtre ».

Après avoir défini le seuil le plus bas pour la limite basse et la valeur appropriée pour la limite supérieure, cliquez sur le bouton « Dupliquer la section vers les nouveaux spots ».

Pour compter automatiquement les VE à l’intérieur des cellules, cliquez sur la sélection « Spots 1 », allez dans « Statistiques » et exportez la valeur du « Nombre total de spots ».

Pour obtenir le nombre de cellules, cliquez sur l’icône « Surfaces 1 », puis allez dans « Statistiques » et exportez la valeur « Nombre total de surfaces » à partir de « Globalement ». Enfin, rendez-vous dans l’onglet « Détaillé » sous « Statistiques » pour exporter le volume.