Test d’impédance basé sur un réseau à trois chambres : une technique d’analyse en temps réel pour évaluer le potentiel invasif des cellules cancéreuses en mesurant l’impédance électrique

Les cellules stromales associées au cancer sécrètent des facteurs chimiques qui peuvent déclencher les cellules tumorales métastatiques résidant sur la membrane basale des tissus. Par conséquent, les cellules cancéreuses envahissent la membrane basale et migrent vers l’espace extracellulaire du tissu.

Pour mesurer la capacité invasive des cellules cancéreuses in vitro, commencez par une plaque multipuits avec plusieurs réseaux à trois chambres. Dans chaque réseau, la chambre inférieure a une culture adhérente de cellules stromales. La chambre supérieure avec des microélectrodes de mesure d’impédance fusionnées - des électrodes miniatures qui mesurent l’activité électrique d’une cellule - est recouverte de cellules cancéreuses, qui adhèrent à la membrane microporeuse recouverte d’une matrice extracellulaire présente au-dessus des électrodes.

Pendant l’incubation sur un analyseur basé sur l’impédance, les cellules stromales libèrent des facteurs chimiotactiques dans le milieu, qui se déplacent vers les cellules cancéreuses. Ces facteurs se déplacent à travers la membrane semi-perméable présente sur la face inférieure de la chambre centrale.

Les facteurs sécrétés par les cellules stromales signalent aux cellules cancéreuses adhérentes de se transformer en phénotypes invasifs. En réponse, les cellules invasives migrent à travers la membrane microporeuse pour atteindre les électrodes interdigitées du côté opposé de la membrane.

Au fil du temps, à mesure que de plus en plus de cellules cancéreuses adhèrent aux électrodes, elles provoquent une impédance cellulaire - une entrave à la circulation du courant par les cellules. La mesure de l’impédance cellulaire est révélatrice du potentiel invasif des cellules cancéreuses.

Placez les trois chambres stériles dans le capuchon de culture tissulaire. Placez le bouton sur le côté court de la chambre inférieure et orientez la chambre inférieure de manière à ce que le bouton soit face à l’expérimentateur.

Ajoutez 30 000 à 50 000 cellules dans 90 microlitres de média dans chaque puits à partir de la chambre inférieure sans former de bulles. Utiliser 5 % de milieu fœtal bovin supplémenté en sérum dans deux chambres inférieures comme contrôle positif de la motilité cellulaire, et utiliser un milieu supplémenté en sérum à 0 % comme témoin négatif.

Faites pivoter la chambre inférieure à 90 degrés après l’avoir laissée reposer pendant 10 à 15 minutes dans la hotte. Ensuite, placez la chambre centrale sur le dessus, de sorte que le bouton de la chambre inférieure glisse dans l’encoche de la chambre centrale. Poussez la chambre verticalement vers le bas, jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre de chacun des côtés longs de l’ensemble.

Ajoutez 160 microlitres de milieu sans sérum dans tous les puits de la chambre centrale. Assurez-vous qu’un ménisque en forme de dôme est visible après le remplissage des puits et placez la chambre supérieure, avec les électrodes vers le bas, sur la chambre centrale pour aligner les points bleus sur les chambres centrale et supérieure. Poussez la chambre verticalement vers le bas jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre de chacun des côtés longs de l’ensemble.

Ajoutez 20 à 50 microlitres de milieu sans sérum dans la chambre supérieure. Montez l’ensemble sur l’analyseur de cellules à double usage dans l’incubateur de culture tissulaire et attendez 30 minutes avant de mesurer le bruit de fond.

Ouvrez le logiciel de l’analyseur de cellules, puis sélectionnez la station d’accueil à utiliser, puis cliquez sur l’onglet « Message », et assurez-vous qu’il indique « Connexions OK » pour vous assurer que la matrice est bien placée dans la station d’accueil et que les électrodes sont bien alignées avec les capteurs.

Cliquez sur l’onglet « Notes de l’expérience » et remplissez toutes les informations possibles sur l’expérience. Ensuite, cliquez sur l’onglet 'Mise en page' et remplissez la description de la disposition du tableau. Ensuite, cliquez sur l’onglet 'Planifier' et ajoutez deux étapes à partir du menu 'Étapes' ; une étape d’arrière-plan avec un balayage et une étape de test avec 100 balayages.

Une fois que la matrice a été dans l’incubateur d’analyseur de cellules à double usage pendant 30 minutes, cliquez sur le bouton « Lecture » pour lancer la mesure de l’arrière-plan.

Une fois la mesure de l’arrière-plan terminée, retirez le réseau du socle et remettez-le dans le capot de culture cellulaire. Ensuite, ajoutez 30 000 à 50 000 cellules dans 100 microlitres de milieu sans sérum dans chaque puits de la chambre supérieure. Ce sont les cellules que l’électrode détectera une fois qu’elles auront migré avec succès à travers la membrane.

Laissez l’ensemble reposer dans le capot pendant 30 minutes avant de le monter sur l’analyseur de cellules à double usage pour la mesure d’impédance.

Replacez la matrice dans l’analyseur de cellules à double usage et vérifiez l’onglet « Message » pour le message « Connexions OK ». Cliquez sur le bouton « Play » pour lancer la mesure d’impédance, puis cliquez sur l’onglet « Tracer » pour surveiller la progression du signal.

Si le point final est atteint avant 25 heures, cliquez sur l’étape « Abandonner » dans le menu déroulant « Exécuter ». Pour exporter des données, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le graphique, choisissez « Copier » dans le format de liste, puis collez les données dans une feuille de calcul.