Dosage de l’efférocytose à cellules fixes : méthode d’étude de l’absorption efférocytaire des cellules apoptotiques par les macrophages à l’aide de la microscopie à fluorescence

Les cellules subissant l’apoptose - mort cellulaire programmée - affichent des signaux eat-me à leur surface cellulaire, facilitant la dégradation par les phagocytes - des cellules immunitaires spécialisées. Ce processus d’élimination des cellules apoptotiques s’appelle l’efférocytose.

Pour effectuer le test d’efférocytose, prenez d’abord une suspension de cellules apoptotiques à double coloration. Les surfaces de ces cellules sont marquées avec de la biotine, et le cytoplasme est marqué avec un colorant de suivi cellulaire, marquant les matériaux dérivés de cellules apoptotiques.

Ajoutez la suspension cellulaire dans une culture de cellules macrophages collées, qui fonctionnent comme des efférocytes. Centrifuger, forçant le contact entre les macrophages et les cellules apoptotiques, et incuber.

Les récepteurs efferocytaires des macrophages se lient à la phosphatidylsérine - un signal « mange-moi » - sur la membrane cellulaire apoptotique, facilitant son engloutissement. De petits fragments de la cellule apoptotique sont absorbés à l’intérieur d’une vésicule liée à une membrane, appelée efférosome.

Il en résulte une fraction efférocytosée - une partie de la cellule apoptotique à l’intérieur du macrophage - et une fraction non efférocytosée - la partie non internalisée de la cellule apoptotique.

Ajoutez de la streptavidine marquée par fluorescence, qui se lie aux molécules de biotine exposées à la surface de la fraction non efférocytosée, différenciant les parties non internalisées et internalisées de la cellule apoptotique.

Sous un microscope à fluorescence, la fraction cellulaire apoptotique non internalisée montre un marquage à la streptavidine, tandis que les efférosomes apparaissent comme des points discrets exempts de streptavidine.

Pour quantifier l’efférocytose, déterminez le nombre d’efférosomes discrets et mesurez l’intensité des fractions cellulaires apoptotiques efférocytosées et non efférocytosées.

Après avoir préparé les macrophages humains et les cellules apoptotiques de Jurkat, utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules apoptotiques. Ensuite, transférez une quantité suffisante de cellules apoptotiques dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Granulez les cellules Jurkat par centrifugation à 500 fois g pendant 5 minutes. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS. Pendant que les cellules Jurkat sont dans la centrifugeuse, aliquote 10 microlitres de DMSO dans un nouveau tube de microcentrifugation.

Ensuite, dissolvez une quantité minimale de NHS-biotine dans le DMSO. Après cela, transférez 500 microlitres de cellule apoptotique et de suspension PBS dans le tube contenant du DMSO et de la biotine NHS. Ensuite, diluez un colorant de suivi cellulaire approprié selon les instructions du fabricant.

Incuber la suspension cellulaire à température ambiante pendant 20 minutes dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez un volume égal de RPMI 1640 avec 10 % de FBS et incubez la suspension à température ambiante dans l’obscurité pendant 5 minutes supplémentaires.

Après cela, granulez les cellules par centrifugation à 500 fois g pendant 5 minutes. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules colorées dans 100 microlitres de RPMI 1640 avec 10 % de FBS. Ajoutez 100 microlitres de suspension de cellules colorées goutte à goutte à chaque puits de macrophages. Ensuite, centrifugez la plaque à 200 fois g pendant 1 minute. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO₂ dans un incubateur de culture tissulaire.

Après la période d’incubation appropriée, retirez les cellules de l’incubateur. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 1 millilitre de PBS. Après cela, ajoutez de la streptavidine diluée conjuguée à la FITC dans chaque puits et incubez la plaque pendant 20 minutes dans l’obscurité.

Lavez les cellules trois fois avec 1 millilitre de PBS et secouez doucement les échantillons pendant 5 minutes après chaque rinçage. Ensuite, fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Rincez les cellules une fois avec du PBS pour éliminer tout excès de PFA.

Fixez des lamelles sur une lame d’imagerie et transférez la lame dans un microscope à fluorescence. Capturez des empilements z d’un nombre suffisant de cellules pour la quantification.