PCR numérique duplex pour la quantification simultanée de marqueurs génétiques doubles

La réaction en chaîne par polymérase numérique duplex (ddPCR) permet la détection quantitative simultanée de deux marqueurs génétiques distincts.

Pour commencer, prenez un échantillon contenant deux séquences cibles différentes. Ajoutez un mélange contenant une enzyme ADN polymérase thermostable, des dNTP et des amorces spécifiques à la cible. Ensuite, ajoutez deux sondes oligonucléotidiques spécifiques à la cible, marquées avec des rapporteurs fluorescents et une molécule d’extinction pour détecter les cibles amplifiées.

La solution est émulsionnée avec de l’huile pour répartir les séquences cibles en de nombreuses nanogouttelettes. Chaque gouttelette contenant la cible agit comme un récipient de réaction individuel.

Démarrez le processus de cyclage thermique pour la réaction d’amplification à l’intérieur des nanogouttelettes individuelles.

À une température de dénaturation élevée, les cibles à double brin se séparent en brins simples.

Abaissez la température pour atteindre la température de recuit appropriée, ce qui permet aux amorces et aux sondes oligonucléotidiques de se lier au modèle.

La proximité du quencher supprime la fluorescence du rapporteur. À la température d’extension, l’ADN polymérase étend les amorces et clive la sonde oligonucléotidique. Le reporter non lié émet une fluorescence.

Faites passer les gouttelettes à travers un lecteur de gouttelettes - un système de détection de fluorescence. La détection d’une fluorescence simple ou double indique des gouttelettes positives contenant des cibles, tandis que l’absence de signal indique des gouttelettes négatives.

Le rapport entre les gouttelettes positives et le nombre total de partitions détermine la concentration initiale des séquences cibles.

Pour commencer cette procédure, il faut d’abord préparer des concentrations de stock de 100 micromoles par litre pour toutes les amorces dans de l’eau de qualité moléculaire et les sondes dans un tampon TE pH 8, comme décrit dans le texte du protocole. Ensuite, préparez un mélange maître en mélangeant des quantités appropriées de mélange PCR numérique, des amorces directes et inverses, la sonde fluorescente et de l’eau sans nucléases. Pipetez de haut en bas au moins 10 fois pour mélanger, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la solution.

Étant donné que le master mix dPCR est plus visqueux que le master mix qPCR conventionnel, il est nécessaire d’utiliser la technique de mélange par pipetage afin de créer une solution homogène. Cela permet une quantification précise de la dPCR en aval.

Pour réaliser le mélange de test pour la génération de gouttelettes pour l’analyse d’échantillons en double, pipetez 36 microlitres du mélange maître dans une plaque PCR régulière. À chacun des mélanges maîtres de 36 microlitres, mélangez 12 microlitres de matrice d’ADN, en laissant les puits de réplication correspondants vides sur la plaque. Incluez des contrôles positifs pour vous assurer que le test fonctionne correctement. N’incluez aucun contrôle de modèle ou NTC pour vous assurer qu’il n’y a pas de contamination à l’intérieur de la plaque et pour définir la référence fluorescente plus tard pour l’analyse des données.

Avant de configurer le générateur de gouttelettes, mélangez les mélanges de dosage à l’aide d’une pipette multicanaux pour pipeter les mélanges de haut en bas environ 15 fois. Assurez-vous que la pointe de la pipette reste dans le liquide pour éviter de faire des bulles excessives dans le mélange.

Ensuite, insérez la cartouche un, contenant huit puits, dans un porte-cartouche blanc et cliquez sur le porte-cartouche. La première cartouche est maintenant fermement en place et ne peut pas être délogée du support lors de la génération de gouttelettes.

À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez doucement 20 microlitres du mélange de dosage dans la position médiane de la cartouche marquée « Échantillon » sans introduire de bulles d’air. Pipette de 70 microlitres d’huile de génération de gouttelettes sur le côté gauche de la cartouche marquée « Huile ».

Couvrez la cartouche avec un joint, en vous assurant que le joint est plat et maintenu uniformément par les quatre tics vers le bord de la cartouche. Appuyez sur le bouton vert du générateur de gouttelettes pour ouvrir la porte et placer la cartouche. Appuyez à nouveau sur le bouton pour fermer le générateur. Une fois la porte fermée, le bouton vert est atténué et la porte ne peut pas être rouverte.

La génération de gouttelettes commencera immédiatement et se poursuivra pendant environ 1 minute.

Pendant que la génération des gouttelettes est en cours, placez la deuxième cartouche dans un deuxième porte-cartouche blanc et préparez-la de la même manière que pour la première cartouche. Une fois la génération des gouttelettes terminée, le bouton faiblement éclairé devient vert.

Ouvrez la porte du générateur de gouttelettes. Retirez le porte-cartouche blanc contenant la cartouche un et mettez-le de côté. Placez la cartouche deux dans le générateur de gouttelettes.

Retirez le joint de la cartouche un et jetez-le. Ne décliquez pas le support de cartouche blanc, car l’action pourrait casser les gouttelettes nouvellement générées.

À l’aide d’une pipette multicanaux réglée à 40 microlitres, insérez les pointes dans la troisième colonne de la cartouche marquée de gouttelettes à un angle de 45 degrés, et pipetez lentement toutes les gouttelettes. Transférez-les sur la plaque PCR finale en plaçant la pointe de la pipette contre la paroi du puits à peu près à mi-chemin et en expulsant lentement la gouttelette.

De la même manière, lorsque la génération de gouttelettes pour la cartouche deux est terminée, retirez le joint de la cartouche deux et transférez les gouttelettes générées sur la plaque PCR finale. Placez un couvercle en aluminium perçable sur le dessus de l’assiette et placez-le sur une scelleuse d’assiettes. Réglez le scellant à 180 degrés Celsius. Appuyez sur « Play » sur la scelleuse et scellez pendant 10 secondes.

Pour commencer cette procédure, placez la plaque PCR finale scellée dans le thermocycleur. Utilisez un thermocycleur compatible avec la plaque PCR finale et avec une vitesse de montée en température de 2 degrés Celsius par seconde.

Exécutez le programme thermique suivant : 10 minutes à 95 degrés Celsius suivis de 40 cycles de 30 secondes à 94 degrés Celsius et 60 secondes à 60 degrés Celsius suivis d’un maintien de 10 minutes à 98 degrés Celsius. Une fois le cycle terminé, transférez la plaque sur un lecteur de gouttelettes pour la mesure automatique de la fluorescence dans chaque gouttelette dans chaque puits.

Assurez-vous que les gouttelettes sont à température ambiante avant de procéder à la lecture des gouttelettes. Commencez par ouvrir le logiciel d’accompagnement pour configurer la lecture des gouttelettes. Dans le menu « Configuration » par défaut contenant un schéma d’une plaque vide de 96 puits, double-cliquez sur le puits A1 pour ouvrir le menu contenant trois sections -- « Échantillon », « Essai 1 » et « Essai 2 ».

Dans la section de l’échantillon, tapez l’ID de l’échantillon dans la case intitulée « Nom » et cochez la case à droite intitulée « Appliquer ». Ensuite, cliquez sur le menu déroulant intitulé « Expérimenter ». Choisissez « ROUGE » pour la détection d’événements rares et cliquez sur « Entrer ».

Passez à la section désignée par « A1 ». Dans la section « Nom », remplissez le test et cliquez sur « Entrer ». Dans la case ci-dessous intitulée « Type », cliquez sur le menu déroulant, choisissez « Canal 1 inconnu » et cliquez sur « Entrer ».

Passez à la section désignée « A2 ». Dans la section « Nom », remplissez le test et cliquez sur « Entrer ». Dans la case ci-dessous intitulée « Type », cliquez sur le menu déroulant, choisissez « Canal 2 inconnu » et cliquez sur « Entrée ».

Toutes les informations des étapes précédentes sont maintenant présentes dans le puits A1.

Nommez tous les puits subséquents contenant des gouttelettes. Pour gagner du temps de configuration, cliquez sur « Maj » ou « Contrôle » pour choisir plusieurs puits simultanément. Lorsque la représentation numérique de la plaque reflète celle de la plaque physique, appuyez sur « OK » en bas à droite du menu. Dans le nouveau menu qui apparaît en haut du schéma de plaque, sous la section « Modèle », choisissez « Enregistrer sous » et nommez et enregistrez la plaque.

À gauche de l’écran, cliquez sur « Exécuter » et sélectionnez le jeu de teintures approprié dans la fenêtre contextuelle « Options d’exécution ». La collecte des données sera lancée et affichée en temps réel dans le logiciel.