PCR numérique duplex pour la quantification simultanée de marqueurs génétiques doubles
Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 8:45 min • July 8th, 2025
La réaction en chaîne par polymérase numérique duplex (ddPCR) permet la détection quantitative simultanée de deux marqueurs génétiques distincts.
Pour commencer, prenez un échantillon contenant deux séquences cibles différentes. Ajoutez un mélange contenant une enzyme ADN polymérase thermostable, des dNTP et des amorces spécifiques à la cible. Ensuite, ajoutez deux sondes oligonucléotidiques spécifiques à la cible, marquées avec des rapporteurs fluorescents et une molécule d’extinction pour détecter les cibles amplifiées.
La solution est émulsionnée avec de l’huile pour répartir les séquences cibles en de nombreuses nanogouttelettes. Chaque gouttelette contenant la cible agit comme un récipient de réaction individuel.
Démarrez le processus de cyclage thermique pour la réaction d’amplification à l’intérieur des nanogouttelettes individuelles.
À une température de dénaturation élevée, les cibles à double brin se séparent en brins simples.
Abaissez la température pour atteindre la température de recuit appropriée, ce qui permet aux amorces et aux sondes oligonucléotidiques de se lier au modèle.
La proximité du quencher supprime la fluorescence du rapporteur. À la température d’extensi
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