PCR bloquante de type sauvage pour détecter les mutations somatiques à basse fréquence

La réaction en chaîne par polymérase bloquante de type sauvage, ou WTB-PCR, détecte les mutations ponctuelles en amplifiant sélectivement les allèles mutants de faible abondance tout en inhibant l’amplification des allèles de type sauvage de haute abondance dans les échantillons d’ADN.

La WTB-PCR utilise des acides nucléiques verrouillés, ou des oligonucléotides modifiés monocaténaires contenant des LNA complémentaires au brin d’ADN de type sauvage de l’échantillon qui se lie spécifiquement au brin complémentaire. La liaison LNA bloque l’activité de l’ADN polymérase et inhibe l’élongation de l’ADN matrice de type sauvage.

Pour effectuer une WTB-PCR, prenez un mélange maître contenant des dNTP, des LNA et des amorces directes et inverses spécifiques à la cible dans de l’eau distillée sans nucléase.

Ajoutez une solution thermostable contenant de l’ADN polymérase dans le tube et pipetez le mélange dans le puits d’une plaque de PCR. Ajoutez l’échantillon d’ADN génomique contenant de l’ADN de type sauvage et mutant dans le puits et commencez la PCR.

Au cours de la PCR, la dénaturation médiée par haute température sépare les ADN double brin. Les brins séparés servent de modèles pour les amorces à recuit, tandis que le LNA se lie à son brin d’ADN complémentaire de type sauvage et forme l’hybride d’ADN bloquant-de type sauvage. À une température plus élevée, l’ADN polymérase ajoute des dNTP et étend les matrices d’ADN-amorce.

Une température de fusion plus élevée de l’hybride LNA-ADN que du complexe ADN-ADN le maintient intact. La modification de LNA finit par bloquer l’ADN polymérase d’étendre l’hybride LNA-ADN, ce qui inhibe son élongation.

Sur plusieurs cycles de PCR, le blocage médié par LNA augmente le nombre d’amplicons de type mutant par rapport à sa variante de type sauvage dans l’échantillon, ce qui facilite leur détection sélective.

Les amorces avant et arrière ont été conçues avec une séquence 5'-M13 pour permettre le recuit des amorces de séquençage complémentaires. Concevoir l’oligonucléotide bloquant de manière à ce qu’il ait une longueur d’environ 10 à 15 bases et qu’il soit complémentaire à la matrice de type sauvage où l’enrichissement en mutant est souhaité.

Un oligo plus court améliorera la discrimination des inadéquations. Pour obtenir une spécificité cible élevée, il est important de ne pas utiliser trop de nucléotides bloquants, car cela entraînerait un oligonucléotide très « collant ».

Pour concevoir l’oligonucléotide bloquant, commencez par naviguer sur le site Web d’Oligo Tools. Sélectionnez l’outil « Prédiction Oligo T_M ». Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Collez la séquence du modèle de type wild à bloquer dans la case « Oligo Sequence ». Ajoutez un signe plus devant les bases des bloqueurs pour les marquer. Cliquez sur le bouton « Calculer » pour déterminer le T_M approximatif de l’hybride bloqueur d’ADN. Les températures de fonte calculées apparaîtront dans les cases ci-dessous.

Concevez l’oligo bloquant pour qu’il ait une température de fusion de 10 à 15 degrés Celsius au-dessus de la température d’extension pendant le thermocyclage. Ici, la température d’extension est de 72 degrés Celsius. Pour régler la température de fusion, ajoutez, retirez ou remplacez les bases de blocage. Évitez les longues périodes de trois à quatre bases C ou G bloquantes.

Ensuite, pour éviter la formation d’une structure secondaire ou l’auto-dimérisation, retournez à l’écran d’accueil du site Web d’Oligo Tools et sélectionnez l’outil « Oligo Optimizer ». Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Collez la séquence du modèle de type wild à bloquer dans la boîte. Ajoutez un signe plus pour indiquer les bases bloquantes. Sélectionnez les deux cases « Structure secondaire » et « Auto-seulement » et appuyez sur le bouton « Analyser » pour voir les scores pour l’hybridation et la structure secondaire.

Ces scores représentent des estimations très approximatives des températures de fusion des autodimères et des structures secondaires, respectivement. Des scores plus bas sont optimaux et peuvent être obtenus en limitant l’appariement bloqueur-bloqueur. Retirez ou repositionnez les nucléotides bloquants afin d’obtenir des scores plus bas. L’oligonucléotide bloquant optimisé pour MyD88, montré ici, établit un équilibre entre la température de fusion de l’hybride bloqueur d’ADN et des scores d’hybridation et de structure secondaire suffisamment faibles.

Il a été conçu pour couvrir les acides aminés Q262 à I266 et présente un dT inversé 3' pour inhiber à la fois l’extension par l’ADN polymérase et la dégradation par la 3'-exonucléase. Une fois les amorces conçues, mettez en place la PCR bloquante de type sauvage et effectuez un thermocyclage, comme décrit dans le document d’accompagnement.