Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations

L'objectif général de cette procédure est de détecter des mutations somatiques de faible fréquence dans divers types d'échantillons. Cette méthodologie peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du dépistage des mutations somatiques en facilitant la détection de mutations de très faible fréquence. Ici, nous rechercherons des mutations dans le gène myd88 dans des échantillons de moelle osseuse.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit des informations hautement précises et sensibles sur la présence de mutations somatiques, même avec très peu de cellules néoplasiques. Ce test de séquençage basé sur une PCR avec blocage du type sauvage a été mis au point pour amplifier une partie de l'exon cinq du gène myd88, assurant ainsi la couverture du site chaud L265. Les amorces directe et inverse ont été conçues avec une séquence M13 en extrémité 5' afin de permettre l'utilisation d'amorces de séquençage complémentaires.

Concevez l'oligonucléotide bloquant de manière à ce qu'il mesure environ 10 à 15 bases de longueur et soit complémentaire au brin sauvage là où un enrichissement du mutant est souhaité. Un oligonucléotide plus court améliorera la discrimination des appariements incorrects. Pour obtenir une grande spécificité du cible, il est important de ne pas utiliser une trop grande quantité de nucléotides bloquants, car cela entraînerait des oligonucléotides très adhésifs.

Pour concevoir l'oligonucléotide bloquant, commencez par accéder au site Web Oligo Tools. Sélectionnez l'outil de prédiction du TM des oligonucléotides. Une nouvelle fenêtre s'ouvrira.

Collez la séquence du modèle de type sauvage à bloquer dans la case de séquence d'oligo. Ajoutez un signe plus devant les bases du bloqueur pour les marquer. Cliquez sur le bouton de calcul pour déterminer la température de fusion (TM) approximative de l'hybride d'ADN bloqueur.

Les températures de fusion calculées apparaîtront dans les cases ci-dessous. Concevez l'oligo bloqueur de manière à ce que sa température de fusion soit supérieure de 10 à 15 degrés Celsius par rapport à la température d'extension pendant la thermocyclation. Ici, la température d'extension est de 72 degrés Celsius.

Pour ajuster la température de fusion, ajoutez, retirez ou remplacez des bases bloquantes. Évitez les séquences longues de trois à quatre bases bloquantes C ou G. Ensuite, pour éviter la formation de structures secondaires ou la dimérisation par auto-appariement, revenez à l'écran d'accueil du site Web Oligo Tools et sélectionnez l'outil Oligo Optimizer.

Une nouvelle fenêtre s'ouvrira. Collez la séquence du modèle de type sauvage à bloquer dans la case. Ajoutez un signe plus pour indiquer les bases à bloquer.

Sélectionnez les deux cases pour la structure secondaire et « self » uniquement, puis appuyez sur le bouton analyser pour afficher les scores d'hybridation et de structure secondaire. Ces scores représentent des estimations très approximatives des températures de fusion des dimères « self » et des structures secondaires, respectivement. Des scores plus faibles sont optimaux et peuvent être obtenus en limitant l'appariement des bloqueurs.

Supprimez ou repositionnez les nucléotides bloquants afin d'obtenir des scores plus faibles. L'oligonucléotide bloquant optimisé pour myd88 illustré ici établit un compromis entre la température de fusion de l'hybride de blocage d'ADN et des scores d'hybridation et de structure secondaire suffisamment bas. Il a été conçu pour couvrir les acides aminés Q262 à I266, et comporte un DT inversé en trois prime pour inhiber à la fois l'élongation par l'ADN polymérase et la dégradation par l'exonucléase trois prime.

Une fois les amorces conçues, préparez la PCR de blocage du type sauvage et effectuez le thermocyclage comme décrit dans le document accompagnant. Retirez les billes magnétiques du stockage à quatre degrés Celsius et laissez-les atteindre la température ambiante. Transférez 10 microlitres du produit de PCR dans une nouvelle plaque PCR.

Vortexez vigoureusement les billes magnétiques pour redisperser complètement les particules magnétiques, puis ajoutez 18 microlitres de billes magnétiques dans chaque puits de la nouvelle plaque. Pipetez vers le haut et vers le bas 10 fois pour homogénéiser. Incubez ensuite la plaque à température ambiante pendant cinq minutes.

Après l'incubation, placez la plaque PCR sur la plaque magnétique à rebord latéral pendant deux minutes afin de séparer les billes de la solution. Utilisez une pipette multipuits pour aspirer le surnageant. Veillez à éviter le culot de billes.

Ensuite, distribuez 150 microlitres d'éthanol à 70 % dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant au moins 30 secondes. Puis aspirez l'éthanol à l'aide d'une pipette multicanal et jetez les pointes. Répétez cette étape de lavage une fois supplémentaire.

À l’aide d’une pipette multipuits de 20 microlitres, aspirez l’éthanol restant de chaque puits et jetez les pointes. Après avoir laissé sécher les puits de la plaque pendant environ 10 minutes, retirez-la de l’aimant et ajoutez 40 microlitres d’eau sans nucléase dans chaque puits. Pipetez 15 fois de haut en bas pour homogénéiser.

Incuber ensuite à température ambiante pendant deux minutes. Après l'incubation, replacer la plaque PCR sur la plaque aimantée pendant une minute afin de séparer les billes de la solution. Transférer 35 microlitres du produit purifié dans une nouvelle plaque PCR et effectuer le séquençage bidirectionnel comme décrit dans le document accompagnant.

Une fois le séquençage bidirectionnel effectué, purifiez les produits de séquençage en préparant une solution fraîche dans 25 % d'acétate de sodium trois molaire à pH 5,2 et d'éthanol à 100 %. Préparez également une solution fraîche d'éthanol à 70 %. Ajoutez à chaque puits des plaques de séquençage direct et inverse 30 microlitres d'acétate de sodium dans de l'éthanol à 100 %, puis pipetez cinq fois vers le haut et vers le bas pour homogénéiser.

Ensuite, refermez la plaque et incubez-la à l'obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. Une fois les 20 minutes écoulées, centrifugez la plaque à 2 250 × g pendant 15 minutes. Après la centrifugation, retirez le scellant de la plaque et retournez-la une fois au-dessus d'un récipient de déchets.

Si la plaque est retournée plusieurs fois, les culots peuvent se détacher des fonds des puits. Placer la plaque retournée sur une serviette en papier propre et centrifuger à 150 ×g pendant une minute. Ensuite, ajouter 150 µL d'éthanol à 70 % dans chaque puit et refermer hermétiquement la plaque.

Faire centrifuger à 2 250 ×g pendant cinq minutes. Répéter ensuite le processus de retrait du scellant de plaque et de retournement de la plaque. Si les puits ne sont pas complètement secs, les laisser sécher à l'air à température ambiante.

Veillez à ce que les échantillons soient protégés de la lumière. Une fois que les puits sont complètement secs, ajoutez 10 microlitres de formamide dans chaque puits et pipetez de haut en bas 10 fois pour mélanger. Refermez hermétiquement la plaque.

Dénaturez à l’aide d’un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant trois minutes, puis à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après la dénaturation, remplacez le scellant de plaque par un septum et effectuez le séquençage sur une plateforme de séquençage selon les instructions du fabricant. À l’aide d’un logiciel d’analyse de séquence, visualisez les tracés et alignez les séquences sur les séquences de référence appropriées.

Alignez myd88 avec la séquence de référence NCBI NM002468. L'ADN génomique de patients porteurs ou non de mutations a subi une PCR conventionnelle et une PCR de blocage de type sauvage, puis les produits de PCR obtenus ont été séquencés. Comme on peut le voir ici, l'allèle muté a été enrichi lors de la PCR de blocage du type sauvage, et aucun faux positif n'a été observé sur l'ADN de type sauvage.

Une diminution caractéristique de l'intensité du signal, comme celle illustrée ici, est souvent observée lorsque l'on utilise une concentration trop élevée de bloqueur, ou lorsque la purification post-PCR n'a pas permis d'éliminer le bloqueur avant le séquençage bidirectionnel. Ceci se produit lorsque la purification enzymatique est effectuée à la place de la purification par billes magnétiques. Tout test basé sur la PCR qui enrichit les allèles mutants détectera des artefacts de faible fréquence.

Ces traces montrent une augmentation des artefacts de séquençage CG par rapport aux artefacts TA dans les tissus FFPE lorsque la cytosine ou la cytosine méthylée sont désaminées par fixation formale en uracile ou en thymine, respectivement. L'uracile ADN glycosylase, ou UDG, peut exciser l'uracile avant la PCR d'achèvement avec enzyme sauvage, contribuant ainsi à réduire les artefacts de séquençage. Toutefois, la thymine résultant de la désamination de la 5-méthylcytosine, qui se produit fréquemment au niveau des îlots CPG, ne peut pas être excisée par l'UDG.

La réduction de la concentration du bloqueur utilisée dans la PCR de blocage du type sauvage peut aider à diminuer l'apparition d'artéfacts de séquençage qui ne sont pas corrigés par le traitement UDG. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de détecter des mutations somatiques avec un haut degré de précision et de sensibilité, en utilisant la technique de blocage du type sauvage. Le principe de cette technologie peut être appliqué à la détection de mutations dans de petites sous-populations cellulaires.

Il est donc utile pour la détection de la maladie résiduelle minimale, la surveillance des patients et la prédiction d'une rechute précoce chez les patients atteints de divers néoplasmes.