Name: Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Apprenez la PCR de blocage du type sauvage combinée au séquençage direct pour détecter les mutations somatiques à basse fréquence dans le gène myd88. Cette méthode offre une sensibilité élevée pour l'analyse des échantillons de moelle osseuse.

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Déclaration éthique: Tous les tests des échantillons humains a été réalisée après obtention de l&#39;approbation Institutional Review Board (IRB). 1. Extraction de l&#39;ADN à partir de tissu FFPE, du sang périphérique et de moelle osseuse Aspirer <ol><li> Pour la moelle osseuse du tissu FFPE avec le kit d&#39;extraction d&#39;ADN FFPE <ol><li> Commencer avec le tissu FFPE de lames non colorées (5 - 10 parties à 5 - épaisseur de 10 um). REMARQUE: si début de copeaux de tissu, utiliser 3 - 6 sections à 5 - épaisseur de 10 pm et passer à l&#39;étape 1.1.6. </li><li> Placez les diapositives dans un panier de diapositives et de préparer quatre réservoirs de lavage (deux pour Xylène et deux pour 100% d&#39;alcool). Ajouter un volume minimum de 600 ml de solution à chaque panier. </li><li> Déparaffiner les diapositives en faisant un lavage de xylène 5 min dans le premier plateau. Placer les lames dans le second réservoir de lavage de xylène pendant 5 minutes supplémentaires. </li><li> Après déparaffinage, laver les lames avec 100% d&#39;alcool pendant 5 min. Transférer les lames au deuxièmeréservoir de lavage à l&#39;alcool pendant 5 minutes supplémentaires. </li><li> Laisser les lames sécher complètement sous une hotte avant de les gratter avec une lame de rasoir dans un tube à centrifuger. NOTE: Si une diapositive H &amp; E avec la région de la tumeur indiquée est disponible, aligner les diapositives et gratter seulement la région de la tumeur. </li><li> Procéder aux instructions du document du fabricant inclus dans le kit. </li></ol></li><li> Pour BM aspirez et le sang périphérique <ol><li> Extrait selon les instructions du fabricant du document avec ces spécifications. NOTE: Il existe de nombreux kits disponibles dans le commerce et les méthodes d&#39;extraction d&#39;ADN à partir de tissus FFPE et les cellules. Pratiquement, tous peuvent être utilisés. Utilisez une méthode qui est établie dans le laboratoire. <ol><li> Utiliser 200 ul de sang périphérique (PB) ou de 100 uL BM + 100 ul de PBS. </li><li> Utilisez 4 pi RNase une solution mère. </li><li> Eluer avec du tampon d&#39;élution de 100 ul. </li></ol></li></ol></li><li> ADN Quantification<ol><li> Mesurer les concentrations d&#39;ADN à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre assurant un rapport 260 nm / 280 nm d&#39;environ 1,8 (pour l&#39;ADN pur). Si le rapport est sensiblement plus faible, cela peut indiquer la présence de la protéine, du phénol, ou d&#39;autres contaminants qui peuvent interférer avec les applications en aval. </li><li> Ajuster la concentration d&#39;ADN à environ 50 - 100 ng / ul avec un tampon d&#39;élution approprié. </li></ol></li></ol> 2. Blocage PCR de type sauvage <ol><li> Conception primaire <ol><li> Conception et obtenir des amorces pour les gènes d&#39;intérêt selon l&#39; une décrit précédemment orientations générales de conception d&#39;amorces de PCR 13. Inclure M13-avant et arrière des amorces de séquençage universelles dans les amorces de PCR. NOTE: L&#39;essai MyD88 a été développé pour amplifier l&#39;exon 5 de MYD88 (G259 - N291) et 110 nucleotides situés dans la région 5&#39; intronique pour couvrir le site d&#39;épissage et une partie de l&#39;intron 4. Les amorces directes et inverses ont été conçues avec un 5&#39; -M13 séquence (M13-forward: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-inverse: cag gaa aca gct atg acc) pour permettre une hybridation des amorces de séquençage complémentaire (voir Matériaux tableau). </li></ol></li><li> Verrouillé Nucleic Acid Oligonucleotide Conception <ol><li> Conception de l&#39;oligonucléotide de blocage à être d&#39;environ 10 - 15 bases de long et complémentaires de la matrice WT où l&#39;on souhaite enrichissement mutant. NOTE: Une plus courte oligo- améliorer la discrimination mismatch. Pour obtenir une grande spécificité de la cible, il est important de ne pas utiliser trop de nucléotides de blocage car cela peut entraîner un oligonucléotide très « collante ». Le contenu et la longueur et nucléotides blocage doivent être optimiser selon le nucléotide spécifique qui doit être bloqué. Il est important d&#39;obtenir une spécificité de liaison élevée sans compromettre la structure secondaire et de risquer une auto-complémentarité. </li><li> Concevoir le blocage d&#39;avoir un oligo T m 10 - 15 ° C au-dessus de l&#39;extension température pendant thermocyclage. Ajuster le T m en ajoutant ou supprimant des bases de blocage ou par substitution des bases de blocage pour l&#39; ADN tout en évitant les longues (3 - 4 bases) de blocage de bases G ou C. <ol><li> Accédez au site Web Oligo outils (voir le tableau des matériaux) et sélectionnez l&#39;outil « blocage Oligo Tm prédiction ». </li><li> Coller la séquence de la matrice WT qui est désiré pour être bloqué dans la case « Oligo Sequence ». Ajouter « + » devant des bases pour indiquer les bases de blocage. </li><li> Sélectionnez le bouton « Calculer » pour déterminer le T m environ de l&#39;hybride ADN-bloqueur. </li></ol></li><li> Concevoir le blocage pour éviter oligo- formation de structure secondaire ou auto-dimères. <ol><li> Accédez au site Web Oligo outils (voir le tableau des matériaux) et sélectionnez l&#39;outil « blocage Oligo Optimizer ». </li><li> Coller la séquence de la matrice WT qui est désiré pour être bloqué dans le boîtier. Ajouter « + » en face des bases pour indiquer le blocage des bases. </li><li> Sélectionnez les deux cases pour « Structure secondaire » et « Self Only ». Appuyez sur le bouton Analyser pour examiner les structures secondaires pour oligo- potentiellement gênants ou auto-dimères. NOTE: Les scores représentent des estimations très approximatives de l » T m des structures secondaires et auto-dimères. Des scores plus faibles sont donc optimales et peuvent être obtenus en limitant l&#39;appariement bloqueur-bloquant. L&#39;oligonucléotide de blocage pour MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] a été conçu pour couvrir Q262-I266 acides aminés et possède une extrémité 3 &#39;inversée dT pour inhiber à la fois l&#39;extension par polymerase d&#39;ADN et de la dégradation par une exonucléase 3 &#39;. Cet oligo blocage spécifique est un 17mère avec 10 bases de blocage qui sont désignés par « + N ». Les 7 bases restantes sont des nucléotides d&#39;ADN ordinaires. </li></ol></li></ol></li><li> Configuration WTB-PCR et Thermocyclage <ol><li> Préparer un maître WTB-PCR mix (MMX) en utilisant 2,5 ul de tampon de réaction de PCR 10x w / 20 mM de MgCl2, 250 uM de dNTP, vers l&#39; avant de 0,2 uM et l&#39; amorce inverse, 1,2 pM MYD88blocker et DNase, RNase-free, H ultra-pure 2 O pour créer une finale volume de solution de 21,75 ul par réaction. NOTE: Les concentrations de travail sont pour le volume final de réaction de 25 ul (après addition de matrice d&#39;ADN et polymérase). PCR conventionnelle MMX est préparée en omettant simplement l&#39;ajout de blocage. Toutes les étapes du protocole restent identiques pour les deux WTB et PCR classique. Ceci peut être utilisé dans la validation et l&#39;enrichissement détermination réalisée par addition de blocage. <ol><li> Lors du calcul de la quantité de MMX pour préparer faire en sorte de rendre compte de 3 réactions supplémentaires (contrôles positifs et négatifs et un témoin non-modèle pour vérifier la contamination) et au moins une réaction supplémentaire de l&#39;erreur de pipetage. </li></ol></li><li> Vortex MMX à fond. Le MMX peut être stocké à -80 ° C jusqu&#39;à ayoreille. </li><li> Ajouter 0,25 ul Taq polymérase ADN par réaction au MMX et mélanger par inversion. Une fois que la polymérase a été ajouté à la MMX, le garder sur la glace. </li><li> Mettre une nouvelle plaque à 96 puits PCR sur une plaque froide et la pipette 22 ul de polymerase avec MMX à chaque puits réactionnel. </li><li> Ajouter 3 pl d&#39;ADN génomique (50 - 100 ng / ul de chacun des puits contenant le MMX avec la polymerase. </li><li> Sceller brièvement la plaque et centrifugeuse pour assurer que la solution atteigne le fond de chaque puits. </li><li> Charger la plaque PCR sur un thermocycleur. <ol><li> Définir les conditions de thermocyclage pour la réaction WTB-PCR comme suit: dénaturation initiale à 95 ° C pendant 6 min; 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 30 s, annelage d&#39;amorce à 56 ° C pendant 30 s et extension à 72 ° C pendant 1 min 20 s; extension finale à 72 ° C pendant 10 min. NOTE: Les meilleures pratiques consiste à remplir le reste du protocole dans une zone physiquement séparée pour éviter toute contamination amplicon in configurations futures. </li></ol></li></ol></li><li> Effectuer une électrophorèse sur gel selon les protocoles décrits précédemment 14 afin de déterminer si WTB-PCR a réussi et pour confirmer l&#39;absence d&#39;amplification dans le contrôle non matrice. </li><li> La purification du produit PCR par des billes magnétiques <ol><li> Retirer les billes magnétiques de 4 ° C et porter à la température ambiante. </li><li> Transfert produit PCR 10 ul à une plaque PCR. </li><li> Vortex les billes magnétiques vigoureusement pour remettre en suspension les particules magnétiques complètement. </li><li> Ajouter 18 pi de billes magnétiques à chaque puits sur la nouvelle plaque. Pipette mélanger 10 fois. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Placer la plaque PCR sur la plaque d&#39;aimant côté-jupe pendant 2 min à des billes séparées de la solution. </li><li> Aspirer le surnageant avec une pipette multicanaux, en évitant le culot de billes. </li><li> Distribuer 150 pl d&#39;éthanol à 70% dans chaque puits et incuber à température ambiante for au moins 30 s. Aspirer l&#39;éthanol avec une pipette à canaux multiples et jeter des conseils. Répétez cette procédure de lavage une fois de plus. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une pipette à canaux multiples de 20 ul Aspirer l&#39;éthanol restant de chaque puits et jeter des conseils. </li><li> Une fois que les puits sont secs (~ 10 min), retirer de la plaque magnétique et ajouter 40 ul d&#39;eau sans nuclease à chaque puits et le mélange pipette 15 fois ou légèrement vortex. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 2 min. </li><li> Placer la plaque PCR sur plaque magnétique pendant 1 min à des billes séparées de la solution. </li><li> Transfert de 35 pi de produit purifié à une nouvelle plaque PCR. Ce produit est purifié par PCR est maintenant prêt à procéder à un séquençage bidirectionnel ou peut être conservé à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. REMARQUE: Lors de l&#39;élaboration d&#39;un nouveau test, la quantification du produit de PCR purifié peut être nécessaire. 1-3 ADN ng / uL amplicon est optimale pour le séquençage bidirectionnel. Si la concentration est toujours faible, augmenter les perles de produits et magnétiques PCR proportionnellement (1: 1,8). Si la concentration est élevée et constante, éluer avec un plus grand volume d&#39;eau. </li></ol></li></ol> 3. Le séquençage du produit WTB-PCR <ol><li> Le séquençage bidirectionnel NOTE: Le protocole suivant est une forme modifiée des instructions du fabricant qui a été optimisé pour utiliser moins réactifs. <ol><li> Préparer avant et arrière réaction de séquençage se mélange avec 0,25 ul Prêt mélange de réaction, 1,88 ul de séquençage tampon, 1,78 uM M13-F ou des amorces de séquençage M13-R et ajouter et DNase, RNase-free, H ultra-pure 2 O pour créer une solution finale volume de 9 pi par réaction. Ce mélange de réaction de séquençage peut être conservé à -20 ° C pendant jusqu&#39;à un an. </li><li> Pipette 9 ul du mélange de réaction de séquençage de l&#39;avant dans chaque puits d&#39;une nouvelle plaque à 96 puits PCR pour la réaction de séquençage de l&#39;avant. Répéter l&#39;opération sur une plaque séparée pour la réaction de séquençage inverse. </li><li> Ajouter 1 pl du t produit purifié WTB-PCRo chaque puits sur les deux plaques avant et arrière. </li><li> Sceller brièvement la plaque et centrifugeuse pour assurer que la solution atteigne le fond de chaque puits. </li><li> Charger la plaque PCR sur un thermocycleur. <ol><li> Définir les conditions de thermocyclage pour la réaction de séquençage de la manière suivante: 96 ° C pendant 1 min; 30 cycles de 96 ° C pendant 10 s, 50 ° C pendant 5 s, 60 ° C pendant 4 min; maintenir à 4 ° C jusqu&#39;au moment de la purification. </li></ol></li></ol></li><li> Purifier les produits de séquençage <ol><li> Préparer une solution fraîche de 01:25 3 M d&#39;acétate de sodium (pH 5,2) et 100% d&#39;éthanol. </li><li> Préparer une solution d&#39;éthanol à 70% frais. </li><li> Ajouter 30 ul d&#39;acétate de sodium / 100% d&#39;une solution d&#39;éthanol à chaque puits des deux l&#39;avant et arrière des plaques de séquençage et un mélange de pipette 5 fois. </li><li> Refermer la plaque et incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Centrifuger la plaque à 2250 xg pendant 15 min. </li><li> Retirez le scellant de plaque et inverser sur une perterécipient. REMARQUE: inverti une seule fois ou le culot peut détacher du fond de puits. </li><li> Placer la plaque inversée sur une serviette en papier propre et centrifuger à 150 g pendant 1 min. </li><li> Ajouter 150 pi 70% d&#39;éthanol à chaque puits. </li><li> Refermer la plaque et un essorage à 2250 xg pendant 5 min. </li><li> Répétez les étapes 3.2.6 et 3.2.7. </li><li> Si les puits ne sont pas complètement secs, les laisser sécher à l&#39;air à la température ambiante. Assurez-vous que les échantillons sont protégés de la lumière pendant le séchage. </li><li> Ajouter 10 ul formamide à chaque mélange de puits et pipette 10 fois. Refermer la plaque. </li><li> Dénaturer le thermocycleur à 95 ° C pendant 3 min, puis de 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Après dénaturation, remplacer l&#39;agent de scellement en forme de plaque avec un septum et la séquence sur la plate-forme de séquençage selon les instructions du fabricant 15. </li></ol></li></ol> 4. Analyse des résultats de séquençage <ol><li> Visualiser les traces de séquençage en utilisant une dat de séquençaged&#39; un logiciel d&#39;analyse selon les instructions du fabricant 16 et aligner les séquences de référence respectives. Aligner MYD88 à la séquence de référence NCBI « NM_002468 ». </li></ol>

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<li>Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+amplification%3A+a+method+for+high-fidelity+template-driven+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification.</a> BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).</li>
<li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+a+primer+at+a+mutation%3A+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li>
<li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/126/23/716">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le dosage WTB-PCR décrit ici utilise un ensemble générique d&#39;amorces avec un oligo blocage conçu pour bloquer l&#39; amplification de l&#39; ADN WT pendant l&#39; extension (Figure 1). Le produit WTB-PCR est ensuite séquencée pour l&#39;analyse mutationnelle. L&#39;utilité de WTB-PCR / Sanger réside dans sa simplicité, de haute sensibilité, et à haut débit. En utilisant les directives décrites ici, la plupart des tests basés sur Sanger existants peuvent être simplement modifiés par l&#39;ajout d&#39...

Le séquençage Sanger a toujours été l&#39;étalon-or dans les tests pour les mutations somatiques connues et inconnues. L&#39; une des limitations de séquençage de Sanger est sa limite de détection (~ 10 - allèle mutant de 20% dans un fond de WT) 1. Ce niveau de sensibilité est inapproprié pour la détection de mutations somatiques de bas niveau qui peuvent être présents dans des échantillons de tissus de patients prémalignes ou avec peu de cellules tumorales circulantes, ou lorsque la moelle osseuse (BM) est inégale. Cela rend également l&#39; évaluation de la maladie résiduelle après le traitement ou la détection des mutations de résistance émergents au cours du traitement par séquençage conventionnel seul difficile 2. En remplaçant la PCR classique avec un acide nucléique verrouillé (LNA) médiée par PCR de blocage de type sauvage (WTB-PCR) dans le séquençage de Sanger, les sensibilités allant jusqu&#39;à 0,1% allèle mutant dans un fond de WT peuvent être obtenus 2, 3, 4. DansWTB-PCR, l&#39;enrichissement pour les alleles mutants est réalisée par l&#39;addition d&#39;un court (~ 10 - 14 NT) de blocage (LNA) oligonucléotide qui se lie préférentiellement à l&#39;ADN WT empêchant ainsi l&#39;amplification de l&#39;ADN WT. Le mutant enrichi produit WTB-PCR peut être séquencée. En bloquant l&#39;ADN WT plutôt que de sélectionner des mutations spécifiques WTB-PCR permet l&#39;enrichissement des deux mutations connues et inconnues présentes dans les fractions cellulaires minute. Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées pour détecter des mutations dans les petites fractions de cellules. Ceci inclut le système de mutation allèle-spécifique PCR, réfractaire amplification (ARMS), la dénaturation Chromatographie en phase liquide à haute performance (DHPLC), des billes, des émulsions, l&#39;amplification et le magnétisme (ensouplage), la libération du champ induit électrique et de mesure (EFIRM), haute résolution point de fusion et d&#39;autres. Cependant, la plupart de ces méthodes sont limitées par des faux positifs et la capacité de détecter une seule mutation que le test a été conçu pour 4 </sup&gt;. WTB-PCR, cependant, permet à l&#39;utilisateur de visualiser les traces de séquençage qui permet la détection de plusieurs types de mutation et peuvent aider à écarter les faux positifs dus à des artefacts ou des événements de désamination. séquençage de nouvelle génération (NGS) peut offrir une alternative appropriée au séquençage classique, cependant, essentiellement des coûts plus élevés, la complexité et plus le temps d&#39;essai rendent une option inutile pour de nombreux types de maladies avec quelques marqueurs moléculaires distincts ou pour le suivi des patients sous traitement pour les nouveaux mutations de résistance. De plus, les taux élevés de faux positifs lors de la détection des variants avec des fréquences d&#39;allèle mutant de moins de 5% peuvent poser un problème pour NGS à base amplicons-5, 6. Ici , nous démontrons l&#39;augmentation de la sensibilité obtenue par WTB-PCR dans le dépistage des mutations dans le facteur de différenciation myéloïde 88 gène tel que décrit par Albitar et al. 3 MYD88 mutations sont importants facteurs diagnostiques et pronostiques dans la macroglobulinémie de Waldenström (WM), gammapathie monoclonal IgM de signification inconnue (IgM-MGUS), le lymphome splénique de la zone marginale (SMZL) et lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL). mutations MyD88 se trouvent dans presque tous les cas de WM et environ 50% des patients avec des immunoglobulines M (IgM) sécrétant GMSI. Par contraste, les mutations MyD88 se trouvent dans seulement 0-6% des patients atteints de SMZL et sont absents dans le myélome multiple 7, 8. Parce morphologiques qui se chevauchent, immunophénotypique, cytogénétique, et les caractéristiques cliniques entre WM et SMZL ou multiple IgM de myélome peuvent souvent compliquer le diagnostic différentiel, la présence d&#39;une mutation MyD88 peut servir de facteur d&#39; identification utile 9. Mutations MyD88 ont également été associés à une plus grande charge de morbidité chez les patients atteints DLBCL et une mauvaise survie globale après un traitement 7, </sup&gt; 10. De plus, parce que les mutations MyD88 sont plus fréquemment trouvés dans activé cellules B comme (ABC) DLBCL que centre germinatif B-alvéolaire (GCB) DLBCL ou de lymphome à cellules B médiastinale primaire (PMBL), le statut de mutation MYD88 peut servir marqueur de substitution pour le sous - type ABC 11, 12. Le protocole détaillé fourni ici sert de modèle à partir duquel de nouveaux tests peuvent être mis au point ou la plupart des tests de séquençage existants peuvent être facilement adaptés pour détecter avec précision les mutations à basse fréquence dans différents types d&#39;échantillons. L&#39;approche peut également être utilisé pour la surveillance et la détection de mutations résistantes qui peuvent se développer dans les tumeurs ou même les bactéries qui peuvent se développer alors que les patients sont traités avec la thérapie ciblée ou des antibiotiques. En outre, il traite et des remèdes beaucoup des problèmes liés à l&#39;enrichissement de mutation, en particulier dans les paraffine fixés au formol (FFPE) tissus.

<table><tbody><tr><td>1,5 ou 2 mL Tubes à centrifuger Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100 % alcool</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Qualité histologique ; 91,5 % Éthanol, 5 % Alcool isopropylique, 4,5 % Alcool méthylique</td></tr><tr><td>3730XL Séquenceur</td><td>ABI</td><td></td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Pour la purification PCR à billes magnétiques</td></tr><tr><td>Aluminium feuilles d’étanchéité</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>Pour PCR et stockage à froid</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Kit de séquençage de cycle</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>Pour le séquençage bidirectionnel. Avec 5x Centrifugeuse tampon de séquençage</td></tr><tr><td>Série 5804</td><td>Rotor Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP (pour plaque PCR)</td></tr><tr><td>Plaque froide pour plaques à 96 puits</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, sans RNAse, eau</td><td></td><td></td><td></td>ultra-pure</tr><tr><td>(100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Aimant à jupe latérale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>Pour une utilisation dans la purification PCR.</td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 proof, pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Site web Exiqon Oligo Tools</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA polymérase (5 U/&micro ; L)</td><td>Roche</td><td>12032937001</td><td>With10x tampon de réaction PCR concentré, avec 20 mM MgCl2</td></tr><tr>Gel Appareil <td></td><td></td><td>d’électrophorèse</td> 2<td> % d’agarose</td></tr><tr><td>GeneRead DNA FFPE</td><td>Qiagen</td> 180134 <td>Contient de l’uracile ADN glycosylase nécessaire pour réduire les artefacts de séquençage</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>Pour le séquençage.</td></tr><tr><td>LNA oligonucléotide</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+T+CC/invdT/ (+N = bases LNA)</td></tr><tr><td>M13-F Séquençage Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R Sequencing Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycleur</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse Modèle 5430</td><td>Rotor Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 (pour tubes de microcentrifugation de 1,5/2 mL)</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>amorce directe IDT</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR amorce inverse</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR plaques</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1 000 & micro ; </td></tr><tr><td>Septa à plaque L, 96 puits</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>Pour l’aspiration BM et le sang périphérique</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>Pour l’analyse de séquençage</td></tr><tr><td>Panier</td><td></td><td></td><td></td>à lames</tr><tr><td>Acétate de sodium (3 M, pH 5,2)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr>Pointes <td></td><td></td><td>de pipette filtrées stériles</td><td>20, 200, 1 000 & micro ; L</td></tr><tr><td>Thermomélangeur C&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir</td><td></td><td></td> de lavage <td>~ 1 000 mL</td></tr><tr><td>Xylène</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>Qualité histologique</td></tr></tbody></table>

sauvage blocking pcr combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence somatic mutations

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

la détection et l&#39;identification précise des mutations à basse fréquence peut être problématique lors de l&#39;évaluation de maladie résiduelle après le traitement, le dépistage des nouvelles mutations de résistance au cours du traitement, ou lorsque les patients ont peu de cellules tumorales circulantes. PCR blocage de type sauvage suivi par une analyse de séquençage offre une sensibilité élevée, la flexibilité et la simplicité comme une méthodologie permettant de détecter ces mutations à basse fréquence. En ajoutant un oligonucleotide conçu sur mesure d&#39;acide nucléique verrouillé dans une nouvelle ou déjà établie essai de séquençage à base de PCR classique, des sensibilités de l&#39;ordre de 1 allele mutant dans un fond de 1000 WT alleles peuvent être atteints (1: 1000). artefacts de séquençage associés à des événements de désamination généralement trouvés dans des tissus inclus dans la paraffine fixés au formol peut être remédié en partie par l&#39;utilisation de l&#39;uracile glycosylase d&#39;ADN au cours des étapes d&#39;extraction. Le protocole optimisé de détection est spécifique ici pour la mutation MyD88, mais peut servir de modèle pour concevoir toutedosage WTB-PCR. Avantages du test WTB-PCR sur les autres essais couramment utilisés pour la détection de mutations à basse fréquence incluant allèle spécifique PCR et PCR en temps réel quantitative comprennent moins les occurrences de faux positifs, une plus grande souplesse et la facilité de mise en œuvre, et la capacité de détecter à la fois connue et des mutations inconnues.

Une vue d&#39; ensemble conceptuelle de WTB-PCR lors de l&#39; extension est présentée sur la figure 1. Étant donné qu&#39;un seul mésappariement de nucleotide dans l&#39;hybride ADN-bloqueur diminue considérablement sa température de fusion (AT m = 20 - 30 ° C), l&#39; amplification de l&#39;allèle WT est bloqué tandis que l&#39; ADN matrice mutant est libre de compléter l&#39; extension 17. De cette manière, l&#39;ADN mutant est ampli...

La PCR bloquante de type sauvage suivie d’un séquençage direct offre une méthode très sensible de détection des mutations somatiques à basse fréquence dans une variété de types d’échantillons.

Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter des mutations somatiques de faible fréquence dans divers types d'échantillons. Cette méthodologie peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du dépistage des mutations somatiques en facilitant la détection de mutations de très faible fréquence. Ici, nous rechercherons des mutations dans le gène myd88 dans des échantillons de moelle osseuse.Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit des informations hautement précises et sensibles sur la présence de mutations somatiques, même avec très peu de cellules néoplasiques. Ce test de séquençage basé sur une PCR avec blocage du type sauvage a été mis au point pour amplifier une partie de l'exon cinq du gène myd88, assurant ainsi la couverture du site chaud L265. Les amorces directe et inverse ont été conçues avec une séquence M13 en extrémité 5' afin de permettre l'utilisation d'amorces de séquençage complémentaires. Concevez l'oligonucléotide bloquant de manière à ce qu'il mesure environ 10 à 15 bases de longueur et soit complémentaire au brin sauvage là où un enrichissement du mutant est souhaité. Un oligonucléotide plus court améliorera la discrimination des appariements incorrects. Pour obtenir une grande spécificité du cible, il est important de ne pas utiliser une trop grande quantité de nucléotides bloquants, car cela entraînerait des oligonucléotides très adhésifs.Pour concevoir l'oligonucléotide bloquant, commencez par accéder au site Web Oligo Tools. Sélectionnez l'outil de prédiction du TM des oligonucléotides. Une nouvelle fenêtre s'ouvrira.Collez la séquence du modèle de type sauvage à bloquer dans la case de séquence d'oligo. Ajoutez un signe plus devant les bases du bloqueur pour les marquer. Cliquez sur le bouton de calcul pour déterminer la température de fusion (TM) approximative de l'hybride d'ADN bloqueur.Les températures de fusion calculées apparaîtront dans les cases ci-dessous. Concevez l'oligo bloqueur de manière à ce que sa température de fusion soit supérieure de 10 à 15 degrés Celsius par rapport à la température d'extension pendant la thermocyclation. Ici, la température d'extension est de 72 degrés Celsius.Pour ajuster la température de fusion, ajoutez, retirez ou remplacez des bases bloquantes. Évitez les séquences longues de trois à quatre bases bloquantes C ou G. Ensuite, pour éviter la formation de structures secondaires ou la dimérisation par auto-appariement, revenez à l'écran d'accueil du site Web Oligo Tools et sélectionnez l'outil Oligo Optimizer.Une nouvelle fenêtre s'ouvrira. Collez la séquence du modèle de type sauvage à bloquer dans la case. Ajoutez un signe plus pour indiquer les bases à bloquer.Sélectionnez les deux cases pour la structure secondaire et « self » uniquement, puis appuyez sur le bouton analyser pour afficher les scores d'hybridation et de structure secondaire. Ces scores représentent des estimations très approximatives des températures de fusion des dimères « self » et des structures secondaires, respectivement. Des scores plus faibles sont optimaux et peuvent être obtenus en limitant l'appariement des bloqueurs.Supprimez ou repositionnez les nucléotides bloquants afin d'obtenir des scores plus faibles. L'oligonucléotide bloquant optimisé pour myd88 illustré ici établit un compromis entre la température de fusion de l'hybride de blocage d'ADN et des scores d'hybridation et de structure secondaire suffisamment bas. Il a été conçu pour couvrir les acides aminés Q262 à I266, et comporte un DT inversé en trois prime pour inhiber à la fois l'élongation par l'ADN polymérase et la dégradation par l'exonucléase trois prime.Une fois les amorces conçues, préparez la PCR de blocage du type sauvage et effectuez le thermocyclage comme décrit dans le document accompagnant. Retirez les billes magnétiques du stockage à quatre degrés Celsius et laissez-les atteindre la température ambiante. Transférez 10 microlitres du produit de PCR dans une nouvelle plaque PCR.Vortexez vigoureusement les billes magnétiques pour redisperser complètement les particules magnétiques, puis ajoutez 18 microlitres de billes magnétiques dans chaque puits de la nouvelle plaque. Pipetez vers le haut et vers le bas 10 fois pour homogénéiser. Incubez ensuite la plaque à température ambiante pendant cinq minutes.Après l'incubation, placez la plaque PCR sur la plaque magnétique à rebord latéral pendant deux minutes afin de séparer les billes de la solution. Utilisez une pipette multipuits pour aspirer le surnageant. Veillez à éviter le culot de billes.Ensuite, distribuez 150 microlitres d'éthanol à 70 % dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant au moins 30 secondes. Puis aspirez l'éthanol à l'aide d'une pipette multicanal et jetez les pointes. Répétez cette étape de lavage une fois supplémentaire.À l’aide d’une pipette multipuits de 20 microlitres, aspirez l’éthanol restant de chaque puits et jetez les pointes. Après avoir laissé sécher les puits de la plaque pendant environ 10 minutes, retirez-la de l’aimant et ajoutez 40 microlitres d’eau sans nucléase dans chaque puits. Pipetez 15 fois de haut en bas pour homogénéiser.Incuber ensuite à température ambiante pendant deux minutes. Après l'incubation, replacer la plaque PCR sur la plaque aimantée pendant une minute afin de séparer les billes de la solution. Transférer 35 microlitres du produit purifié dans une nouvelle plaque PCR et effectuer le séquençage bidirectionnel comme décrit dans le document accompagnant.Une fois le séquençage bidirectionnel effectué, purifiez les produits de séquençage en préparant une solution fraîche dans 25 % d'acétate de sodium trois molaire à pH 5,2 et d'éthanol à 100 %. Préparez également une solution fraîche d'éthanol à 70 %. Ajoutez à chaque puits des plaques de séquençage direct et inverse 30 microlitres d'acétate de sodium dans de l'éthanol à 100 %, puis pipetez cinq fois vers le haut et vers le bas pour homogénéiser.Ensuite, refermez la plaque et incubez-la à l'obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. Une fois les 20 minutes écoulées, centrifugez la plaque à 2 250 × g pendant 15 minutes. Après la centrifugation, retirez le scellant de la plaque et retournez-la une fois au-dessus d'un récipient de déchets.Si la plaque est retournée plusieurs fois, les culots peuvent se détacher des fonds des puits. Placer la plaque retournée sur une serviette en papier propre et centrifuger à 150 ×g pendant une minute. Ensuite, ajouter 150 µL d'éthanol à 70 % dans chaque puit et refermer hermétiquement la plaque.Faire centrifuger à 2 250 ×g pendant cinq minutes. Répéter ensuite le processus de retrait du scellant de plaque et de retournement de la plaque. Si les puits ne sont pas complètement secs, les laisser sécher à l'air à température ambiante.Veillez à ce que les échantillons soient protégés de la lumière. Une fois que les puits sont complètement secs, ajoutez 10 microlitres de formamide dans chaque puits et pipetez de haut en bas 10 fois pour mélanger. Refermez hermétiquement la plaque.Dénaturez à l’aide d’un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant trois minutes, puis à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après la dénaturation, remplacez le scellant de plaque par un septum et effectuez le séquençage sur une plateforme de séquençage selon les instructions du fabricant. À l’aide d’un logiciel d’analyse de séquence, visualisez les tracés et alignez les séquences sur les séquences de référence appropriées.Alignez myd88 avec la séquence de référence NCBI NM002468. L'ADN génomique de patients porteurs ou non de mutations a subi une PCR conventionnelle et une PCR de blocage de type sauvage, puis les produits de PCR obtenus ont été séquencés. Comme on peut le voir ici, l'allèle muté a été enrichi lors de la PCR de blocage du type sauvage, et aucun faux positif n'a été observé sur l'ADN de type sauvage.Une diminution caractéristique de l'intensité du signal, comme celle illustrée ici, est souvent observée lorsque l'on utilise une concentration trop élevée de bloqueur, ou lorsque la purification post-PCR n'a pas permis d'éliminer le bloqueur avant le séquençage bidirectionnel. Ceci se produit lorsque la purification enzymatique est effectuée à la place de la purification par billes magnétiques. Tout test basé sur la PCR qui enrichit les allèles mutants détectera des artefacts de faible fréquence.Ces traces montrent une augmentation des artefacts de séquençage CG par rapport aux artefacts TA dans les tissus FFPE lorsque la cytosine ou la cytosine méthylée sont désaminées par fixation formale en uracile ou en thymine, respectivement. L'uracile ADN glycosylase, ou UDG, peut exciser l'uracile avant la PCR d'achèvement avec enzyme sauvage, contribuant ainsi à réduire les artefacts de séquençage. Toutefois, la thymine résultant de la désamination de la 5-méthylcytosine, qui se produit fréquemment au niveau des îlots CPG, ne peut pas être excisée par l'UDG.La réduction de la concentration du bloqueur utilisée dans la PCR de blocage du type sauvage peut aider à diminuer l'apparition d'artéfacts de séquençage qui ne sont pas corrigés par le traitement UDG. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de détecter des mutations somatiques avec un haut degré de précision et de sensibilité, en utilisant la technique de blocage du type sauvage. Le principe de cette technologie peut être appliqué à la détection de mutations dans de petites sous-populations cellulaires.Il est donc utile pour la détection de la maladie résiduelle minimale, la surveillance des patients et la prédiction d'une rechute précoce chez les patients atteints de divers néoplasmes.

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Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations (Vidéo) | JoVE Journal

Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations

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