Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations

L’objectif global de cette procédure est de détecter des mutations somatiques de basse fréquence dans une variété de types d’échantillons. Cette méthodologie peut aider à répondre à des questions clés dans les tests de mutations somatiques en facilitant la détection de mutations à très basse fréquence. Ici, nous rechercherons des mutations dans le gène myd88 dans des échantillons de moelle osseuse.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des informations très précises et sensibles sur la présence de mutations somatiques, même avec très peu de cellules néoplasiques. Ce test de séquençage basé sur la PCR bloquante de type sauvage a été développé pour amplifier une partie de l’exon cinq du gène myd88, assurant ainsi la couverture du point chaud L265. Les amorces avant et arrière ont été conçues avec une séquence M13 à cinq amorces pour permettre un agenouillement des amorces de séquençage complémentaires.

Concevoir l’oligonucléotide bloquant de manière à ce qu’il ait une longueur d’environ 10 à 15 bases et qu’il soit complémentaire à la matrice de type sauvage où l’enrichissement en mutant est souhaité. Un oligo plus court améliorera la discrimination des inadéquations. Pour obtenir une spécificité de cible élevée, il est important de ne pas utiliser trop de nucléotides bloquants, car cela entraînerait des oligonucléotides très collants.

Pour concevoir l’oligonucléotide bloquant, commencez par vous rendre sur le site Web d’Oligo Tools. Sélectionnez l’outil de prédiction Oligo TM. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.

Collez la séquence du modèle de type wild à bloquer dans la boîte de séquence oligo. Ajoutez un signe plus devant les bases des bloqueurs pour les marquer. Cliquez sur le bouton calculer pour déterminer la TM approximative de l’hybride bloqueur d’ADN.

Les températures de fonte calculées apparaîtront dans les cases ci-dessous. Concevez l’oligo bloquant pour qu’il ait une température de fusion de 10 à 15 degrés Celsius au-dessus de la température d’extension pendant le thermocyclage. Ici, la température d’extension est de 72 degrés Celsius.

Pour régler la température de fusion, ajoutez, retirez ou remplacez les bases de blocage. Évitez les longues périodes de trois à quatre bases C ou G bloquantes. Ensuite, pour éviter la formation d’une structure secondaire ou l’auto-dimérisation, retournez à l’écran d’accueil du site Web d’Oligo Tools et sélectionnez l’outil Oligo Optimizer.

Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Collez la séquence du modèle de type wild à bloquer dans la boîte. Ajoutez un signe plus pour indiquer les bases bloquantes.

Sélectionnez les deux cases pour la structure secondaire et l’auto-ingénierie uniquement et appuyez sur le bouton d’analyse pour voir les scores pour l’hybridation et la structure secondaire. Ces scores représentent des estimations très approximatives des températures de fusion des autodimères et des structures secondaires, respectivement. Des scores plus bas sont optimaux et peuvent être obtenus en limitant l’appariement des bloqueurs.

Retirez ou repositionnez les nucléotides bloquants afin d’obtenir des scores plus bas. L’oligonucléotide bloquant optimisé pour myd88 montré ici établit un équilibre entre la température de fusion de l’hybride bloqueur d’ADN et des scores d’hybridation et de structure secondaire suffisamment faibles. Il a été conçu pour couvrir les acides aminés Q262 à I266, et comporte un DT inversé à trois premiers pour inhiber à la fois l’extension par l’ADN polymérase et la dégradation par l’exonucléase à trois primes.

Une fois que les amorces ont été conçues, mettez en place la PCR bloquante de type sauvage et effectuez le thermocyclage comme décrit dans le document d’accompagnement. Retirez les billes magnétiques de l’entreposage à quatre degrés Celsius et amenez-les à température ambiante. Transférez 10 microlitres du produit PCR sur une nouvelle plaque PCR.

Faites tourbillonner vigoureusement les billes magnétiques pour remettre complètement les particules magnétiques en suspension, puis ajoutez 18 microlitres de billes magnétiques à chaque puits de la nouvelle plaque. Pipette de haut en bas 10 fois pour mélanger. Ensuite, incubez la plaque à température ambiante pendant cinq minutes.

Après l’incubation, placez la plaque PCR sur la plaque magnétique à jupe latérale pendant deux minutes pour séparer les billes de la solution. Utilisez une pipette multicanaux pour aspirer le surnageant. Prenez soin d’éviter la pastille de perle.

Ensuite, versez 150 microlitres d’éthanol à 70 % dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant au moins 30 secondes. Aspirez ensuite l’éthanol à l’aide d’une pipette multicanaux et jetez les pointes. Répétez cette procédure de lavage une fois de plus.

À l’aide d’une pipette multicanaux de 20 microlitres, aspirez l’éthanol restant de chaque puits et jetez les pointes. Après avoir laissé environ 10 minutes pour que les puits de la plaque sèchent, retirez-le de l’aimant et ajoutez 40 microlitres d’eau sans nucléases dans chaque puits. Pipeter de haut en bas 15 fois pour mélanger.

Ensuite, incubez à température ambiante pendant deux minutes. Après l’incubation, replacez la plaque PCR sur la plaque magnétique pendant une minute pour séparer les billes de la solution. Transférez 35 microlitres de produit purifié dans une nouvelle plaque PCR et effectuez un séquençage bidirectionnel comme décrit dans le document d’accompagnement.

Une fois qu’un séquençage bidirectionnel a été effectué pour purifier les produits de séquençage, préparez une solution fraîche une dans une solution de 25 d’acétate de sodium à trois molaires à PH 5,2 et d’éthanol à 100 %. Préparez également une solution fraîche à 70 % d’éthanol. À chaque puits des plaques de séquençage avant et arrière, ajoutez 30 microlitres d’acétate de sodium dans de l’éthanol à 100 % et pipetez de haut en bas cinq fois pour mélanger.

Refermez ensuite la plaque et incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. Après 20 minutes, centrifugez la plaque à 2, 250 fois G pendant 15 minutes. Après l’essorage, retirez le scellant de plaque et retournez la plaque une fois au-dessus d’un conteneur à déchets.

Si la plaque est inversée plusieurs fois, les granulés peuvent se détacher du fond du puits. Placez l’assiette inversée sur une serviette en papier propre et centrifugez-la à 150 fois G pendant une minute. Ensuite, ajoutez 150 microlitres d’éthanol à 70 % dans chaque puits et refermez la plaque.

Faites tourner à 2, 250 fois G pendant cinq minutes. Répétez ensuite le processus de retrait de la scelleuse de plaques et d’inversion de la plaque. Si les puits ne sont pas complètement secs, laissez-les sécher à l’air libre à température ambiante.

Assurez-vous que les échantillons sont protégés de la lumière. Une fois que les puits sont complètement secs, ajoutez 10 microlitres de formamide dans chaque puits et pipetez de haut en bas 10 fois pour mélanger. Refermez la plaque.

Dénaturer à l’aide d’un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant trois minutes, puis à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après la dénaturation, remplacez la scelleuse de plaques par un septa et séquençez sur une plate-forme de séquençage selon les instructions du fabricant. À l’aide d’un logiciel d’analyse séquentielle, visualisez les traces et alignez les séquences sur les séquences de référence appropriées.

Alignez myd88 sur la séquence de référence NCBI NM002468. L’ADN génomique de patients avec et sans mutations a fait l’objet d’une PCR de blocage conventionnelle et de type sauvage, et les produits de PCR résultants ont ensuite été séquencés. Comme on peut le voir ici, l’allèle mutant a été enrichi lorsque la PCR bloquant le type sauvage a été effectuée, et les faux positifs n’ont pas été observés dans l’ADN de type sauvage.

Une baisse caractéristique de l’intensité du signal, comme illustré ici, est souvent observée si une concentration trop élevée de bloqueur est utilisée, ou si la purification post-PCR n’a pas réussi à éliminer le bloqueur avant le séquençage bidirectionnel. Cela se produit lorsque la purification enzymatique est effectuée à la place de la purification par billes magnétiques. Tout test basé sur la PCR qui enrichit en allèles mutants détectera des artefacts à basse fréquence.

Ces traces montrent une augmentation des artefacts de séquençage CG, par rapport aux artefacts TA dans les tissus FFPE lorsque la cytosine ou la cytosine méthylée sont désaminées par infixation formelle à l’uracile ou à la thiamine respectivement. L’ADN glycosylase uracile ou UDG peut exciser l’uracile avant la PCR bloquante de type sauvage, ce qui contribue à réduire les artefacts de séquençage. Cependant, la thiamine résultant de la désamination de la cinq méthyl cytosine qui se produit fréquemment sur les îlots CPG ne peut pas être excisée par l’UDG.

La diminution de la concentration de bloqueur utilisée dans la PCR bloquante de type sauvage peut aider à réduire l’apparition d’artefacts de séquençage qui ne sont pas corrigés par le traitement UDG. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester les mutations somatiques avec un haut degré de précision et de sensibilité, en utilisant la technique de blocage de type sauvage. Le principe de cette technologie peut être appliqué à la détection de mutations dans de petites sous-populations de cellules.

Par conséquent, il est utile pour détecter une maladie résiduelle minimale, surveiller les patients et prédire la rechute précoce chez les patients atteints de divers néoplasmes.