PCR imbriquée pour détecter une séquence génomique virale spécifique

La réaction en chaîne par polymérase imbriquée, la PCR imbriquée, peut amplifier sélectivement des séquences génétiques spécifiques.

Pour détecter une séquence virale cible, commencez par un mélange maître contenant des amorces externes complémentaires à une région d’ADN plus grande contenant la séquence virale ciblée, des dNTP et de l’ADN polymérase thermostable dans un tampon approprié.

Ajoutez de l’ADN viral double brin, extrait des cellules infectées par le virus, à ce mélange. Transférez le tube dans un thermocycleur ; exécuter le premier cycle de PCR.

Lors de la dénaturation, l’ADN double brin produit deux matrices simple brin. À une température de recuit appropriée, les amorces externes se lient à leurs séquences cibles correspondantes. Plus tard, l’ADN polymérase étend les amorces à l’aide de dNTP, produisant de grands amplicons, contenant la séquence spécifique dans l’ADN amplifié.

Transférez ces amplicons dans un nouveau tube. Complétez avec un mélange maître frais contenant des amorces internes ou imbriquées ciblant une séquence plus petite et plus spécifique dans l’ADN amplifié plus grand. Exécutez la deuxième PCR.

Au cours de la deuxième PCR, le brin d’ADN se dénature. Après la dénaturation, les amorces imbriquées se lient aux sites cibles sur la matrice simple brin, suivie d’une extension d’amorce médiée par la polymérase.

Répétez plusieurs fois le deuxième cycle de PCR pour amplifier exclusivement la séquence virale ciblée.

Analysez le produit de PCR pour visualiser les amplicons plus petits, confirmant la présence de la séquence virale spécifique.

Récupérez les réactifs nécessaires et conservez-les sur de la glace dans une salle blanche jusqu’au moment de l’utiliser. Lorsque vous êtes prêt, décongelez et agitez les réactifs. Ensuite, préparez 48 microlitres de mélange PCR de premier tour pour chaque échantillon dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre, comme indiqué dans le tableau 2 du protocole de texte, et divisez le mélange de réaction en tubes PCR de 0,2 millilitre.

Dans un poste de PCR situé dans une salle de modèles, ajoutez un échantillon de 2 microlitres d’ADNc dans le mélange de PCR de premier tour. Inclure deux microlitres d’ADNc CVS-11 comme contrôle positif et deux microlitres d’eau doublement distillée comme contrôle négatif. Ensuite, transférez les tubes scellés dans un thermocycleur PCR et effectuez un cycle en utilisant les paramètres énumérés dans le tableau 3 du protocole texte.

Pour commencer, préparez 48 microlitres de mélange PCR de deuxième tour pour chaque échantillon dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre, comme indiqué dans le tableau 4 du protocole textuel, et divisez le mélange réactionnel en tubes PCR de 0,2 millilitre. Ajoutez deux microlitres du produit PCR de premier tour dans le mélange PCR de deuxième tour. Incluez de l’eau doublement distillée comme contrôle négatif pour ce cycle de PCR. Ensuite, effectuez un cycle thermique PCR en utilisant les paramètres énumérés dans le tableau 3 du protocole texte.